本發(fā)明涉及水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因及其編碼蛋白。

背景技術(shù)：

水稻是一種重要的糧食作物，世界上一半以上的人口以其為主食，提高水稻作物產(chǎn)量對提高糧食安全和穩(wěn)定經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。而水稻株型是影響水稻作物產(chǎn)量的一個重要因素，水稻葉夾角又是水稻株型的一個重要組成部分。葉夾角增大，更加利于葉片捕獲光，進而提高光合速率，在一定程度上提高作物產(chǎn)量；而葉夾角小，葉片處于直立狀態(tài)，可以在一定程度上提高種植密度，進而也能夠提高作物產(chǎn)量。所以，系統(tǒng)的研究水稻的葉夾角對塑造水稻株型和提高作物產(chǎn)量具有重要的理論和應(yīng)用價值。在短期內(nèi)實現(xiàn)林木性狀改良的需求，通過轉(zhuǎn)基因手段對其進行遺傳改良具有很大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種白樺基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

本發(fā)明水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本發(fā)明編碼水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

br，即油菜素內(nèi)酯，是一種重要的甾醇類植物激素，參與對植物葉夾角的調(diào)控，水稻br缺陷型突變體如d61-2、d11、bzr1-rnai、osgsk2-oe等，葉夾角顯著變小；而br功能獲得性突變體如m107、bzr1-d、osgsk2-rnai等，葉夾角顯著增大，充分表明br與植物葉夾角調(diào)控之間存在著直接的關(guān)系。

本發(fā)明公開了水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因及其編碼蛋白，本發(fā)明利用pcr方法從水稻中克隆出水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53基因。本發(fā)明獲得的oswrky53基因編碼區(qū)全長序列與ricegenomeannotationproject中公布的loc_os05g27730.1相對應(yīng)。本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，將oswrky53基因在水稻中過量表達，并且發(fā)現(xiàn)oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角顯著增大、種子增大，表現(xiàn)出br信號增強的表型；通過crispr/cas9敲除技術(shù)獲得oswrky53基因敲除突變體，oswrky53突變體表現(xiàn)出葉夾角變小、種子變小、株高變矮等一系列br信號缺陷的表型。br生物合成基因檢測、外源br對葉夾角敏感性分析實驗以及oswrky53對外源br處理的響應(yīng)實驗，都充分表明oswrky53能夠正向調(diào)控br信號。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53基因能夠正向調(diào)控br信號及水稻株型。水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53作為br信號正調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)，在一定程度上豐富和完善了水稻br信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對改造水稻株型，進而提高作物產(chǎn)量提供重要理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻總體形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-oe為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖2為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-oe為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖3為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角大小統(tǒng)計結(jié)果；其中wt為野生型水稻，oswrky53-oe為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖4為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻種子形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-oe-1、oswrky53-oe-2、oswrky53-oe-3均為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖5為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻種子粒長統(tǒng)計結(jié)果圖；其中wt為野生型水稻，1、2和3均為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖6為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻種子粒寬統(tǒng)計結(jié)果圖；其中wt為野生型水稻，1、2和3均為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖7為3個br生物合成基因d2、osdwf4、d11在oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻及野生型的表達量檢測結(jié)果；其中a為野生型水稻，b、c和d均為oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖8為oswrky53突變體敲除類型；其中wt為野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均為oswrky53基因敲除突變體；

圖9為oswrky53突變體總體形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均為oswrky53基因敲除突變體；

圖10為oswrky53突變體葉夾角形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-1為oswrky53基因敲除突變體；

圖11為oswrky53突變體葉夾角大小統(tǒng)計結(jié)果；其中a為野生型水稻，b為oswrky53基因敲除突變體；

圖12為oswrky53突變體種子形態(tài)圖；其中wt為野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均為oswrky53基因敲除突變體；

圖13為oswrky53突變體種子粒長統(tǒng)計結(jié)果；其中wt為野生型水稻，1和2為oswrky53基因敲除突變體；

圖14為oswrky53突變體種子粒寬統(tǒng)計結(jié)果；其中wt為野生型水稻，1和2為oswrky53基因敲除突變體；

圖15為oswrky53突變體株高統(tǒng)計結(jié)果；其中wt為野生型水稻，1和2為oswrky53基因敲除突變體；

圖16為外源br對oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角的敏感性分析實驗的圖片；其中wt為野生型水稻，oswrky53-oe為oswrky53-oe基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖17為外源br對oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角的敏感性分析實驗的統(tǒng)計結(jié)果；其中a為野生型水稻，b為oswrky53-oe基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻；

