本發(fā)明涉及一種抗逆蛋白質(zhì)的編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的轉(zhuǎn)基因甜橙。
背景技術(shù)：
：甜橙(學(xué)名：citrussinensis(l.)osbeck)，喬木，枝少刺或近于無(wú)刺。葉通常比柚葉略小，翼葉狹長(zhǎng)，葉片卵形或卵狀橢圓形，很少披針形，長(zhǎng)6-10厘米，寬3-5厘米，或有較大的?；ò咨?，總狀花序有花少數(shù)；花萼5-3淺裂，花瓣長(zhǎng)1.2-1.5厘米；雄蕊20-25枚；花柱粗壯，柱頭增大。果圓球形，扁圓形或橢圓形，橙黃至橙紅色，果皮難或稍易剝離，瓢囊9-12瓣，果心實(shí)或半充實(shí)，果肉淡黃、橙紅或紫紅色，味甜或稍偏酸；種子少或無(wú)，子葉乳白色，多胚?；ㄆ?-5月，果期10-12月，遲熟品種至次年2-4月。橙子中含量豐富的維生素c、p，能增加機(jī)體抵抗力，增加毛細(xì)血管的彈性，降低血中膽固醇。高血脂癥、高血壓、動(dòng)脈硬化者常食橙子有益。橙子所含纖維素和果膠物質(zhì)，可促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，有利于清腸通便，排除體內(nèi)有害物質(zhì)。植物病蟲(chóng)害是導(dǎo)致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。潰瘍病是甜橙較易發(fā)生、為害性較大的一種細(xì)菌性病害，為國(guó)內(nèi)外植物檢疫對(duì)象。潰瘍病能為害幼嫩葉片、枝梢和果實(shí)。葉片發(fā)病初期在葉背出現(xiàn)淡黃色針尖大小的油浸狀斑點(diǎn)，爾后病斑逐漸擴(kuò)大，轉(zhuǎn)為米黃色至暗黃色，并在同一病斑處穿透葉片正反兩面同時(shí)隆起，一般背面隆起比正面更加明顯。繼而病斑中央呈火山口狀裂開(kāi)。最后病斑呈木栓化，灰褐色，近圓形，周?chē)杏蜐n狀暈環(huán)。枝梢和果實(shí)的癥狀與葉片相似。葉片感病嚴(yán)重時(shí)造成大量落葉，枝梢枯死；果實(shí)感病嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成落果、裂果。黃龍病是一種極微小的細(xì)菌引起的病害，初期病樹(shù)表現(xiàn)為黃梢和葉片斑駁型黃化兩種類(lèi)型。感病植株枝梢老熟后，從葉片基部、邊緣逐漸退綠，不均勻黃化、變硬，形成黃綠相間的斑駁狀，最后全葉黃化脫落。在具均勻黃化葉或斑駁黃化葉的枝條上抽生的新梢，葉片一般呈缺素狀花葉。被害植株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，枝梢變細(xì)、變短，后期病樹(shù)出現(xiàn)爛根，開(kāi)花多而早，落花落果嚴(yán)重；果形小，色青或畸形，成熟時(shí)著色不均勻，產(chǎn)量銳減，嚴(yán)重者喪失結(jié)果能力。炭疽病也是甜橙通常會(huì)致病的一種。甜橙發(fā)生炭疽病后，容易造成落葉、落果、枯梢、裂果和果實(shí)滯育，使樹(shù)勢(shì)衰弱，產(chǎn)量降低，甚至整株死亡。貯藏期間還會(huì)引起果實(shí)腐爛。葉片多在葉尖和邊緣發(fā)病，病斑近圓形或不規(guī)則形，中央灰白色或淡褐色，密生黑色小點(diǎn)，邊緣黃褐色。枝梢病部淡褐色，發(fā)病后由上而下逐漸枯死。病斑上也有黑色小點(diǎn)。天氣潮濕時(shí)，會(huì)出現(xiàn)粉紅色霉?fàn)钗?。果?shí)發(fā)病多在蒂部，形態(tài)不一，有暗褐色斑塊。干燥時(shí)病部黃褐色，稍稍凹陷，病斑分界明顯，濕度大時(shí)則往往全果腐爛。為了防治植物蟲(chóng)害，人們通常使用廣譜化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制劑，但二者在實(shí)際應(yīng)用中都具有局限性：化學(xué)殺蟲(chóng)劑會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染的問(wèn)題，并導(dǎo)致抗藥性昆蟲(chóng)的出現(xiàn)；而生物殺蟲(chóng)制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。為了解決化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制劑在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)將編碼抗逆蛋白的基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些轉(zhuǎn)基因植物以防治植物病害。至今為止，已有大量的研究表明wrky蛋白在不同生理生化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，像信號(hào)傳導(dǎo)，代謝，木質(zhì)化等。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明wrky轉(zhuǎn)錄因子參與了植物對(duì)生物及非生物逆境的響應(yīng)過(guò)程。例如，擬南芥ii族a亞族的三個(gè)成員，atwryk18、atwrky40和atwrky60,在結(jié)構(gòu)上與功能上形成冗余、拮抗而又互不相同的復(fù)雜作用模式，應(yīng)對(duì)不同的真菌及細(xì)菌病害。水稻中也有關(guān)于一對(duì)wrky轉(zhuǎn)錄因子的等位基因在白葉枯病、細(xì)菌性條斑病以及干旱、鹽等逆境下作用截然相反的研究報(bào)道。鑒于wrky轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫過(guò)程所起的重要作用，該類(lèi)基因可作為有效的基因資源，通過(guò)轉(zhuǎn)基因模式創(chuàng)造出抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。