本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及厚藤(ipomoeapes-caprael.)中的ipasr(abscisicacid-,stress-,andripening-inducedgene)基因及其編碼蛋白和在調(diào)控生物體耐鹽耐旱方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

asr蛋白全稱為脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白(abscisicacid-,stress-,andripening-inducedproteins，asr蛋白)，是植物中特有的一類親水蛋白家族，通常具有轉(zhuǎn)錄因子的活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)它們在植物生長發(fā)育、成熟衰老以及非生物脅迫過程中起著重要的作用。asr蛋白也是植物lea蛋白(late-embryogenesisabundantproteins，胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白)的一個亞家族，目前在番茄、水稻、玉米、香蕉、松樹、葡萄、馬鈴薯、百合等高等植物中都已克隆到該基因，并且發(fā)現(xiàn)不同物種的asr基因家族數(shù)目不盡相同，但在擬南芥中并不存在該類基因。已有的研究表明，asr基因的表達(dá)受冷、滲透壓、脫落酸處理等的誘導(dǎo)，在果實成熟過程中也被誘導(dǎo)表達(dá)。由于對不同植物種類的多個asr基因成員的研究表明，asr基因在有些植物應(yīng)答高鹽、干旱、冷凍等非生物逆境脅迫，而該類脅迫均與植物的失水密切相關(guān)，突出顯示了asr基因?qū)κ嚓P(guān)的非生物脅迫的抗性。

植物在其生長周期中，通常會受到多種逆境脅迫的干擾，并對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。而對農(nóng)作物而言，逆境脅迫的擾動通常會影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，采用多種育種手段提高農(nóng)作物的抗逆性是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)面臨的重要問題。作物轉(zhuǎn)基因功能育種為抗逆育種提供了一種行之有效的便捷手段，但該技術(shù)需要提供具有抗逆生物學(xué)功能的候選操作基因，而分離和鑒定該類功能基因已成為植物基因工程的研究焦點之一。野生植物是重要的自然資源和環(huán)境要素，而在自然選擇的壓力下，極端逆境下的適生植物必然具有較強的抗逆遺傳資源，其抗逆功能基因的挖掘和鑒定也是野生植物資源保護(hù)和開發(fā)利用的一個重要方面。厚藤(ipomoeapes-caprael.)是一種泛熱帶亞熱帶分布型濱海植物，具有極強的抗逆性，而其耐鹽性和抗旱性尤為顯著。目前關(guān)于厚藤asr基因資源的開發(fā)利用方面還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽、耐旱植物功能性蛋白——厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr及其應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一個代表脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr的克隆能夠提高酵母菌株的耐鹽性，本發(fā)明克隆了該脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr，通過功能研究表明，該基因可提高生物體的耐鹽和抗旱能力。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr和/或ipasr基因在提高植物對高鹽/干旱的耐受中的應(yīng)用，所述ipasr基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列，或為與seqidno.2互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的核苷酸序列。

本發(fā)明的厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr，其氨基酸序列如seqidno.1所示，其編碼基因ipasr的核苷酸序列如seqidno.2所示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr和/或ipasr基因在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種中改良農(nóng)作物對高鹽/干旱耐受性、和/或調(diào)控農(nóng)作物對氧化脅迫耐受性的應(yīng)用，所述厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列，或為與seqidno.2互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一目的是公開一組厚藤ipasr蛋白重組表達(dá)載體及其應(yīng)用，該重組載體插入了ipasr基因。將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，通過半乳糖誘導(dǎo)該基因在酵母中的超表達(dá)，能夠在高鹽和過氧化氫脅迫處理下，提高酵母對鹽脅迫和氧化脅迫的耐受性。

同時，公開構(gòu)建厚藤ipasr蛋白重組原核表達(dá)載體及其運用，該重組載體插入了ipasr基因，將該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21菌株中，通過iptg誘導(dǎo)該基因在大腸桿菌中的超表達(dá)，證明ipasr基因能夠提高工程菌大腸桿菌的耐鹽和耐旱性。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

