本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因——GmNTL1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物暴露在自然環(huán)境當(dāng)中，經(jīng)常受到各種環(huán)境脅迫的影響，比如干旱、極端的溫度、養(yǎng)分缺乏和病蟲害等。這些環(huán)境脅迫不僅制約了植物的生長發(fā)育，同時(shí)也導(dǎo)致了糧食作物的減產(chǎn)。高等植物自身生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)是通過調(diào)控目的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。而轉(zhuǎn)錄因子和基因順式作用元件的相互作用，可以作為基因表達(dá)調(diào)控的分子開關(guān)。正是轉(zhuǎn)錄因子與抗逆功能基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的相互作用激活了抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高了植物的綜合抗逆性。有一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子，因其含有一段跨膜區(qū)被稱為膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Membrane-bound transcription factors,MTFs)。膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子直接整合在細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)上(如細(xì)胞質(zhì)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)，處于休眠狀態(tài)，當(dāng)受到外界環(huán)境變化刺激后，膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子便從膜上釋放，轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)行使功能。

MTFs在酵母、原核生物和動(dòng)植物中均已被發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)其可通過激活目的基因的表達(dá)來行使多種功能。值得注意的是，大部分的植物膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)上發(fā)揮著重要的作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，繼2006年Kim等首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族存在MTFs類型，并命名為NTM1(NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF 1)以來，目前在植物中，已有9個(gè)NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的功能已被發(fā)掘和報(bào)道。如表1：

表1植物膜NAC結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的功能

自從植物膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子首次發(fā)現(xiàn)至今，人們對(duì)膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，涉及到植物生長發(fā)育、激素信號(hào)響應(yīng)等多個(gè)方面。尤其值得關(guān)注的是，膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的抗病性、抗寒性、抗旱性和耐鹽性等逆境適應(yīng)均具有十分重要的調(diào)控作用。但目前對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控機(jī)制的研究尚缺乏突破性的研究成果，并且多集中在模式植物擬南芥中。經(jīng)檢索，目前還未見大豆NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)功能的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前的技術(shù)狀況，本發(fā)明的目的是提供一種大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因——GmNTL1及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于：所述基因命名為大豆威廉姆斯82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1，該基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明還提供了一種含有上述大豆威廉姆斯82中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述植物表達(dá)載體命名為表達(dá)載體pK2GW7::GmNTL1，該表達(dá)載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

或者，本發(fā)明還提供了一種含有上述大豆威廉姆斯82中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述植物表達(dá)載體命名為表達(dá)載體pB2GW7::GmNTL1，該表達(dá)載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因在提高植株鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用。

其中：所述植株優(yōu)選是大豆或擬南芥。進(jìn)一步的，所述擬南芥是Col-0野生型，大豆品種是魯豆11。

本發(fā)明中，申請(qǐng)人從大豆Williams 82中分離得到NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因—GmNTL1，將該基因轉(zhuǎn)到模式植物擬南芥中證明其功能，然后將該基因再轉(zhuǎn)到原植株大豆中，結(jié)果得到了耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植株。

具體的，大豆威廉姆斯82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1在擬南芥或大豆植株中表達(dá)GmNTL1應(yīng)用的例證。

申請(qǐng)人首先在Williams 82植株中克隆到了NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1；利過Gateway系統(tǒng)將GmNTL1基因通過BP反應(yīng)連接到pDONR221載體上(見圖1)，然后通過轉(zhuǎn)化的方法在大腸桿菌DH5α中得到大量克隆，接著進(jìn)行LR反應(yīng)把此基因GmNTL1連接到表達(dá)載體pK2GW7(見圖2)或pB2GW7(見圖3)上，并在大腸桿菌DH5α中表達(dá)；接著篩選轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，并提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，最后將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中。將轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)入擬南芥和大豆中，驗(yàn)證表達(dá)了基因GmNTL1的功能。

本發(fā)明的有益效果是：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了Williams82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因并在擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了非轉(zhuǎn)基因擬南芥所不具備的高鹽脅迫耐受性的能力。同時(shí)通過大豆萌動(dòng)胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法將該基因轉(zhuǎn)入大豆中，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有很大提高。充分證明了本發(fā)明所述的大豆威廉姆斯82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1在提高植株鹽脅迫耐受性中具有重要的作用，預(yù)示本發(fā)明所述的基因可廣泛用于培育耐鹽的植物品種。