目前為止，已有大量研宄表明，過(guò)量表達(dá)類(lèi)似基因能夠顯著增強(qiáng)植物的抗逆性。在甜橙中目前共發(fā)現(xiàn)有wrky轉(zhuǎn)錄因子50多個(gè)種類(lèi)，其功能也各不相同。目前針對(duì)wrky在甜橙中表達(dá)的情況沒(méi)有報(bào)道，特別是在甜橙中抗逆的情形也沒(méi)有相應(yīng)的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種wrky基因，該特異性的基因具體序列如:seqidno:1所示。本發(fā)明提供了一種抗逆蛋白質(zhì)，包括：(a)具有seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有抗逆活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述的取代具體為在seqidno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，在s62e，a83r，t105c，k121r，r125s，l142p，a155d，r161p，n170k，s183q，g200h，t222p進(jìn)行相應(yīng)的取代。s62e表示在第62位，將s取代為e。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述抗逆基因。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述抗逆基因或所述表達(dá)盒的重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述抗逆基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述植物為甜橙或柑橘。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗逆植物的方法，包括：將所述抗逆基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。優(yōu)選地，所述植物為甜橙或柑橘。將所述的抗逆基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源dna導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將dna攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的dna導(dǎo)入。本發(fā)明具有以下技術(shù)效果本發(fā)明提供一種wrky-n基因，該基因首次克隆得到，在現(xiàn)有技術(shù)中也沒(méi)有相應(yīng)的序列記錄。針對(duì)該基因的表達(dá)蛋白進(jìn)行了大約300多種突變，篩選并獲得了其中11個(gè)具有提高活性的正向突變篩選。將所述的序列構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化甜橙中，獲得了轉(zhuǎn)基因植物，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，具有提高的潰瘍病、黃龍病以及炭疽病的效果，同時(shí)在耐旱和耐鹽方面也具有較好的效果。下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。附圖說(shuō)明圖1為轉(zhuǎn)基因植物鑒定結(jié)果pcr圖；1為野生型植物，2-13分別對(duì)應(yīng)于序列2蛋白轉(zhuǎn)基因植株、s62e突變的轉(zhuǎn)基因植株、a83r突變的轉(zhuǎn)基因植株、k121r突變的轉(zhuǎn)基因植株、r125s突變的轉(zhuǎn)基因植株、l142p突變的轉(zhuǎn)基因植株、a155d突變的轉(zhuǎn)基因植株、r161p突變的轉(zhuǎn)基因植株、n170k突變的轉(zhuǎn)基因植株、s183q突變的轉(zhuǎn)基因植株、g200h突變的轉(zhuǎn)基因植株、t222p突變的轉(zhuǎn)基因植株；14為t222p突變的轉(zhuǎn)基因植株重復(fù)。圖2病情指數(shù)圖。圖3發(fā)病率統(tǒng)計(jì)圖。圖4存活率統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明編碼基因及用途的技術(shù)方案。實(shí)施例1表達(dá)載體以及農(nóng)桿菌的構(gòu)建全基因合成seqidno：1所示的序列，通過(guò)采用本領(lǐng)域常用pcr引入突變位點(diǎn)的方法，分別設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的突變序列，分別編碼在seqidno：2所示序列的基礎(chǔ)上在s62e，a83r，t105c，k121r，r125s，l142p，a155d，r161p，n170k，s183q，g200h或t222p的突變。將所述的基因序列進(jìn)行t克隆，與pgem-t載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，分別獲得含有目的基因的大腸桿菌pgem-wrky-n，采用測(cè)序，進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明構(gòu)建正確。植物表達(dá)載體pbi121-wrky-n的構(gòu)建1,酶切質(zhì)粒pgem-wrky-n酶切反應(yīng)體系:加ddh20至20μl。37℃酶切30min后，酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段，與同樣酶切質(zhì)粒pb1121進(jìn)行連接，連接條件為本領(lǐng)域常規(guī)的連接條件。