插入有ipasr基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體，所述ipasr基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列，或為與seqidno.2互補配對的核苷酸序列，或編碼為氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤ipasr蛋白的核苷酸序列。

上述釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對高鹽和氧化脅迫的耐受性中的應(yīng)用。

插入有ipasr基因的大腸桿菌表達(dá)載體，所述ipasr基因的cdna為如seqidno.2所示的核苷酸序列，或為與seqidno.2互補配對的核苷酸序列，或為編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤ipasr蛋白的核苷酸序列。

上述大腸桿菌重組表達(dá)載體在提高工程菌大腸桿菌對高鹽和干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明的另一目的是公開了厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr在模式植物擬南芥中的超表達(dá)載體及其應(yīng)用，該重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法對擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，能夠提高擬南芥的耐鹽和抗旱性。

具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明以厚藤幼苗為材料，提取rna，并將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并將cdna分別以pdonr222和pyes-dest52為目標(biāo)載體，采用技術(shù)(invitrogen)構(gòu)建cdna表達(dá)文庫，并將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母對鹽敏感的突變株axt3，挑取耐鹽酵母克隆，并提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行測序，通過序列分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，獲得厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr的cdna全長，其序列如seqidno.2所示。

將含有ipasr的cdna全長的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型酵母菌株w303，以轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體pyes2空載體的w303為對照，分別在含鹽量5％，7.5％和8.8％的培養(yǎng)基上測試轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性。

以含有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計以下引物分別擴增ipasr基因的cdna全長閱讀框序列，用于獲取插入至大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pgex6p-1的cdna閱讀框片段。引物如seqidno.3(ipasreef:5’-ggggcccctgggatccatgtctgagatgaaacacca-3’)和seqidno.4(ipasreer:5’-ggaattccggggatccttaaaagaagtgatgcttct-3’)所示。

以上pcr采用高保真的taq酶進(jìn)行擴增，并將得到的目的dna片段進(jìn)行回收，連接于大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pgex6p-1上(bamhi切點)，形成重組載體ipasr-pgex6p-1，并測序。

采用cacl2的方法將上述厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白大腸桿菌蛋白表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21感受態(tài)菌株中，通過添加0.2mm的iptg誘導(dǎo)ipasr基因在大腸桿菌中的超表達(dá)。之后檢測表達(dá)有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的大腸桿菌的耐鹽性和抗旱性。

以含有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計以下引物分別擴增ipasr基因的cdna全長閱讀框序列，用于獲取插入至擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體pmd1的cdna閱讀框片段，用于構(gòu)建厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因轉(zhuǎn)基因超表達(dá)重組載體ipasr-pmd1。引物如seqidno.5(ipasroxf:5’-ggactctagaggatccatgtctgagatgaaacacca-3’)和seqidno.6(ipasroxr:5’-gtcgacccggggatcttaaaagaagtgatgcttc-3’)所示。

采用cacl2的方法將上述厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)基因超表達(dá)重組載體ipasr-pmd1轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)菌株中，通過擬南芥花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥植株，通過kan抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因后代，對轉(zhuǎn)基因超表達(dá)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因的擬南芥后代進(jìn)行耐鹽性和抗旱性檢測。

在本發(fā)明中，我們公開了厚藤體內(nèi)的一個編碼脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的基因ipasr，該基因的表達(dá)能夠提高酵母菌對鹽和氧化脅迫的耐受性，提供了將該基因應(yīng)用于工程菌釀酒酵母的耐鹽和抗氧化遺傳改良的應(yīng)用；ipasr在大腸桿菌中的表達(dá)能夠提高工程菌大腸桿菌對高鹽和干旱的耐受性，提供了將該基因用于包括大腸桿菌在內(nèi)的工程菌耐鹽和耐脫水的遺傳改良方面的應(yīng)用。本發(fā)明也簡單闡述了可將該基因應(yīng)用于植物的遺傳改造，培育用于提高耐鹽/耐旱性的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的有益效果如下：