圖18為外源的br對oswrky53突變體葉夾角敏感性分析實驗的圖片；其中wt為野生型水稻，oswrky53為oswrky53基因敲除突變體；

圖19為外源的br對oswrky53突變體葉夾角的敏感性分析實驗的統(tǒng)計結(jié)果；其中a為野生型水稻，b為oswrky53基因敲除突變體；

圖20為轉(zhuǎn)錄水平上，oswrky53基因?qū)r響應(yīng)的表達特征分析；其中b為oswrky53基因，c為osdwf4基因；

圖21為蛋白水平上，oswrky53對br響應(yīng)的表達特征分析。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本實施方式公開了水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因及其編碼蛋白，本實施方式利用pcr方法從水稻中克隆出水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53基因。本實施方式獲得的oswrky53基因編碼區(qū)全長序列與ricegenomeannotationproject中公布的loc_os05g27730.1相對應(yīng)。本實施方式通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，將oswrky53基因在水稻中過量表達，并且發(fā)現(xiàn)oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角顯著增大、種子增大，表現(xiàn)出br信號增強的表型；通過crispr/cas9敲除技術(shù)獲得oswrky53基因敲除突變體，oswrky53突變體表現(xiàn)出葉夾角變小、種子變小、株高變矮等一系列br信號缺陷的表型。br生物合成基因檢測、外源br對葉夾角敏感性分析實驗以及oswrky53對外源br處理的響應(yīng)實驗，都充分表明oswrky53能夠正向調(diào)控br信號。

本實施方式首次發(fā)現(xiàn)水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53基因能夠正向調(diào)控br信號及水稻株型。水稻轉(zhuǎn)錄因子oswrky53作為br信號正調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)，在一定程度上豐富和完善了水稻br信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對改造水稻株型，進而提高作物產(chǎn)量提供重要理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體實施方式二：本實施方式編碼水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

通過以下實驗驗證本發(fā)明的效果：

實施例1、

1、水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因的克隆及測序：

一、以野生水稻品種日本晴為實驗材料，按照invitrogen公司的trizol試劑盒的操作手冊，提取葉片總rna；

二、采用dnaseⅰ處理步驟一所提取的總rna；

三、取1μg步驟二處理后的總rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照購買自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit試劑盒的使用手冊進行，獲得cdna；

四、以上述獲得的cdna為模板，參照takara公司的hsdnapolymerase操作說明書，用正向引物f1與反向引物r1擴增oswrky53基因。pcr反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共38循環(huán)；72℃終延伸10min。最后，將pcr產(chǎn)物在abi3130測序儀(abi公司)上進行測序，測序結(jié)果表明，水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因由1464個堿基組成，其核苷酸序列如序列表中的seqidno：1所示。編碼具有序列表中seqidno：2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

正向引物f1：5'-atggcgtcctcgacgggg-3'

反向引物r1：5'-ctagcagaggagcgactcgacg-3'

2、oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

一、載體構(gòu)建：以日本晴cdna為模板，參照takara公司的hsdnapolymerase操作說明書，以正向引物f2與反向引物r2為擴增引物，擴增oswrky53基因的編碼區(qū)，并將擴增片段克隆進入植物過表達載體pc1390u，形成一個ubiquitin啟動子驅(qū)動的oswrky53基因過表達載體。

正向引物f2：5'-gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg-3'

反向引物r2：5'-tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg-3'

二、目的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105：將eha105感受態(tài)從-80℃冰箱取出，置于冰上融化；將500ng～1μg的目的質(zhì)粒加入100uleha105感受態(tài)中，冰上放置30min；迅速置于液氮中5min；從液氮中取出，迅速置于37℃水預(yù)鍋中水浴5min；冰上2min；加入800ul液體lb培養(yǎng)基，置于全溫震蕩器(購自mkn公司)中，28℃，120rpm孵育4～5h；離心，棄大部分上清，將剩余菌液涂抹于含有卡那霉素(50ug/ml)(購自amresco)和利福平(50ug/ml)(購自amresco)的lb固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3天左右。