將連接好的載體通過(guò)電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過(guò)鑒定，成功的獲得了目的農(nóng)桿菌。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因植物的獲得甜橙胚性愈傷組織在mt基本培養(yǎng)基上每25天繼代一次，繼代4次后用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)所使用的農(nóng)桿菌菌株eha105，此菌株包含pbi121載體，載體上已連接wrky-n基因，均由camv35s啟動(dòng)子控制。愈傷系，抗性愈傷經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)和芽再生獲得轉(zhuǎn)化子。再生抗性芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(1/2mt+iba0.15mg/l十naa0.35mg/l+蔗糖25g/l+瓊脂10g/l)上進(jìn)行生根，獲得的生根試管苗經(jīng)馴化后移栽到溫室。轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定：采小塊葉片，采用dna提取試劑盒，提取相應(yīng)的dna，分別采用引物f：atgagagatagtagcaaagaga；r：tcatctattgcgcatcccagg，采用如下表1的pcr擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增：pcr反應(yīng)程序?yàn)?95℃3min；94℃40s,57℃45s,72℃1.2min共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃foreverpcr結(jié)束后，pcr產(chǎn)物使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因植株具有含有目的基因，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因構(gòu)建成功。實(shí)施例3抗逆性檢測(cè)1、潰瘍病抗性檢測(cè)將潰瘍病病菌活化擴(kuò)增培養(yǎng)用于葉片離體接種。采集生長(zhǎng)一致的wt和轉(zhuǎn)基因葉片，自來(lái)水清洗干凈后用接種針(直徑約0.2mm)在葉片背面刺孔。每個(gè)葉片共刺8個(gè)接種點(diǎn)，葉脈兩邊各4個(gè)，每個(gè)接種點(diǎn)刺5-7個(gè)孔(總面積約1.5mm2)。取10μl菌液(取菌液之前充分搖勻，菌液濃度為2.0*108個(gè)/ml左右)滴在每個(gè)接種點(diǎn)上，接種完成后將葉片平放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，并且在濾紙上加4ml滅菌水以保證濕度，用封口膜封好后置于28℃生化培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天進(jìn)行觀察，轉(zhuǎn)基因葉片在接種后0,3,5,7d拍照，每張照片均加上比例尺。照片拍好后用imagej(version1.4.3.67)軟件計(jì)算病斑大小。病情指數(shù)(di)參照shiotani等(2008)的方法進(jìn)行計(jì)算略有修改，分別隨機(jī)選擇發(fā)病后3，5，7天葉片20個(gè)病斑，用imagej軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)病斑大小，根據(jù)病斑大小將病情分為0級(jí)(病斑大小<1.5mm2，即大約針刺的接種部位的面積大小)，1級(jí)((1.5mm2<病斑大小<2mm2)，3級(jí)(2mm2<病斑大小<3mm2)，5級(jí)(3mm2<病斑大小<5mm2)，7級(jí)(病斑大小>5mm2)，統(tǒng)計(jì)每級(jí)包含的病斑數(shù)目，di＝∑[各級(jí)病斑數(shù)*相應(yīng)級(jí)數(shù)值]/(20*7)*100。結(jié)果如圖2所示。表2的具體數(shù)值結(jié)果，如下：病情指數(shù)(％)\天數(shù)0357wt013.5633.0655.01序列2蛋白轉(zhuǎn)基因植株00.18.220.1s62e突變的轉(zhuǎn)基因植株00.28.316.5a83r突變的轉(zhuǎn)基因植株00.37.613.8k121r突變的轉(zhuǎn)基因植株00.16.317r125s突變的轉(zhuǎn)基因植株00.25.616.5l142p突變的轉(zhuǎn)基因植株00.3915.3a155d突變的轉(zhuǎn)基因植株00.24.613.4r161p突變的轉(zhuǎn)基因植株00.15.616n170k突變的轉(zhuǎn)基因植株00.26.615.4s183q突變的轉(zhuǎn)基因植株00.37.414.2g200h突變的轉(zhuǎn)基因植株00.25.814t222p突變的轉(zhuǎn)基因植株00.1713.5從圖2和表2的結(jié)果表明，接種后3、5、7天wt的病情指數(shù)分別達(dá)到13.56％33.06％和55.01％，分別為比轉(zhuǎn)基因甜橙均較高。接種后5天，wt葉片的背面和正面均產(chǎn)生較大的海綿狀膿疤，而對(duì)于轉(zhuǎn)基因葉片只在其正面產(chǎn)生少量較小或者基本看不著的病斑。接種后7天雖然wt和轉(zhuǎn)基因甜橙均產(chǎn)生了病斑，但是轉(zhuǎn)基因植物的病斑面積要顯著小于對(duì)照，這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因植株顯著增強(qiáng)了潰瘍病抗性。