附圖說明

圖1為入門載體pDONR221圖譜。

圖2為植物表達(dá)載體pK2GW7圖譜。

圖3為植物表達(dá)載體pB2GW7圖譜。

圖4為Williams 82NAC轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1的CDS全長克隆電泳圖，

其中：M為Marker，泳道1、2、3、4為基因的CDS全長克隆。

圖5為35S::GmNTL1轉(zhuǎn)基因的擬南芥純系篩選。

圖6為Williams 82NAC轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中RT-PCR表達(dá)分析。

圖7為35S::GmNTL1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在0、50、100、150、200mmol/L NaCl條件下的抗鹽性分析；

其中：A：0mM NaCl條件下；B：50mM NaCl條件下；C：100mM NaCl條件下；D：150mM NaCl條件下；E：200mM NaCl條件下。

圖8為35S::GmNTL1轉(zhuǎn)基因大豆再生植株，其中：A：T0代轉(zhuǎn)基因植株；B：T1代轉(zhuǎn)基因植株；C：T2代轉(zhuǎn)基因植株。

圖9為Williams 82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1轉(zhuǎn)魯豆11的PCR檢測圖，

其中：上圖為35S-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，下圖為35S-F+GmNTL1-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；

泳道M為Marker，泳道陽性對(duì)照為陽性質(zhì)粒對(duì)照；泳道陰性對(duì)照為陰性植株對(duì)照；上圖中：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9均為轉(zhuǎn)GmNTL1轉(zhuǎn)基因陽性植株。下圖中：泳道1、2、3、4、5、6、8為轉(zhuǎn)GmNTL1轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖10為Williams 82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1轉(zhuǎn)魯豆11的Southern blot分析圖，

其中：泳道M為Marker，泳道“+”為陽性質(zhì)粒對(duì)照；泳道“-”為陰性植株對(duì)照；泳道“1、2、3、4”均為GmNTL1轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖11為35S::GmNTL1轉(zhuǎn)基因大豆植株的耐鹽性分析，WT為陰性植株對(duì)照，1、2為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

其中：左圖為0mM NaCl處理下的表型，右圖為150mM NaCl處理下的表型。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、GmNTL1的克隆

1.1Williams 82總RNA的提取

(1)將Williams 82植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末(直接應(yīng)用于下面的實(shí)驗(yàn)或者凍于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；

(2)等液氮揮發(fā)后，立即將100-200mg植物粉末轉(zhuǎn)入到1.5ml離心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.9ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.4ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)15次混勻溶液，室溫放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，用1ml 75％的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，8,000rpm，離心5min；

(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺(tái)中上干燥RNA約2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度計(jì)測RNA樣品的OD值和濃度，A₂₆₀/A₂₈₀達(dá)到1.7-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質(zhì)量。

1.2RNA的反轉(zhuǎn)錄

(1)向離心管中依次加入下列物質(zhì)(40μl反應(yīng)體系)：

(2)輕輕混勻后，65℃變性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向離心管中依次加入下列物質(zhì)

(4)輕輕混勻后，42℃恒溫水浴1h，65℃變性10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3GmNTL1基因克隆

GmNTL1OX-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGATGGGTGCCGTCGTC-3’

GmNTL1OX-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

(1)高保真酶Primer Star進(jìn)行Gateway系統(tǒng)的第一步擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下(50μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2)克隆基因片段的純化回收(天根試劑盒)

1)將切下帶有目的片段的凝膠放入1.5ml離心管并稱凝膠重量，加入3倍體積的溶膠液，60℃溶膠10min，溶膠期間不斷的翻轉(zhuǎn)；

2)凝膠完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室溫，12000rpm，離心30Sec，棄溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

6)空柱，12000rpm，離心2min；

7)回收柱開蓋晾干1-2min，放入新的干凈的1.5ml離心管，加入60℃預(yù)熱的40μl滅菌水或者EB緩沖液，放置2min；

8)12000rpm離心1min，所得溶液即為回收片段。

(3)高保真酶Primer Star進(jìn)行Gateway系統(tǒng)的第二步擴(kuò)增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反應(yīng)體系如下(50μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖4。

1.4克隆基因片段的BP反應(yīng)

BP反應(yīng)(Gateway系統(tǒng))體系如下：

25℃反應(yīng)8小時(shí)-過夜。

1.5大腸桿菌感受態(tài)的制備(無菌操作)

(1)取DH5α菌種接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜；

(2)按1:100接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時(shí)，至OD₆₀₀值為0.4-0.6；