三、待長出菌落后，進行菌落pcr鑒定，鑒定出陽性克??；挑取陽性克隆至加有相應(yīng)抗生素和利福平的液體lb培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng)16h左右，此時的菌液可以用30％的甘油按1:1的體積比進行保存，存至-80℃冰箱，侵染愈傷組織時，從-80℃取出進行活化即可。

四、農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織：從-80℃冰箱取出目的存菌，按1:100的比例加入含有卡那霉素(50ug/ml)和利福平(50ug/ml)的液體lb培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)過夜；將菌液培養(yǎng)至肉眼看上去像橙汁一樣的顏色(od＝1.0左右)，方可從培養(yǎng)箱中取出；取500ul左右菌液至1.5ml離心管中，5000rpm，28℃，離心3min，棄上清，可以看到管底有白色的菌團；用300ul含有20ug/ml的乙酰丁香酮(購自aldrich)的液體共培培養(yǎng)基輕輕吹打管底菌團，使其均勻的懸浮在液體培養(yǎng)基中；挑選生長狀態(tài)良好的愈傷組織至50ml離心管中，大約至離心管刻度5ml左右；加入20ml含有20ug/ml的乙酰丁香酮的液體共培培養(yǎng)基，然后將上述懸浮好的300ul菌液全部加入到50ml離心管中；持續(xù)輕柔混勻2～3min，以進行侵染。將液體共培培養(yǎng)基倒掉，然后將侵染好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，吸附多余的培養(yǎng)基，這一過程大約需要1min左右；在固體共培培養(yǎng)基上鋪一層濾紙，使濾紙浸透，然后將上述侵染好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至此固體培養(yǎng)基上；28℃暗培養(yǎng)2～3天。

五、被侵染水稻愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)：被侵染的愈傷暗培養(yǎng)2～3天后，將愈傷顆粒轉(zhuǎn)移至50ml離心管中；用含有400ug/ml羧卞青霉素(購自amresco)的無菌水清洗愈傷組織4～5遍，每次持續(xù)1min左右，進行除菌；再用無菌水清洗愈傷組織2～3遍，轉(zhuǎn)移至鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，吸干多余水分；將上述愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有400ug/ml羧卞青霉素的恢復(fù)培養(yǎng)基上，28℃人工氣候培養(yǎng)箱(24h光培養(yǎng))恢復(fù)培養(yǎng)4～5天。

六、被侵染水稻愈傷組織的篩選培養(yǎng)：恢復(fù)培養(yǎng)4～5天后，將恢復(fù)培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有400ug/ml羧卞青霉素和50ug/ml潮霉素(購自roche)的篩選培養(yǎng)基上；將其轉(zhuǎn)移至28℃人工氣候培養(yǎng)箱(24h光培養(yǎng))中培養(yǎng)30天左右。

七、抗性水稻愈傷組織的分化培養(yǎng)：將篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，每瓶移至一簇愈傷；將其置于28℃人工氣候培養(yǎng)箱(24h光培養(yǎng))中培養(yǎng)30天左右，即可分化出轉(zhuǎn)基因苗。

八、轉(zhuǎn)基因苗的鑒定：待分化出轉(zhuǎn)基因苗后，需對其進行鑒定，排除假陽性。首先進行水稻dna的粗提；用以上粗提的dna為模板，按照全式金公司的easytaqdnapolymerase說明書，用潮霉素引物(f3和r3)進行擴增。

正向引物f3：5'-tgcgcccaagctgcatcat-3'

反向引物r3：5'-tgaactcaccgcgacgtctgt-3'

如圖1所示，是oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻的總體形態(tài)圖，可以看到過表達轉(zhuǎn)基因水稻呈現(xiàn)出br信號增強的表型；其葉夾角顯著增大，其劍葉的葉夾角超過100°，而野生型的葉夾角僅為30°左右(如圖2、3所示)；并且過表達轉(zhuǎn)基因水稻的種子顯著增大，測量其粒長粒寬發(fā)現(xiàn)，與野生型相比兩者都顯著變長(如圖4、5和6所示)，oswrky53基因極有可能正向調(diào)控br信號。

3、br生物合成基因的表達量檢測

一、以oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻及其對照為實驗材料，培養(yǎng)至兩周大小，取相同部位的葉片，參照購買自invitrogen公司的trizol試劑盒的操作手冊提取葉片總rna；