2、黃龍病抗性檢測(cè)將黃龍病菌活化培養(yǎng)，菌液濃度培養(yǎng)至2*108個(gè)接種方法，步驟如下:選取轉(zhuǎn)基因植株新鮮葉片，無(wú)菌水洗凈，平鋪于培養(yǎng)皿中，葉柄處壓一塊濕潤(rùn)棉花，防止葉片失水。將菌液稀釋500倍，用固定大小針頭蘸取黃龍病病菌液，針刺葉片，葉脈左右兩邊各刺12個(gè)針孔，每個(gè)樣品重復(fù)四次，光照培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)。發(fā)病率統(tǒng)計(jì)分析：接種第10d時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病病斑數(shù)，以肉眼可見(jiàn)病斑為準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)病率，發(fā)病率(％)＝病斑數(shù)/接菌總數(shù)x100％。結(jié)果如圖3所示，在沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的甜橙中，發(fā)病率較高，而轉(zhuǎn)基因的包括突變的幾種甜橙中菌具有較低的發(fā)病率，具有較好的抗病效果。3、耐鹽性檢測(cè)將實(shí)施例2中通過(guò)pcr鑒定的轉(zhuǎn)基因株系在成苗期進(jìn)行耐鹽性檢測(cè)。具體方法:將野生型和轉(zhuǎn)基因的苗，培養(yǎng)在正常的光照條件下生長(zhǎng)28天，然后每隔3天用300mm的nacl溶液澆灌，15天后統(tǒng)計(jì)成苗的存活率(存活率＝生長(zhǎng)點(diǎn)壞死的成苗數(shù)/成苗的總數(shù))。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)基因苗在成苗期的耐鹽性較野生型苗有顯著的提高，這說(shuō)明本發(fā)明的基因不僅具有抗菌活性，同時(shí)在耐鹽性上也有較好的效果。另外，在炭疽病抗性檢測(cè)中，結(jié)果也與黃龍病結(jié)果基本相同，序列2蛋白對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病率僅為9.2％，其余突變結(jié)果也基本相似在此不一一贅述。上面通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，本發(fā)明并不限于此處所列出的實(shí)施例，其保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，下面的實(shí)施例僅僅是以示例的方式說(shuō)明本發(fā)明，以使本發(fā)明更易于理解。序列表〈110〉陳帥〈120〉wrky轉(zhuǎn)錄因子在制備抗逆轉(zhuǎn)基因甜橙中的應(yīng)用〈160〉2〈210〉1〈211〉876〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉wrky-n1atgagagatagtagcaaagagaaatcggatcgaggccagtcgagctggaagctaggggag61ccaccggacgcgggctgcgtgagttatattttgagcgagtttggatggaatctggaagag121agagagagttcgaccagctacttcgctgctgatcatgaaagatccgatttggcgggaaat181atcagcagcagttttccggccgaaactactactgacggtggcggtttgacaaatcctgga241aggtctgctgacgtgtcgacttcgaatccgtcggtttcgtcgagctccagcgaggatccg301acggagaagtctacgggctccggcggtaaacctcctgagataccaagcaaagcaagagga361aaaggacaaaagcgaattcggcagccacgttttgcatttatgaccaagagtgaagttgat421caccttgaagatggatacagatggcgaaagtatggtcagaaggctgtaaaaaatagtccg481agacctaggagctactaccgctgcacaaacagtaaatgtacagtgaagaagagggaagaa541cgatcatctgaagatcccaccattgtaattactacgtatgaaggtcaacactgccatgga601accgttggatttcctcgtggtggactaattaatcatgaagcagctgcttttgctgaacat661ttgactcacgcaatcccaccatattattatcatcaaggagttcagataacccaagaaaga721cccggtatcaagcagcagtcacatgaagaagaattaatcccagttgaagcaagagaagga781gaaccaaatgcgttgcccgaaccaccagccttaccaccccccacggatgaaggaagacta841ggagatattgtgcctcctgggatgcgcaatagatga〈210〉2〈211〉291〈212〉prt〈213〉人工序列〈400〉wrky-n1mrdsskeksdrgqsswklge21ppdagcvsyilsefgwnlee41resstsyfaadhersdlagn61isssfpaetttdgggltnpg81rsadvstsnpsvsssssedp101tekstgsggkppeipskarg121kgqkrirqprfafmtksevd141hledgyrwrkygqkavknsp161rprsyyrctnskctvkkree181rssedptivittyegqhchg201tvgfprgglinheaaafaeh221lthaippyyyhqgvqitqer241pgikqqsheeelipveareg261epnalpeppalppptdegrl281gdivppgmrnr*當(dāng)前第1頁(yè)12