(3)將菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，離心10min，棄上清，加入10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl₂懸浮菌體；

(5)將菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，離心10min，棄上清，加入2ml預(yù)冷的0.1M的CaCl₂懸浮菌體，分裝于1.5ml離心管中，現(xiàn)用或加入終體積30％甘油經(jīng)液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(無菌操作)

(1)將1-5μl質(zhì)粒DNA或者連接產(chǎn)物加入50μl的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)42℃，溫水浴熱激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)40-50min；

(4)室溫，4000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.7大腸桿菌PCR驗(yàn)證

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8DNA測序

挑取含有重組質(zhì)粒的陽性單菌落用含有Kan(25mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到測序結(jié)果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

經(jīng)過序列分析，上述cDNA序列與大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次實(shí)驗(yàn)證明得到的就是Willms82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為GmNTL1，所述基因GmNTL1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

(1)挑取單克隆接種于10ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h；

(2)室溫，12,000rpm，離心1min，收集菌體；

(3)棄上清，加入100μl低溫預(yù)冷的溶液I，振蕩懸浮菌體；

(4)加200μl新鮮配制的溶液II，快迅翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低溫預(yù)冷的溶液III，輕輕混勻后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，離心10min，吸取上清至新的1.5ml離心管中；

(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，振蕩混勻；

(8)室溫，12,000rpm，離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相于另一新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，再抽提一次，振蕩混勻；

(9)室溫，12,000rpm，離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相于另一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻并于-20℃放置30min；

(10)室溫，12,000rpm，離心10min，棄上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗滌沉淀兩次，真空干燥5min，溶于40μl滅菌水，放至-20℃保存?zhèn)溆谩?.10克隆基因片段的LR反應(yīng)

LR反應(yīng)(Gateway系統(tǒng))體系如下：

25℃反應(yīng)8小時(shí)。

1.11大腸桿菌感受態(tài)的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(同1.5、1.6)

1.12大腸桿菌PCR驗(yàn)證(同1.7)

1.13大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(同1.9)

驗(yàn)證轉(zhuǎn)入pK2GW7載體的陽性pK2GW7::GmNTL1質(zhì)粒的克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

驗(yàn)證轉(zhuǎn)入pB2GW7載體的陽性pB2GW7::GmNTL1質(zhì)粒的克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

1.14農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(無菌操作)

(1)取農(nóng)桿菌GV3101菌種接種于10ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜；

(2)按1：50接種于50ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)，至OD₆₀₀值為0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，離心10min，收集菌體；

(4)棄上清，加入10ml預(yù)冷的0.15mol/L的NaCl懸浮菌體；

(5)重復(fù)步驟3；

(6)棄上清，加入2ml預(yù)冷的20mmol/L的CaCl₂懸浮菌體，分裝于1.5ml離心管中，現(xiàn)用或加入終體積7％DMSO經(jīng)液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.15農(nóng)桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(無菌操作)

(1)將10μl質(zhì)粒DNA加入50μl的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)液氮速凍1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2-4h；

(4)室溫，4,000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)平板上，28℃倒置培養(yǎng)48h。

1.16轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR驗(yàn)證

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

實(shí)施例2、在擬南芥中表達(dá)Williams 82NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1的功能驗(yàn)證

2.1花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥

(1)擬南芥(Col-0野生型)生長至抽苔1cm時(shí)，將頂端減掉以誘導(dǎo)側(cè)生花序的生成；

(2)在轉(zhuǎn)化前一天，取1ml活化過的含有表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101加到含相應(yīng)抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為1.0-1.2；

(3)室溫，4,200rpm,離心10min，收集菌體，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重懸菌體，使OD₆₀₀約為0.8；

(4)用移液器將農(nóng)桿菌滴到花序上進(jìn)行浸染，待所有花序都被侵染后，將擬南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鮮袋覆蓋花序，至于20-22℃避光培養(yǎng)一天剪開頂部露出花序，再培養(yǎng)一天后揭去保鮮袋，培養(yǎng)至種子成熟。

2.2擬南芥種子的表面消毒

將適量待滅菌的擬南芥中子放入1.5ml離心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％體積比的TritonX-100)震蕩消毒1min，再用70％的乙醇震蕩消毒1min(兩次)，最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點(diǎn)入培養(yǎng)基中。