二、采用dnaseⅰ處理步驟一提取的總rna；

三、取1μg步驟二處理后的總rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照購買自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit試劑盒的使用手冊進行；

四、以獲得的cdna為模板通過3個br生物合成基因引物：d2基因(正向引物f4與反向引物r4)、osdwf4基因(正向引物f5與反向引物r5)和d11基因(正向引物f6與反向引物6)，水稻內(nèi)參actin(正向引物f7與反向引物r7)，采用sybrgreenpcrmastermix(transstart)進行quantitativereal-timepcr；數(shù)據(jù)從bio-radchromo4real-timepcrdetector上獲得；用2^-△△ct方法分析倍數(shù)變化。

正向引物f4：5'-tcgctgacggagctgatg-3'

反向引物r4：5'-acttgaggtgggaggacttg-3'

正向引物f5：5'-ctccaccttctccgctcag-3'

反向引物r5：5'-gccgctccgtctcttcc-3'

正向引物f6：5'-tggcgacattgagaagattgc-3'

反向引物r6：5'-cagaaggcgatgacattgacc-3'

正向引物f7：5'-agaccttcaacacccctgctatg-3'

反向引物r7：5'-tcacgcccagcaaggtcg-3'

如圖7所示，是3個br生物合成基因d2、osdwf4、d11在oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻及其對照中的表達特征。結(jié)果顯示，與對照野生型相比，過表達轉(zhuǎn)基因水稻中3個br生物合成基因的表達量均顯著降低，說明在過表達轉(zhuǎn)基因水稻中其內(nèi)源的br信號是增強的，初步說明oswrky53基因能夠正向調(diào)控br信號。

4、oswrky53突變體的獲得

一、將oswrky53基因的cds序列輸入crisprprimerdesigner軟件，設(shè)計2對靶位點引物(f8和r8；f9和r9)，用于后續(xù)敲除載體的構(gòu)建。

正向引物f8：5'-ggcattccagtcgtacctctgagc-3'

反向引物r8：5'-aaacgctcagaggtacgactggaa-3'

正向引物f9：5'-gccgagctggaggacgggtacaac-3'

反向引物r9：5'-aaacgttgtacccgtcctccagct-3'

二、將100μm上下游引物各取1μl加入到98μl的0.5×te溶液中，90℃熱激30s，形成打靶接頭，移至室溫冷卻完成退火。

三、將這2個打靶接頭分別連接到各grna表達盒上。

pcr程序為：37℃5min，20℃5min，5個循環(huán)。

四、通過巢式pcr的方法擴增grna表達盒

第一輪pcr擴增

pcr程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃20s，共25個循環(huán)；72℃5min。第二輪pcr擴增：

pcr程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min。

本步驟操作所涉及到的通用引物序列為：

u-f:5'-ctccgttttacctgtggaatcg-3'

grna-r:5'-cggaggaaaattccatccac-3'

b1':5'-ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagg-3'

b2:5'-agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3'

b2':5'-ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3'

bl:5'-agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctc-3'

五、將上述巢式pcr獲得的片段，連接入pylcrspr/cas9-mt載體骨架上，即完成敲除載體的構(gòu)建。

程序：37℃，15min；隨后，在上述體系基礎(chǔ)上加入連接酶，連接體系為：

t4dna酶(neb)0.1μl

10xdnaligasebuffer(neb)1.5μl

pcr程序：37℃5min，10℃5min，20℃5min，共15個循環(huán)。

六、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、陽性克隆的鑒定、測序、質(zhì)粒的提?。?/p>

七、目的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105；

八、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得oswrky53基因敲除突變體。

如圖8所示，是兩種oswrky53基因敲除突變體oswrky53-1和oswrky53-2的測序結(jié)果，wt的序列為：5'-atcccggctcagaggtacgactggaag-3'，oswrky53-1(-cagaggt)的序列為：5'-atcccggct-------acgactggaag-3'，oswrky53-2(+a)的序列為：5'-atcccggctacagaggtacgactggaag-3'，分別是缺失7bp和插入1bp，均造成后續(xù)移碼突變，使表達出的氨基酸發(fā)生改變，oswrky53蛋白功能喪失。如圖9所示，是oswrky53突變體的總體形態(tài)圖，從圖中可以看到突變體呈現(xiàn)出一系列br信號缺失的表型；首先，oswrky53突變體葉夾角變小，其劍葉的葉夾角僅為18°左右，而對照的葉夾角為38°左右(如圖10、11所示)；其次，oswrky53突變體的種子顯著變小，測量其粒長粒寬發(fā)現(xiàn)，與野生型相比兩者都顯著變短(如圖12、13和14所示)；再次，oswrky53突變體株高變矮(如圖15所示)。oswrky53突變體的表現(xiàn)再次說明，oswrky53能夠正向調(diào)控br信號。