在本發(fā)明中，我們通過篩選獲得的厚藤編碼脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的ipasr基因的進(jìn)行應(yīng)用性探索，發(fā)現(xiàn)該基因以下應(yīng)用方式：(1)該基因在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠提高酵母對高鹽和氧化脅迫的耐受性；(2)通過誘導(dǎo)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后，能夠提高大腸桿菌的耐鹽性和耐旱性；(3)該基因在擬南芥中的超量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽和干旱脅迫的耐受性。

本發(fā)明也可推廣至農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，通過改變ipasr基因在農(nóng)作物中的表達(dá)，調(diào)控農(nóng)作物對高鹽和干旱脅迫的耐受，以及參與農(nóng)作物對多種逆境脅迫的適應(yīng)性改變。

附圖說明

圖1示釀酒酵母重組表達(dá)載體ipasr-pyes-dest52示意圖。

圖2示轉(zhuǎn)化ipasr-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因酵母對鹽敏感的突變株axt3對鹽脅迫的耐受性提高。

圖3示轉(zhuǎn)化ipasr-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因野生型酵母w303對鹽脅迫的耐受性提高。

圖4示轉(zhuǎn)化ipasr-pyes-dest52的轉(zhuǎn)基因酵母對h2o2敏感的突變株yap1δ(a)和skn7δ(b)對氧化脅迫的耐受性提高。

圖5示大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1示意圖。

圖6示轉(zhuǎn)化ipasr-pgex6p-1的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌對高鹽脅迫(a)和脫水脅迫(b)的耐受性提高。

圖7示模式植物擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體ipasr-pmd1示意圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。

實施例1：通過厚藤cdna酵母表達(dá)文庫篩選獲得厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr的cdna全長

1.1厚藤全長cdna表達(dá)文庫的構(gòu)建

厚藤cdna文庫的構(gòu)建主要參考clonemineriicdnalibraryconstructionkit的說明書，采用(invitrogen)技術(shù)進(jìn)行。具體包括以下步驟：總rna提取、mrna的分離、cdna初級文庫的構(gòu)建和cdna次級文庫的構(gòu)建。各步驟主要概述如下：

(1)總rna提取

取2g等量的厚藤葉片、葉芽、藤及幼根，在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成粉末，將粉末適量移至多個rnase-free的1.5ml離心管中，每個離心管加入1mltrizolreagent，迅速震蕩混勻，并按照試劑說明書操作，獲得厚藤不同組織的總rna混合樣。將干燥后的總rna溶于100μlrnase-free的水中。用紫外分光光度計和1％的瓊脂糖凝膠電泳測定總rna的濃度和質(zhì)量。

(2)mrna的分離

取大于500μg的厚藤總rna，按照fasttrackmagmrnaisolationkit說明書分離純化mrna，用紫外分光光度法測定mrna濃度，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測mrna的質(zhì)量。

(3)cdna初級文庫的構(gòu)建

取約3μg的厚藤mrna，加入rnase-free的水至總體積為9μl；然后加入biotin-attb2-oligo(dt)primer(30pm)1ul和dntps(10mmeach)1ul混勻，70℃5min，45℃孵育2min；加入superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr的5×firststrandbuffer4μl和dtt(0.1m)2μl，最后加入3μl的superscriptiii逆轉(zhuǎn)錄酶至中反應(yīng)體積為20μl，混勻后置于pcr儀上反應(yīng)45℃20min；50℃20min；55℃20min。以上步驟為合成cdna第一鏈。

在cdna第一鏈反應(yīng)液中依次加入e.colidnaligase，e.colidnapolymerasei，e.colirnaseh和t4dnapolymerase等合成第二鏈，此時即獲得厚藤雙鏈cdna。將雙鏈cdna純化后與attb1重組接頭連接，連接好接頭的厚藤雙鏈cdna使用clonemineriicdnalibraryconstructionkit的分級分離層析柱，去除分子量小于500bp的小片段cdna，保留大于500bp的cdna片段用于后續(xù)的cdna文庫的構(gòu)建。

參照clonemineriicdnalibraryconstructionkit的說明書進(jìn)行bp重組反應(yīng)構(gòu)建cdna初級文庫。具體步驟包括：在潔凈的pcr管中依次添加cdna(100ng/μl)13μl，pdonr222(250ng/μl)2μl，bpiienzymemix5μl至總體積20μl，混合均勻后，置于25℃下進(jìn)行bp重組反應(yīng)16～20h。通過電穿孔儀將純化后的bp重組反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌dh10b感受態(tài)細(xì)胞中，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入2mlsoc培養(yǎng)基，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，即為初級文庫菌液。

(4)cdna次級文庫的構(gòu)建

采用lr重組反應(yīng)進(jìn)行cdna次級文庫的構(gòu)建，具體步驟包括：初級文庫用lb培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)后，然后用purelink^tmhqminiplasmiddnapurificationkit提取質(zhì)粒。初級cdna文庫質(zhì)粒使用適量的te溶解，并采用紫外分光光度法測定濃度。將初級文庫質(zhì)粒濃度調(diào)整至300ng/μl，取1μl文庫質(zhì)粒依次加入pyes-dest52(300ng/ul)1μl，lrclonaseiimix1μl，補加雙蒸水12μl至總體積20μl。置于25℃下進(jìn)行l(wèi)r重組反應(yīng)16～20h。之后使用電穿孔儀將純化后的lr重組反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌dh10b感受態(tài)細(xì)胞中，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入2mlsoc培養(yǎng)基，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，即為次級文庫菌液。

1.2厚藤cdna文庫的篩選

厚藤cdna文庫的篩選采用質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感的突變株axt3的方法。axt3在含有75mm的nacl的培養(yǎng)基上無法生長，而野生型酵母則可以正常生長。axt3經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母質(zhì)粒文庫后，涂布于含有75mm的nacl的培養(yǎng)基上，經(jīng)30℃培養(yǎng)3至7天，可得到若干個可以恢復(fù)對鹽敏感的酵母克隆。對這些克隆擴增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即可獲得多個厚藤耐鹽基因，其中一個為編碼厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的cdna全長序列。詳細(xì)步驟如下：

(1)厚藤cdna文庫質(zhì)粒的獲取

文庫質(zhì)粒的獲取采用固體lb培養(yǎng)基平板擴增法，即根據(jù)文庫的總克隆數(shù)，將厚藤次級文庫菌液涂布于100個含有amp抗生素14cm的lb平板上過夜37℃培養(yǎng)，確保文庫的每個克隆都得到了等量的擴增。待長出菌落后，加液體lb培養(yǎng)基洗脫，堿裂解法提取質(zhì)粒。(2)厚藤cdna文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感的突變株axt3

調(diào)整純化后的次級文庫質(zhì)粒濃度至1μg/μl，采用乙酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母對鹽敏感的突變株axt3。挑取酵母單克隆接種于液體ypd培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜。之后按照1:100的比例將酵母菌液轉(zhuǎn)接于新鮮的液體ypd培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)至od600為0.5左右，鋰鹽溶液重懸，加適量鮭魚精載體dna，50％peg。根據(jù)沉淀量稀釋菌體，涂布于含有75mm的nacl的酵母篩選培養(yǎng)基(酵母極限培養(yǎng)基添加腺嘌呤，缺少尿嘧啶)上培養(yǎng)，直至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。

1.3厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因ipasr的cdna全長的獲得及序列分析

在含有75mm的nacl的酵母篩選培養(yǎng)基上挑取酵母單克隆，接菌于未添加nacl的液體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行擴增培養(yǎng)。離心收集酵母菌體后，按照hipureyeastplasmidminikit的說明書提取酵母質(zhì)粒。由于酵母質(zhì)粒含量較低，無法直接進(jìn)行測序分析，故將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆擴增培養(yǎng)后，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序分析。測序由廣州艾基生物公司完成。

測序后的cdna核苷酸序列比較、翻譯等在dnastar7.0生物軟件上進(jìn)行，序列同源性分析采用blast程序，在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)網(wǎng)站上進(jìn)行。

測序結(jié)果表明，其中一個克隆含有編碼厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的cdna全長，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。去掉pyes-dest52載體序列后，厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白的cdna全長序列如下，閱讀框為如seqidno.2所示的核苷酸序列，其最長閱讀框為編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的厚藤ipasr蛋白。

seqidno.1

氨基酸序列

>ipasrprotein

msemkhhhhfghhkdneeerqsscgentygtdekpygqtgygeesyerkntygddsyerkntygddsscerkntygddssyerkntygddsyyerkntygddsygqidkygsegvtggiepegkthedyekekkhhkhleqlgglgtvaagayalyekheakkdpenahkhkiaeevaavaavgsgafafhehhekkeakeeeeeaegkkkhhff

cdna序列(涂陰影部分為cdna閱讀框seqidno.2，上游為5’非翻譯區(qū)，下游為3’非翻譯區(qū))

>ipasr

aacatattttagcttagcattcatatttcgtccactaccagaaaccatcccaaaaaactaaaataatcatgtctgagatgaaacaccaccaccactttggtcaccacaaagacaatgaggaagagaggcagtcttcctgtggtgaaaacacttatggcactgatgagaaaccttatggccaaacaggctatggggaagagtcttatgagaggaaaaacacctatggtgatgactcttatgagaggaaaaacacctatggagatgactcttcttgtgagaggaaaaacacctatggagatgactcttcttatgagaggaaaaacacttatggagatgactcttattatgagaggaaaaacacttatggagatgactcttacggccaaatcgacaagtatgggagtgaaggcgtgaccggcggcatagaaccggaagggaaaactcatgaggattacgaaaaggagaaaaaacaccacaagcatctcgagcagctcggcgggcttggcaccgtcgccgccggtgcctatgccttgtacgagaagcacgaggcaaagaaagacccagagaatgcgcacaagcataagatagcagaagaggtggcggcagtggctgccgttggatcaggtgcatttgcattccatgagcatcatgagaagaaggaagctaaggaggaagaagaagaggctgagggaaagaagaagcatcacttcttttaattacatactatatatgtgtttttattattaagatcaaactaaataatccgatccttagcttgtacgacgtgtgtgaataatgggtttgggcttatgcgtgttgaggtacgaggagggtttctttgtacctagctaagctacctatctactctatttgtgtcgactgagatgttttattattctctagtgtatgtggattgtaataatactaatactgatataaagtttattaaaaaaaaaaaaaaa。

實施例2：ipasr基因在酵母中超表達(dá)提高酵母的耐鹽性和對氧化脅迫的耐受性

2.1ipasr-pyes-dest52轉(zhuǎn)化酵母菌株

將測序結(jié)果得到驗證的ipasr-pyes-dest52重組質(zhì)粒調(diào)整濃度至0.1μg/μl，采用乙酸鋰法的方法分別轉(zhuǎn)化酵母對鹽敏感的突變株axt3和對應(yīng)的野生型酵母株系w303，以及轉(zhuǎn)化酵母對h2o2敏感的突變株yap1δ和skn7δ和對應(yīng)的野生型酵母株系wt。同時采用酵母表達(dá)載體空載體pyes2做對照，分別轉(zhuǎn)化上述酵母株系。

2.2ipasr基因在酵母鹽敏感突變株axt3和野生型菌株w303中表達(dá)均可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性

挑取酵母菌株axt3轉(zhuǎn)化空載體pyes2和ipasr基因超表達(dá)載體ipasr-pyes-dest52的單克隆，接種于2ml添加了半乳糖的酵母極限液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液od600值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級稀釋，分別吸取2μl逐級稀釋的菌液滴至添加有50mm，75mm和200mmnacl的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天，觀察酵母生長情況。

如圖2所示，超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的axt3酵母突變株而言，能夠在添加50mm和75mmnacl的培養(yǎng)基平板上生長，而在添加200mmnacl的培養(yǎng)基平板上也可以輕微生長；而未表達(dá)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則不能生長，表明ipasr基因在酵母中的表達(dá)能夠提高酵母鹽敏感突變株axt3對鹽脅迫的耐受性。

同時，挑取野生型酵母株系w303轉(zhuǎn)化空載體pyes2和ipasr基因超表達(dá)載體ipasr-pyes-dest52的單克隆，按照上述方法進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并逐級稀釋后滴至添加有5％，7.5％和8.8％(均為質(zhì)量體積比)nacl的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天，觀察酵母生長情況。

如圖3所示，超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的w303酵母突變株而言，能夠在添加5％和7.5％nacl的培養(yǎng)基平板上生長，且生長狀況良好，而在添加8.8％nacl的培養(yǎng)基平板上也可以輕微生長；而未表達(dá)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則不能生長，表明ipasr基因在酵母中的表達(dá)能夠提高野生型酵母株系w303對鹽脅迫的耐受性。

2.3ipasr基因在酵母對h2o2敏感突變株yap1δ和skn7δ中表達(dá)均可以提高轉(zhuǎn)基因酵母對氧化脅迫的耐受性

挑取酵母對h2o2敏感突變株yap1δ和skn7δ轉(zhuǎn)化空載體pyes2和ipasr基因超表達(dá)載體ipasr-pyes-dest52的單克隆，同時也挑取野生型酵母wt轉(zhuǎn)化空載體pyes2的單克隆作為對照，將上述克隆分別接種于2ml添加了半乳糖的酵母極限液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液od600值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級稀釋，分別吸取2μl逐級稀釋的菌液滴至添加有0.75mm的h2o2的酵母極限固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天，觀察酵母生長情況。

如圖4所示，超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pyes2的yap1δ酵母突變株而言，能夠在添加0.75mmh2o2的培養(yǎng)基平板上生長；而未表達(dá)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的酵母yap1δ(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則幾乎不能生長(圖4a)。同樣，超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因酵母skn7δ也能夠在添加0.75mmh2o2的培養(yǎng)基平板上生長；而未表達(dá)厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的酵母skn7δ(轉(zhuǎn)化空載體pyes2)則幾乎不能生長(圖4b)。這些結(jié)果表明ipasr基因在h2o2敏感酵母突變株yap1δ和skn7δ中的表達(dá)能夠提高酵母對氧化脅迫脅迫的耐受性。

實施例3：ipasr基因在大腸桿菌中超表達(dá)提高大腸桿菌的耐鹽性和耐脫水性

3.1大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1的構(gòu)建

以含有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板，以seqidno.3和seqidno.4為引物，采用高保真的taq酶通過pcr擴增ipasr基因的cdna閱讀框全長。采用的pcr體系參考takara公司primestarhsdnapolymerasewithgcbuffer說明書。擴增的dna片段依照magen公司hipuregelpurednakits說明書?；厥盏玫降钠斡糜诓迦胫链竽c桿菌重組蛋白表達(dá)載體pgex6p-1中。pgex6p-1質(zhì)粒經(jīng)bamhi單酶切處理，回收線性化質(zhì)粒。回收后的ipasr的cdna閱讀框pcr片段和線性化pgex6p-1質(zhì)粒經(jīng)nanodrop公司紫外分光光度計測定濃度，采用takara(clontech)公司的hdcloningkit進(jìn)行dna片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確的陽性克隆后，保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測序分析后，ipasr的cdna核苷酸序列如seqidno.2所示，所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如seqidno.1所示。構(gòu)建好的大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1如圖5所示。

3.2厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

采用堿裂解法提取ipasr-pgex6p-1重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21感受態(tài)菌株中，挑取單克隆至液體lb培養(yǎng)基中，通過添加0.2mm的iptg誘導(dǎo)ipasr基因在大腸桿菌中的超表達(dá)。

3.3表達(dá)有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的大腸桿菌的耐鹽性檢測

挑取轉(zhuǎn)化厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1的大腸桿菌單克隆，以轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌單克隆為對照，分別接種于液體lb培養(yǎng)基中(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)，在恒溫?fù)u床(37℃，200rpm)中培養(yǎng)12小時。之后按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體lb培養(yǎng)基(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)中，培養(yǎng)2到4小時至od600值達(dá)0.5，之后添加終濃度為0.2mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)2到4小時至od600值達(dá)1。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級稀釋，分別吸取2μl逐級稀釋的菌液滴至添加有1％nacl(對照，145mmnacl)和4％nacl(高鹽脅迫，680mmnacl)的lb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2mm的iptg和100μg/ml的氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)12至24小時，觀察大腸桿菌生長情況。

如圖6a所示，在添加低濃度nacl(lb培養(yǎng)基，1％nacl)的正常生長條件下，轉(zhuǎn)化空載體pgex6p-1和表達(dá)ipasr蛋白(轉(zhuǎn)化ipasr蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1)的大腸桿菌的生長狀況一致，但在高鹽濃度(lb培養(yǎng)基，4％nacl)的正常生長條件下，轉(zhuǎn)化表達(dá)ipasr蛋白載體(ipasr蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1)的大腸桿菌的生長狀況要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于僅轉(zhuǎn)化空載體pgex6p-1的大腸桿菌，表明厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr在大腸桿菌中能夠提高大腸桿菌的耐鹽性。

3.4表達(dá)有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr的大腸桿菌的耐脫水性檢測

挑取轉(zhuǎn)化厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白表達(dá)載體ipasr-pgex6p-1的大腸桿菌單克隆，以轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌單克隆為對照，分別接種于液體lb培養(yǎng)基中(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)，在恒溫?fù)u床(37℃，200rpm)中培養(yǎng)12小時。之后按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體lb培養(yǎng)基(添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素)中，培養(yǎng)2到4小時至od600值達(dá)0.5，之后添加終濃度為0.2mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)2到4小時至od600值達(dá)1。分別取1μl的菌液各六份，三份為對照，另外三份置于37℃干燥培養(yǎng)箱中干燥1小時至菌體完全干燥，之后再加入1ml的新鮮液體培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)0.5小時，涂布至lb培養(yǎng)基平板上，對照則直接涂布于lb培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12至24小時，觀察大腸桿菌的克隆數(shù)。

如圖6中的b所示，未經(jīng)脫水干燥處理的菌液，對照(轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體)和表達(dá)ipasr蛋白的大腸桿菌(轉(zhuǎn)化ipasr-pgex6p-1)1μl原始菌液形成的單克隆菌落(cfu)介于6x10⁶和7x10⁶之間，兩者并不具備顯著性差異。1μl原始菌液經(jīng)脫水干燥后，表達(dá)ipasr蛋白的大腸桿菌(轉(zhuǎn)化ipasr-pgex6p-1)形成的單克隆菌落數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于僅轉(zhuǎn)化pgex6p-1空載體的大腸桿菌，兩者有極顯著的差異，表明厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白ipasr在大腸桿菌中能夠提高大腸桿菌的耐脫水性(耐旱性)。

實施例4：ipasr基因在擬南芥中超表達(dá)提高擬南芥的耐鹽性和耐旱性

4.1擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體ipasr-pmd1的構(gòu)建

以含有厚藤脫落酸/脅迫/成熟誘導(dǎo)蛋白基因cdna的酵母表達(dá)載體pyes-dest52重組質(zhì)粒為模板，以seqidno.5和seqidno.6為引物，采用高保真的taq酶通過pcr擴增ipasr基因的cdna閱讀框全長。采用的pcr體系參考takara公司primestarhsdnapolymerasewithgcbuffer說明書。擴增的dna片段依照magen公司hipuregelpurednakits說明書?；厥盏玫降钠斡糜诓迦胫翑M南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體pmd1中。pmd1質(zhì)粒經(jīng)bamhi單酶切處理，回收線性化質(zhì)粒?；厥蘸蟮膇pasr的cdna閱讀框pcr片段和線性化pmd1質(zhì)粒經(jīng)nanodrop公司紫外分光光度計測定濃度，采用takara(clontech)公司的hdcloningkit進(jìn)行dna片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確的陽性克隆后，保存質(zhì)粒ipasr-pmd1備用。

4.2擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株的獲取

采用凍融法將植物轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體ipasr-pmd1轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌gv3101中，得到重組農(nóng)桿菌。

然后利用重組農(nóng)桿菌，通過花浸泡法(cloughsj,bentaf.1998.floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.16:735-743)將ipasr基因?qū)敫鐐惐葋喩鷳B(tài)型(col)擬南芥，得到t1代種子。

t1代種子收獲后在ms培養(yǎng)基(含有50mg/l卡那霉素)中篩選抗性植株，將抗性植株移栽到土中，收獲t2代種子。將t2代種子培育為植株(t2代植株)，提取葉片的基因組dna，用引物對seqidno.5和seqidno.6進(jìn)行pcr鑒定，pcr鑒定為陽性的植株即為t2代轉(zhuǎn)基因植株。t2代轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生t3代種子，對t3代種子進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，全部具有卡那霉素抗性的即為純合體。隨機選取三個轉(zhuǎn)基因純合體株系的t3代種子進(jìn)行耐鹽和耐旱性的鑒定。

4.3擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株后代的耐鹽性和耐旱性檢測

隨機選取三個轉(zhuǎn)基因植株純合株系(ox1、ox2、ox3)的t3代種子(每個株系50粒)，以野生型擬南芥(wt)的種子(50粒)為對照，分別進(jìn)行如下耐鹽性鑒定：將各個株系植株的種子同時播種在含有300mm的nacl的ms培養(yǎng)基平板上，置于22光照培養(yǎng)箱(16小時光照/8小時黑暗)中，萌發(fā)6天后，統(tǒng)計萌發(fā)率。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)率均高于野生型擬南芥對照的種子，表明轉(zhuǎn)基因超表達(dá)ipasr的擬南芥種子萌發(fā)過程能夠提高對鹽脅迫耐受性。

同樣，隨機選取三個轉(zhuǎn)基因植株純合株系(ox1、ox2、ox3)的t3代幼苗(每個株系20株)，以野生型擬南芥幼苗(20株)為對照，栽種于營養(yǎng)土中并于溫室中(22℃，16小時光照/8小時黑暗)正常培養(yǎng)20天，之后進(jìn)行干旱處理(不澆水)20天，隨后復(fù)水處理后7天統(tǒng)計存活率。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因超表達(dá)ipasr基因的轉(zhuǎn)基因株系復(fù)水后的存活率顯著高于野生型對照，表明轉(zhuǎn)基因超表達(dá)ipasr的擬南芥植株具有較強的耐旱性。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>中國科學(xué)院華南植物園

<120>厚藤ipasr基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>215

<212>prt

<213>厚藤ipasrprotein

<400>1

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<400>6

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