2.3轉(zhuǎn)基因植株的篩選

對(duì)收獲的T0代種子進(jìn)行表面消毒，然后后均勻涂布于1/2MS平板上(含相應(yīng)的抗生素Baste)。春化處理3d后移入人工氣候室生長。萌發(fā)約10天，子葉深綠色的植株為轉(zhuǎn)基因植株，而子葉發(fā)淺綠甚至黃化的植株為非轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入土中生長直至收獲得到T1代轉(zhuǎn)基因種子，T1代植株單株收種子，每株收取的種子繼續(xù)篩選，將后代分離比為3∶1(陽性∶陰性)的陽性植株移栽后生長至收獲T2代轉(zhuǎn)基因種子，單株收種后，每株收取的種子經(jīng)篩選可以得到純系T2代轉(zhuǎn)基因種子，見圖5。

2.4植物RNA的提取

(1)將植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末(直接應(yīng)用于下面的實(shí)驗(yàn)或者凍于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；

(2)等液氮揮發(fā)后，立即將100-200mg植物粉末轉(zhuǎn)入到1.5ml離心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.9ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.4ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)15次混勻溶液，室溫放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，用1ml 75％的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，8,000rpm，離心5min；

(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺(tái)中上干燥RNA約2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度計(jì)測RNA樣品的OD值和濃度，A₂₆₀/A₂₈₀達(dá)到1.7-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質(zhì)量。

2.5RNA的反轉(zhuǎn)錄

(1)向離心管中依次加入下列物質(zhì)(40μl反應(yīng)體系)：

(2)輕輕混勻后，65℃變性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向離心管中依次加入下列物質(zhì)

(4)輕輕混勻后，42℃恒溫水浴1h，65℃變性10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6轉(zhuǎn)基因植株的RealTime-PCR檢測

PCR法篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株：將具有抗性的植株的cDNA用GmNTL1基因RT-PCR引物進(jìn)行PCR檢測。

GmNTL1基因RT-PCR引物序列：

GmNTL1RT-F：5’-GCCGTTAGGGTTCCGTTTC-3’

GmNTL1RT-R：5’-AAGGCTCCCATTTGCAGACA-3’

普通Taq酶進(jìn)行RealTime-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)如下(15μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

注：內(nèi)標(biāo)基因選用GmTUB。

結(jié)果見圖6。

2.7甘露醇和NaCl處理擬南芥

(1)擬南芥種子的表面消毒(同2.2)。

(2)甘露醇和NaCl處理

將滅了菌的Col-0、GmNTL1-1、Gm NTL1-2種子分別均勻涂布于1/2MS平板上(含相應(yīng)的抗生素Baste)。春化處理3天后移入人工氣候室生長。萌發(fā)約4d，根長至1cm左右，將擬南芥小苗移至添加不同濃度的甘露醇(250、300、350、400mmol/L)或NaCl(50、100、150、200mmol/L)的1/2MS培養(yǎng)基平板上。待小苗長至11d，觀察小苗生長狀況。

結(jié)果見圖7。

實(shí)施例3、在大豆中表達(dá)Williams 82NAC轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1的功能驗(yàn)證

3.1大豆萌動(dòng)胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大豆

(1)種子消毒及預(yù)培養(yǎng)處理

將大豆種子用70％乙醇消毒5min，去凈乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10min，無菌水沖洗5-6遍，在25℃-28℃下無菌水浸種12h。

將浸種后胚膨大萌動(dòng)的大豆放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，28℃、光培養(yǎng)1d，其中所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(2)種子胚膨大萌動(dòng)后經(jīng)切割，暴露或損傷萌動(dòng)胚部位

當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的大豆胚整體膨大、胚根長至0.5±0.1mm，未突破種皮時(shí)，剝?nèi)シN皮，切去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時(shí)用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖。

(3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染萌動(dòng)胚

將4℃保存的帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在添加了50mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng)基上劃線，28℃黑暗培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基，黑暗下28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16h。將菌液置于滅菌的離心管中，5,000rpm離心5分鐘收集菌體，用侵染液重懸菌體，調(diào)整至OD₆₀₀值為0.6，加入30mg/L乙酰丁香酮備用。其中所述侵染液配方為：0.1MS大量+0.1MS微量+B5維生素+0.5MES+1％葡萄糖+2％蔗糖，pH5.4。

將步驟(2)的大豆浸入農(nóng)桿菌菌液中，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8min，黑暗下28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，侵染15-20min。

(4)共培養(yǎng)

將步驟(3)的大豆取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃-28℃下暗培養(yǎng)4天。其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選