5、外源br對葉夾角的敏感性分析

一、種子消毒：選用oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻及其對照為實驗材料，種子剝皮，用70％乙醇浸泡1min；然后用30％的次氯酸浸泡兩次，每次15min；最后用無菌水清洗5～7遍；

二、將消毒種子轉(zhuǎn)移至1/2ms固體培養(yǎng)基(1％蔗糖，4％phytagel，ph5.8)上，30℃暗培養(yǎng)8天左右；

三、選取第二個葉的葉夾角(包含葉片、葉鞘各1cm)，用不同濃度24-epibl(sigma,e1641)在30℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)48h；

四、觀察結(jié)果，并用imagej軟件進行葉夾角的測量。

如圖16所示，是oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻及其對照在不同濃度24-epibl(sigma,e1641)中處理48h后的照片，圖17是不同濃度24-epibl處理過程中葉夾角角度統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果顯示，用10nm24-epibl處理后，過表達轉(zhuǎn)基因水稻的葉夾角達到130°左右，而對照僅為60°左右；并且，隨著24-epibl處理濃度的提高，葉夾角增大的表型更加明顯，用1μμ24-epibl處理后，過表達轉(zhuǎn)基因水稻的葉夾角甚至達到230°左右，說明oswrky53過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角對外源的br處理超敏感。相反的，oswrky53突變體葉夾角對外源的24-epibl處理不敏感(如圖18、19所示)，即使用1μμ24-epibl處理后，oswrky53突變體的葉夾角僅達到50°左右，而對照達到140°左右。進一步為oswrky53基因正向調(diào)控br信號提供實驗證據(jù)。

6、轉(zhuǎn)錄水平上，oswrky53基因?qū)r響應(yīng)的表達特征分析：

一、選用野生水稻品種龍粳11為實驗材料，浸種催芽后，將萌發(fā)的種子播種在剪了底的96孔pcr板中，然后浸在1/2ms液體培養(yǎng)基中，28℃光照培養(yǎng)箱(光培養(yǎng)14h；暗培養(yǎng)10h)中培養(yǎng)2周；

二、挑選生長狀態(tài)一致的水稻幼苗，用1μm24-epibl分別處理0h、1h、3h、6h；

三、取相同部位的葉片，參照購買自invitrogen公司的trizol試劑盒的操作手冊，提取葉片總rna；

四、采用dnaseⅰ處理步驟三提取的總rna；

五、取1μg步驟四處理后的總rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照購買自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit試劑盒的使用手冊進行，獲得cdna；

六、以獲得的cdna為模板，正向引物f10與反向引物r10為檢測引物，檢測oswrky53基因的表達水平。

正向引物f10：5'-agaccttcaacacccctgctatg-3'

反向引物r10：5'-tcacgcccagcaaggtcg-3'

如圖20所示，是oswrky53基因轉(zhuǎn)錄水平上對br響應(yīng)的表達特征，結(jié)果顯示br能夠抑制oswrky53轉(zhuǎn)錄水平上的表達，并且br處理時間越長，抑制程度越明顯。

7、蛋白水平上，oswrky53對br響應(yīng)的表達特征分析

一、選用純合的帶有myc標簽的oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻為實驗材料，浸種催芽后，將萌發(fā)的種子播種在剪了底的96孔pcr板中，然后浸在1/2ms液體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱(光培養(yǎng)14h；暗培養(yǎng)10h)中培養(yǎng)2周；

二、挑選生長狀態(tài)一致的水稻幼苗，用1μμ24-epibl和dmso分別處理30min；

三、取相同部位的葉片，參照碧云天公司的sds裂解液說明書提取葉片總蛋白；

四、加入1×loadingbuffer，煮沸5min，高速離心10min；

五、上樣，進行sds-page電泳；

六、電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜(bio-rad)上；

七、待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用myc抗體(abmart：m20002l)進行后續(xù)western雜交。

如圖21所示，是蛋白水平上，oswrky53對br響應(yīng)的表達特征。結(jié)果顯示，br能夠誘導(dǎo)oswrky53蛋白水平上的表達。作為br信號正調(diào)控因子，其蛋白水平上的積累越多，br信號輸出越強，但植物體又存在著自我負反饋平衡調(diào)節(jié)機制，當植物體內(nèi)br信號強到一定程度后，植物體又能夠抑制這些br信號正調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平上的表達，以維持植物體內(nèi)br信號的平衡。

綜上所述，本實施例通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，將oswrky53基因在水稻中過量表達，并且發(fā)現(xiàn)oswrky53基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角顯著增大、種子增大，表現(xiàn)出br信號增強的表型；通過crispr/cas9敲除技術(shù)獲得oswrky53基因敲除突變體，oswrky53突變體表現(xiàn)出葉夾角變小、種子變小、株高變矮等一系列br信號缺陷的表型。br生物合成基因檢測、外源br對葉夾角敏感性分析實驗以及oswrky53對外源br處理的響應(yīng)實驗，都充分表明oswrky53能夠正向調(diào)控br信號。

序列表

<110>中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所

<120>水稻br信號正調(diào)控因子oswrky53基因及其編碼蛋白

<160>28

<210>1

<211>1464

<212>dna

<213>水稻

<400>1

atggcgtcctcgacgggggggttggaccacgggttcacgttcacgccgccgccgttcatc60

acgtcgttcaccgagctgctgtcggggggcggtggggacctgctcggcgccggcggtgag120

gagcgctcgccgagggggttctccagaggcggagcgagggtgggcggcggggtgcccaag180

ttcaagtccgcgcagccgccgagcctgccgctctcgccgccgccggtgtcgccgtcgtcc240

tacttcgccatcccgccggggctcagccccaccgagctgctcgactcccccgtcctcctc300

agctcctcccatatcttggcgtccccgaccaccggtgcaatcccggctcagaggtacgac360

tggaaggccagcgccgatctcatcgcttctcagcaagatgacagccgcggcgacttctcc420

ttccacaccaactccgacgccatggccgcgcaaccggcctctttcccttccttcaaggag480

caagagcagcaagtggtcgagtcgagcaagaacggcgccgccgccgcgtcgagcaacaag540

agcggcggcggcgggaacaacaagctggaggacgggtacaactggaggaagtacgggcag600

aagcaggtgaaggggagcgagaacccgaggagctactacaagtgcacctacaacggctgc660

tccatgaagaagaaggtggagcgctcgctcgccgacggccgcatcacccagatcgtctac720

aagggcgcacacaaccaccccaagccgctctccacccgccgcaacgcctcctcctgcgcc780

accgccgccgcctgcgccgacgacctcgcggcgcccggcgcgggcgcggaccagtactcc840

gccgcgacgcccgagaactcctccgtcacgttcggcgacgacgaggccgacaacgcatcg900

caccgcagcgagggcgacgagcccgaagccaagcgctggaaggaggatgctgacaacgag960

ggcagctccggcggcatgggcggcggcgccggcggcaagccggtgcgcgagccgaggctt1020

gtggtgcagacgctgagcgacatcgacatcctcgacgacggcttccggtggaggaagtac1080

ggccagaaggtcgtcaagggcaaccccaacccaaggagctactacaagtgcacgacggtg1140

ggctgcccggtgcggaagcacgtggagcgggcgtcgcacgacacgcgcgccgtgatcacc1200

acctacgagggcaagcacaaccacgacgtcccggtcggccgcggcggcggcggcggacgc1260

gccccggcgccggcgccgccgacgtcgggggcgatccggccgtcggccgtcgccgccgcc1320

cagcaggggccctacaccctcgagatgctccccaaccccgccggcctctacggcggctac1380

ggcgccggcgccggcggcgccgcgttcccgcgcaccaaggacgagcggcgggacgacctg1440

ttcgtcgagtcgctcctctgctag1464

<210>2

<211>487

<212>prt

<213>水稻

<400>2

metalaserserthrglyglyleuasphisglyphethrphethr

151015

propropropheilethrserphethrgluleuleuserglygly

202530

glyglyaspleuleuglyalaglyglyglugluargserproarg

354045

glypheserargglyglyalaargvalglyglyglyvalprolys

505560

phelysseralaglnproproserleuproleuserpropropro

657075

valserprosersertyrphealaileproproglyleuserpro

808590

thrgluleuleuaspserprovalleuleuserserserhisile

95100105

leualaserprothrthrglyalaileproalaglnargtyrasp

110115120

trplysalaseralaaspleuilealaserglnglnaspaspser

125130135

argglyasppheserphehisthrasnseraspalametalaala

140145150

glnproalaserpheproserphelysgluglngluglnglnval

155160165

valgluserserlysasnglyalaalaalaalaserserasnlys

170175180

serglyglyglyglyasnasnlysleugluaspglytyrasntrp

185190195

arglystyrglyglnlysglnvallysglysergluasnproarg

200205210

sertyrtyrlyscysthrtyrasnglycyssermetlyslyslys

215220225

valgluargserleualaaspglyargilethrglnilevaltyr

230235240

lysglyalahisasnhisprolysproleuserthrargargasn

245250255

alasersercysalathralaalaalacysalaaspaspleuala

260265270

alaproglyalaglyalaaspglntyrseralaalathrproglu

275280285

asnserservalthrpheglyaspaspglualaaspasnalaser