將共培養(yǎng)后的大豆用無菌水清洗4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25℃、且每日光照14h條件下，每兩周換至新的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20±2d，分化出叢生芽。其中所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基配方為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L IAA(吲哚乙酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

選篩選后長至1-2cm的叢生芽，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上，在25℃、且每日光照14±1h條件下，連續(xù)培養(yǎng)14d。其中所述生根篩選培養(yǎng)基配方為：MS+0.4mg/L IBA(乙哚丁酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(6)小苗壯苗及移栽

選根系生長良好的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，在25℃且每日光照14小時(shí)條件下，培養(yǎng)7-10d。當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng)基移入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。其中所述壯苗培養(yǎng)基配方為：MS+2.0mg/L KT(激動(dòng)素)+0.4mg/L NAA(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8，見圖8。

3.2CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA

稱取0.5g的再生植株葉片，剪碎后用液氮研磨，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，然后加入700μl預(yù)熱至65℃的2xCTAB提取緩沖液及0.1％的疏基乙醇，輕輕顛倒離心管混勻，然后置于65℃水浴保溫2h，不時(shí)顛倒混勻。混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚：氛仿：異戊醇(25∶24∶1)，4℃下10,000g離心10min。將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，4℃下10000g離心10min。將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入兩倍體積無水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入100ul TE液溶解，37℃水浴30min。加入200μl無水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入40μl無菌水溶解DNA，4℃保存待用。

3.3PCR和Sothern blot檢測轉(zhuǎn)基因植株

3.3.1PCR法檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株

抗性植株總DNA分別用35S啟動(dòng)子引物、GmNTL1基因引物和連有GmNTL1基因片段和植株表達(dá)載體片段的序列引物進(jìn)行PCR檢測。

35S片段啟動(dòng)子引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

35S-R：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’

GmNTL1基因引物序列：

Gm NTL1-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGATGGGTGCCGTCGTC-3’

Gm NTL1-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

35S啟動(dòng)子F+GmNTL1基因R引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

Gm NTL1-R：5’-AGAAAGCTGGGTTTTAAGATCTGACATATGCCCA-3’

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖9。

3.3.2Sothern blot雜交驗(yàn)證

選取3株陽性植株(GmNTL1OX-1、GmNTL1OX-2、GmNTL1OX-3)進(jìn)行Sothern blot雜交驗(yàn)證。步驟如下：

(1)CTAB法提取陽性植株，野生型植株DNA

(2)EcoRI酶切陽性植株和野生型植株DNA，電泳

(3)轉(zhuǎn)膜

①堿變性：室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中30min。變性液：0.5mol/L NaOH；1.5mol/L NaCl。

②中和：將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液15min。中和液：1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)；1.5mol/L NaCl；

③轉(zhuǎn)移：按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標(biāo)記，水浸濕后，浸入轉(zhuǎn)移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。進(jìn)行轉(zhuǎn)移。(轉(zhuǎn)移過程一般需要8-24h，每隔數(shù)小時(shí)換掉已經(jīng)濕掉的紙巾。轉(zhuǎn)移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個(gè)操作過程中要防止膜上沾染其他污物)轉(zhuǎn)移液(20×SSC)：NaCl 175.3g；檸檬酸三鈉82.2g，NaOH調(diào)pH至7.0，加ddH2O至1,000ml。

④轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液數(shù)分鐘，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80℃烘2h，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。

(4)按照Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II說明書標(biāo)記GmNTL1，并進(jìn)行雜交及檢測。

檢測發(fā)現(xiàn)所選的GmNTL1轉(zhuǎn)基因植株(GmNTL1OX-1、GmNTL1OX-2、GmNTL1OX-3)的基因組均整合了目的基因，見圖10。

3.4轉(zhuǎn)基因大豆植株的耐鹽性分析

Tl代轉(zhuǎn)基因大豆種子與對(duì)照種子經(jīng)浸種催芽后，分別移栽到塑料缽(1/2Hogland液體培養(yǎng)基)中，在室溫25℃條件下，使其生長2周后，長至兩葉一心期用含有NaCl 50rnmol/L的1/2Hogland液體培養(yǎng)基澆灌，為避免鹽沖擊效應(yīng)，濃度以每天遞增25rnrnol/L的方式加鹽，直至處理預(yù)定濃度250rnmol/L，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株表型進(jìn)行觀察。見圖11。

1/2Hogland液體培養(yǎng)基配方：