290295300

hisargsergluglyaspgluproglualalysargtrplysglu

305310315

aspalaaspasngluglyserserglyglymetglyglyglyala

320325330

glyglylysprovalarggluproargleuvalvalglnthrleu

335340345

seraspileaspileleuaspaspglypheargtrparglystyr

350355360

glyglnlysvalvallysglyasnproasnproargsertyrtyr

365370375

lyscysthrthrvalglycysprovalarglyshisvalgluarg

380385390

alaserhisaspthrargalavalilethrthrtyrgluglylys

395400405

hisasnhisaspvalprovalglyargglyglyglyglyglyarg

410415420

alaproalaproalaproprothrserglyalaileargproser

425430435

alavalalaalaalaglnglnglyprotyrthrleuglumetleu

440445450

proasnproalaglyleutyrglyglytyrglyalaglyalagly

455460465

glyalaalapheproargthrlysaspgluargargaspaspleu

470475780

phevalgluserleuleucys

485487

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f1的核苷酸序列。

<400>3

atggcgtcctcgacgggg18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r1核苷酸序列。

<400>4

ctagcagaggagcgactcgacg22

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f2的核苷酸序列。

<400>5

gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg39

<210>6

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物p2的核苷酸序列。

<400>6

tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg43

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f3的核苷酸序列。

<400>7

tgcgcccaagctgcatcat19

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r3的核苷酸序列。

<400>8

tgaactcaccgcgacgtctgt21

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f4的核苷酸序列。

<400>9

tcgctgacggagctgatg18

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r4的核苷酸序列。

<400>10

acttgaggtgggaggacttg20

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f5的核苷酸序列。

<400>11

ctccaccttctccgctcag19

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r5的核苷酸序列。

<400>12

gccgctccgtctcttcc17

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f6的核苷酸序列。

<400>13

tggcgacattgagaagattgc21

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r6的核苷酸序列。

<400>14

cagaaggcgatgacattgacc21

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f7的核苷酸序列。

<400>15

agaccttcaacacccctgctatg23

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r7的核苷酸序列。

<400>16

tcacgcccagcaaggtcg18

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f8的核苷酸序列。

<400>17

ggcattccagtcgtacctctgagc24

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r8的核苷酸序列。

<400>18

aaacgctcagaggtacgactggaa24

<210>19

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f9的核苷酸序列。

<400>19

gccgagctggaggacgggtacaac24

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r9的核苷酸序列。

<400>20

aaacgttgtacccgtcctccagct24

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f10的核苷酸序列。

<400>21

agaccttcaacacccctgctatg23

<210>22

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r10的核苷酸序列。

<400>22

tcacgcccagcaaggtcg18

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物u-f的核苷酸序列。

<400>23

ctccgttttacctgtggaatcg22

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物grna-r的核苷酸序列。

<400>24

cggaggaaaattccatccac20

<210>25

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b1'的核苷酸序列。

<400>25

ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagg38

<210>26

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b2的核苷酸序列。

<400>26

agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc37

<210>27

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b2'的核苷酸序列。

<400>27

ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg38

<210>28

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物bl的核苷酸序列。

<400>28

agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctc37