本申請請求申請日為2015年5月19日，名稱為“EPHA2基因突變型及其應用”的中國專利申請201510254801.5的優(yōu)先權和權益，其完整內容通過參照在此并入。

技術領域

本發(fā)明涉及生物領域，具體的，本發(fā)明涉及突變檢測領域，更具體的，本發(fā)明涉及一種突變型EPHA2基因、突變型EPHA2基因編碼的多肽、突變型EPHA2基因和/或其編碼的多肽的用途、篩查先天性白內障生物樣本的方法、篩查先天性白內障生物樣本的系統以及篩查先天性白內障生物樣本的試劑盒。

背景技術：

白內障是由于各種原因如老化，遺傳，局部營養(yǎng)障礙，免疫與代謝異常，外傷，中毒，輻射等，引起晶狀體代謝紊亂，導致晶狀體蛋白質變性而發(fā)生混濁，白內障的患者會發(fā)生視力下降，嚴重的可能會失明。白內障可以是先天性的，也可以是后天性的，先天性白內障多在出生前后即已存在，可伴有遺傳性疾病，主要分為前極白內障，后極白內障，繞核性白內障及全白內障。

先天性白內障的發(fā)病率約為1-6/10000人[Apple DJ,Ram J,Foster A,Peng Q(2000)Elimination of cataract blindness:a global perspective entering the new millenium.Surv Ophthalmol 45Suppl 1:S1–196.]，是導致兒童期失明的重要因素，大約1/3的先天性白內障是遺傳因素引起的，其遺傳模式主要是常染色體顯性遺傳，也有一些隱性遺傳和X連鎖遺傳的案例被報道[Huang B,He W.Molecular characteristics of inherited congenital cataracts.Eur J Med Genet 2010；53:347-57.]。白內障的發(fā)生可能與晶狀體的透明度和折射率的改變、營養(yǎng)和細胞通訊，細胞結構、運動性、形狀，晶狀體發(fā)育異常等因素有關。先天性白內障有較高的遺傳異質性，目前已報道的可導致先天性白內障的基因超過40個，EPHA2是其中的一個既有顯性遺傳模式又有隱性遺傳模式的基因，EPHA2基因位于1號染色體短臂，由18個外顯子組成，該基因在發(fā)育中起作用，特別是神經系統的發(fā)育，該基因上的一些突變已經報道會導致先天性白內障。雖然已經發(fā)現了40多個基因上很多突變會導致先天性白內障，但是仍有許多患者病因未明，對先天性白內障的研究仍有待深入。

技術實現要素：

本發(fā)明是基于發(fā)明人檢測發(fā)現鑒定出先天性白內障致病基因的一個新的剪切位點突變而作出的。

依據本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種突變型EPHA2基因，其具有SEQ ID NO：1所示的序列。根據本發(fā)明的一個實施例，所述SEQ ID NO：1所示的序列是分離出來的，其可以通過使野生型EPHA2基因產生c.2825+1G>A突變形成。檢測該突變型基因，可以篩查出先天性白內障生物樣本，可用于早期篩查先天性白內障致病突變攜帶者，進而在攜帶者發(fā)病之前進行早期干預治療，也可用于先天性白內障患者的分子診斷及與相關疾病的鑒別診斷，還可以用于先天性白內障治療藥物的制備開發(fā)。檢測該突變型基因以檢測篩查先天性白內障具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優(yōu)點，檢測結果可以為先天性白內障的早期診斷、鑒別診斷及治療藥物的開發(fā)制備提供科學依據。

依據本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供上述基因在先天性白內障的早期篩查、診斷和/或制備治療先天性白內障藥物中的用途。檢測該突變型基因，可以篩查出先天性白內障生物樣本，可用于早期篩查先天性白內障致病突變攜帶者，進而在攜帶者發(fā)病之前進行早期干預治療，也可用于先天性白內障患者的分子診斷及與相關疾病的鑒別診斷，還可以用于先天性白內障治療藥物的制備開發(fā)。檢測該突變型基因以檢測篩查先天性白內障具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優(yōu)點，檢測結果可以為先天性白內障的早期診斷、鑒別診斷及治療藥物的開發(fā)制備提供科學依據。

依據本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供上述任一基因編碼的多肽。根據本發(fā)明的一個實施例，該多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。任選的，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是由于野生型EPHA2蛋白發(fā)生p.D942E*形成的。檢測該突變型基因編碼的多肽/蛋白，可以篩查出先天性白內障生物樣本，可用于早期篩查先天性白內障致病突變攜帶者，進而在攜帶者發(fā)病之前進行早期干預治療，也可用于先天性白內障患者的分子診斷及與相關疾病的鑒別診斷，還可以用于先天性白內障的治療藥物的制備開發(fā)。檢測該突變型基因編碼的蛋白以檢測篩查先天性白內障具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優(yōu)點，檢測結果可以為先天性白內障的早期診斷、鑒別診斷及治療藥物的開發(fā)制備提供科學依據。

依據本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供上述任一多肽在先天性白內障的早期篩查、診斷和/或制備治療先天性白內障藥物中的用途。

依據本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的方法，該方法包括以下步驟：獲取所述生物樣本的核酸；對所述核酸中的包含EPHA2基因的區(qū)域 進行序列測定，獲得目標序列；將所述目標序列與上述任一突變型EPHA2基因進行比較，兩者一致指示所述生物樣本為先天性白內障生物樣本。根據本發(fā)明的一個實施例，所述對核酸中的包含EPHA2基因的區(qū)域進行序列測定，獲得目標序列，包括：利用引物擴增所述核酸，獲得擴增產物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，對所述擴增產物進行序列測定，以獲得目標序列。通過本發(fā)明這一方面或者任一實施例中的篩查先天性白內障的生物本品的方法，可以有效、高效地篩選出先天性白內障生物樣本。

依據本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的系統，該系統用以實施上述本發(fā)明一方面或者任一實施例中的篩查方法的全部或部分步驟，該系統包括：核酸獲取裝置，用于獲取所述生物樣本的核酸；序列測定裝置，與所述核酸獲取裝置相連，用于對所述核酸獲取裝置中的核酸中的包含EPHA2基因的區(qū)域進行序列測定，以獲得目標序列；序列比較裝置，與所述序列測定裝置相連，用于將所述序列測定裝置中的目標序列與上述本發(fā)明一方面中的突變型EPHA2基因進行比較，用以指示兩者一致時的生物樣本為先天性白內障生物樣本。根據本發(fā)明的一個實施例，所述序列測定裝置包含擴增單元，所述擴增單元與所述核酸獲取裝置相連，用以利用引物擴增所述核酸獲取裝置中的核酸，獲得擴增產物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。通過本發(fā)明這一方面或者任一實施例中的篩查先天性白內障的生物本品的系統，可以有效、高效地篩選出先天性白內障生物樣本。

依據本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的試劑盒，該試劑盒包括：適于檢測上述本發(fā)明一方面任一實施例中的突變型EPHA2基因的試劑。試劑可以是探針、芯片、引物和/或突變型EPHA2基因的基因組DNA或cDNA的至少一部分，根據本發(fā)明的一個實施例，該試劑盒包括：序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物；任選的，該試劑盒還包括測序試劑。利用本發(fā)明這一方面或者任一實施例中的試劑盒，能夠有效、高效地篩查出先天生物樣品。

本發(fā)明的基因的新突變的發(fā)現檢測利用了全外顯子組測序技術，全外顯子組測序技術是利用DNA序列探針將全基因組中的外顯子區(qū)域捕獲下來，然后針對每個外顯子進行深度測序的技術。相比于連鎖定位和已知基因掃描，該技術更加方便、快捷、高效，特別是對于遺傳異質性較高的疾病，有利于推動相關疾病診斷及治療的研究進展。

本發(fā)明的基因的新突變的檢測鑒定采用了新一代的全外顯子組測序技術，基于對一個5代先天性白內障家系進行了全基因組外顯子組測序分析，發(fā)現一個先天性白內障致病基因EPHA2的新的雜合突變。本發(fā)明鑒定出的新突變豐富了EPHA2基因的致病突變 圖譜，進一步闡明了先天性白內障的分子發(fā)病機制，為先天性白內障的早期致病基因篩查和干預治療提供科學依據。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施方式的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1是本發(fā)明的一個實施例中的篩查先天性白內障生物樣本的方法的流程圖。

圖2是本發(fā)明的一個實施例中的篩查先天性白內障生物樣本的方法的流程圖。

圖3是本發(fā)明的一個實施例中的篩查先天性白內障生物樣本的系統的結構示意圖。

圖4是本發(fā)明的一個實施例中的篩查先天性白內障生物樣本的系統的結構示意圖。

圖5是本發(fā)明的一個實施例中的家系圖。

圖6是本發(fā)明的一個實施例中的Sanger測序結果峰圖。

圖7是本發(fā)明的一個實施例中的Sanger測序結果峰圖。

圖8是本發(fā)明的一個實施例中的Sanger測序結果峰圖。

圖9是本發(fā)明的一個實施例中的Sanger測序結果峰圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中，自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的，本文中所使用的術語“第一”、“第二”或者“第一部分”等僅為方便描述，不能理解為指示或暗示相對重要性，也不能理解為之間有先后順序關系。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。在本文中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術語“相連”、“連接”等術語應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通。

根據本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明提供一種突變型EPHA2基因，其具有SEQ ID NO：1所示的cDNA序列。野生型EPHA2基因的cDNA和蛋白質序列可從以下網址獲得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi？REQUEST＝GV&DATA＝338422&BUILDS＝ALLBUILDS，EPHA2基因的突變型cDNA序列即SEQ ID NO：1顯示如下——ATGGAGCTCCAGGCAGCCCGCGCCTGCTTCGCCCTGCTGTGGGGCTGTGCGCTGGCCGCGGCCGCGGCGGCGCAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCGTATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACATGTACTCCGTGTGC AACGTGATGTCTGGCGACCAGGACAACTGGCTCCGCACCAACTGGGTGTACCGAGGAGAGGCTGAGCGTATCTTCATTGAGCTCAAGTTTACTGTACGTGACTGCAACAGCTTCCCTGGTGGCGCCAGCTCCTGCAAGGAGACTTTCAACCTCTACTATGCCGAGTCGGACCTGGACTACGGCACCAACTTCCAGAAGCGCCTGTTCACCAAGATTGACACCATTGCGCCCGATGAGATCACCGTCAGCAGCGACTTCGAGGCACGCCACGTGAAGCTGAACGTGGAGGAGCGCTCCGTGGGGCCGCTCACCCGCAAAGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGATATCGGTGCCTGTGTGGCGCTGCTCTCCGTCCGTGTCTACTACAAGAAGTGCCCCGAGCTGCTGCAGGGCCTGGCCCACTTCCCTGAGACCATCGCCGGCTCTGATGCACCTTCCCTGGCCACTGTGGCCGGCACCTGTGTGGACCATGCCGTGGTGCCACCGGGGGGTGAAGAGCCCCGTATGCACTGTGCAGTGGATGGCGAGTGGCTGGTGCCCATTGGGCAGTGCCTGTGCCAGGCAGGCTACGAGAAGGTGGAGGATGCCTGCCAGGCCTGCTCGCCTGGATTTTTTAAGTTTGAGGCATCTGAGAGCCCCTGCTTGGAGTGCCCTGAGCACACGCTGCCATCCCCTGAGGGTGCCACCTCCTGCGAGTGTGAGGAAGGCTTCTTCCGGGCACCTCAGGACCCAGCGTCGATGCCTTGCACACGACCCCCCTCCGCCCCACACTACCTCACAGCCGTGGGCATGGGTGCCAAGGTGGAGCTGCGCTGGACGCCCCCTCAGGACAGCGGGGGCCGCGAGGACATTGTCTACAGCGTCACCTGCGAACAGTGCTGGCCCGAGTCTGGGGAATGCGGGCCGTGTGAGGCCAGTGTGCGCTACTCGGAGCCTCCTCACGGACTGACCCGCACCAGTGTGACAGTGAGCGACCTGGAGCCCCACATGAACTACACCTTCACCGTGGAGGCCCGCAATGGCGTCTCAGGCCTGGTAACCAGCCGCAGCTTCCGTACTGCCAGTGTCAGCATCAACCAGACAGAGCCCCCCAAGGTGAGGCTGGAGGGCCGCAGCACCACCTCGCTTAGCGTCTCCTGGAGCATCCCCCCGCCGCAGCAGAGCCGAGTGTGGAAGTACGAGGTCACTTACCGCAAGAAGGGAGACTCCAACAGCTACAATGTGCGCCGCACCGAGGGTTTCTCCGTGACCCTGGACGACCTGGCCCCAGACACCACCTACCTGGTCCAGGTGCAGGCACTGACGCAGGAGGGCCAGGGGGCCGGCAGCAAGGTGCACGAATTCCAGACGCTGTCCCCGGAGGGATCTGGCAACTTGGCGGTGATTGGCGGCGTGGCTGTCGGTGTGGTCCTGCTTCTGGTGCTGGCAGGAGTTGGCTTCTTTATCCACCGCAGGAGGAAGAACCAGCGTGCCCGCCAGTCCCCGGAGGACGTTTACTTCTCCAAGTCAGAACAACTGAAGCCCCTGAAGACATACGTGGACCCCCACACATATGAGGACCCCAACCAGGCTGTGTTGAAGTTCACTACCGAGATCCATCCATCCTGTGTCACTCGGCAGAAGGTGATCGGAGCAGGAGAGTTTGGGGAGGTGTACAAGGGCATGCTGAAGACATCCTCGGGGAAGAAGGAGGTGCCGGTGGCCATCAAGACGCTGAAAGCCGGCTACACAGAGAAGCAGCGAGTGGACTTCCTCGGCGAGGCCGGCATCATGGGCCAGTTCAGCCACCACAACATCATCCGCCTAGAGGGCGTCATCTCCAAATACAAGCCCATGATGATCATCACTGAGTACATGGAGAATGGGGCCCTGGACAAGTTCCTTCGGGAGAAGGATGGCGAGTTCAGCGTGCTGCAGCTGGTGGGCATGCTGCGGGGCATCGCAGCTGGCATGAAGTACCTGGCCAACATGAACTATGTGCACCGTGACCTGGCTGCCCGCAACATCCTCGTCAACAGCAACCTGGTCTGCAAGGTGTCTGACTTTGGCCTGTCCCGCGTGCTGGAGGACGACCCCGAGGCCACCTACACCACCAGTGGCGGCAAGATCCCCATCCGCTGGACCGCCCCGGAGGCCATTTCCTACCGGAAGTTCACCTCTGCCAGCGACGTGTGGAGCTTTGGCATTGTCATGTGGGAGGTGATGACCTATGGCGAGCGGCCCTACTGGGAGTTGTCCAACCACGAGGTGATGAAAGCCATCAATGATGGCTTCCGGCTCCCCACACCCATGGACTGCCCCTCCGCCATCTACCAGCTCATGATGCAGTGCTGGCAGCAGGAGCGTGCCCGCCGCCCCAAGTTCGCTGACATCGTCAGCATCCTGGACAAGCTCATTCGTGCCCCTGACTCCCTCAAGACCCTGGCTGACTTTGACCCCCGCGTGTCTATCCGGCTCCCCAGCACGAGCGGCTCGGAGGGGGTGCCCTTCCGCACGGTGTCC GAGTGGCTGGAGTCCATCAAGATGCAGCAGTATACGGAGCACTTCATGGCGGCCGGCTACACTGCCATCGAGAAGGTGGTGCAGATGACCAACGAATAA。

根據本發(fā)明的一個實施例，所述SEQ ID NO：1所示的cDNA序列是由于野生型EPHA2基因發(fā)生c.2825+1G>A突變形成的。c.2825+1G>A表示野生型EPHA2基因cDNA序列的第2825位堿基后面1位內含子(內含子序列不出現在上述cDNA序列中)上的G突變成了A，造成了可變剪切，導致之后的cDNA序列發(fā)生了變化，即表現在上述cDNA序列中之后的106個堿基被ATAA(SEQ ID NO：1中加粗顯示)四個堿基替代。

發(fā)明人通過檢測分析發(fā)現，當在EPHA2基因突變型中出現c.2825+1G>A和/或p.D942E*突變時，檢測生物樣本的先天性白內障的效率更高。通過檢測具有該突變的EPHA2基因突變型在生物樣本中是否存在，可以準確有效地預測生物樣本所屬個體是否患有先天性白內障。需要說明的是，目前尚未有關于本發(fā)明提出的EPHA2基因的c.2825+1G>A突變導致先天性白內障的報道。

檢測該突變型基因，可以篩查出先天性白內障生物樣本，可用于早期篩查先天性白內障致病突變攜帶者，進而在攜帶者發(fā)病之前進行早期干預治療，也可用于先天性白內障患者的分子診斷及與相關疾病的鑒別診斷，還可以用于先天性白內障的治療藥物的開發(fā)。檢測該突變型基因以檢測篩查先天性白內障具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優(yōu)點，檢測結果可以為先天性白內障的早期診斷、鑒別診斷及治療藥物的開發(fā)提供科學依據。

根據本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明提供上述突變型基因在先天性白內障的早期篩查、診斷和/或制備先天性白內障治療藥物中的用途。

根據本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明提供上述任一實施例中的突變型基因編碼的多肽。

根據本發(fā)明的一個實施例，該多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。突變型EPHA2基因的氨基酸序列即SEQ ID NO：2顯示如下——MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHR RRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNE。

根據本發(fā)明的一個實施例，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是由于野生型EPHA2基因發(fā)生p.D942E*形成的。p.D942E*表示蛋白質序列(野生型編碼的蛋白)第942位的天冬氨酸被谷氨酸(SEQ ID NO：2以粗體顯示)替代，同時其后原有的氨基酸由于新的終止密碼子的出現而提前終止翻譯，造成了該蛋白質的截短。

發(fā)明人通過檢測分析發(fā)現，當在EPHA2基因突變型中出現c.2825+1G>A和/或p.D942E*突變時，檢測生物樣本的先天性白內障的效率更高。通過檢測具有該突變的EPHA2基因突變型在生物樣本中是否存在，可以準確有效地預測生物樣本所屬個體是否患有先天性白內障。需要說明的是，目前尚未有關于本發(fā)明提出的EPHA2基因的c.2825+1G>A和/或p.D942E*突變導致先天性白內障的報道。

檢測該突變型基因編碼的多肽/蛋白，可以篩查出先天性白內障生物樣本，可用于早期篩查先天性白內障致病突變攜帶者，進而在攜帶者發(fā)病之前進行早期干預治療，也可用于先天性白內障患者的分子診斷及與相關疾病的鑒別診斷，還可以用于先天性白內障的治療藥物的制備開發(fā)。檢測該突變型基因編碼的蛋白以檢測篩查先天性白內障具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優(yōu)點，檢測結果可以為先天性白內障的早期診斷、鑒別診斷及治療藥物的制備開發(fā)提供科學依據。

根據本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明提供上述任一實施例中的多肽在先天性白內障的早期篩查、診斷和/或治療藥物開發(fā)中的用途。

根據本發(fā)明的一個實施例，如圖1所示，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的方法，該方法包括以下步驟：S10獲取所述生物樣本的核酸；S20對所述核酸中的包含EPHA2基因的區(qū)域進行序列測定，獲得目標序列；S30將所述目標序列與上述任一突變型EPHA2基因進行比較，兩者一致指示所述生物樣本為先天性白內障生物樣本。所稱的兩者一致指序列一致，特別指突變序列一致，例如，與野生型cDNA相比，二者的cDNA序列的第2825位堿基之后的106個堿基均為ATAA。

根據本發(fā)明的一個實施例，如圖2所示，S20包括：S201利用引物擴增所述核酸，獲得擴增產物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，S203對所述擴增產物進行序列測定，以獲得目標序列。通過本發(fā)明的任一實施例中的篩查先天性白 內障的生物本品的方法，可以有效、高效地篩選出先天性白內障生物樣本。

根據本發(fā)明的一個實施例，如圖3所示，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的系統1000，該系統用以實施上述本發(fā)明一方面或者任一實施例中的篩查方法的全部或部分步驟，該系統包括：核酸獲取裝置100，用于獲取所述生物樣本的核酸；序列測定裝置200，與所述核酸獲取裝置100相連，用于對所述核酸獲取裝置100中的核酸中的包含EPHA2基因的區(qū)域進行序列測定，以獲得目標序列；序列比較裝置300，與所述序列測定裝置200相連，用于將所述序列測定裝置200中的目標序列與上述本發(fā)明一方面中的突變型EPHA2基因進行比較，用以指示兩者一致時的生物樣本為先天性白內障生物樣本。所稱的兩者一致指序列一致，特別指突變序列一致，例如，與野生型cDNA相比，二者的cDNA序列的第2825位堿基之后的106個堿基均為ATAA。

根據本發(fā)明的一個實施例，如圖4所示，所述序列測定裝置200包括：擴增單元210，所述擴增單元210與所述核酸獲取裝置100相連，用以利用引物擴增所述核酸獲取裝置100中的核酸，獲得擴增產物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；以及測序單元220，所述測序單元220與所述擴增單元210相連，用以對所述擴增單元210中的擴增產物進行序列測定，以獲得目標序列。通過本發(fā)明任一實施例中的篩查先天性白內障的生物本品的系統，可以有效、高效地篩選出先天性白內障生物樣本。

根據本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明提供一種篩查先天性白內障生物樣本的試劑盒，該試劑盒包括：適于檢測上述本發(fā)明一方面任一實施例中的突變型EPHA2基因的試劑。試劑可以是探針、芯片、引物和/或突變型EPHA2基因的基因組DNA或cDNA的至少一部分，根據本發(fā)明的一個實施例，該試劑盒包括：如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列；任選的，該試劑盒還包括測序試劑。利用本發(fā)明任一實施例中的試劑盒，能夠有效、高效地篩查出先天生物樣品。

本發(fā)明的基因的新突變的發(fā)現檢測利用了全外顯子組測序技術，全外顯子組測序技術是利用DNA序列探針將全基因組中的外顯子區(qū)域捕獲下來，然后針對每個外顯子進行深度測序的技術。相比于連鎖定位和已知基因掃描，該技術更加方便、快捷、高效，特別是對于遺傳異質性較高的疾病，有利于推動相關疾病診斷及治療的研究進展。

本發(fā)明的基因的新突變的檢測鑒定采用了新一代的全外顯子組測序技術，基于對一個5代先天性白內障家系進行了全基因組外顯子組測序分析，發(fā)現一個先天性白內障致病基因EPHA2的新的雜合突變。本發(fā)明鑒定出的新突變豐富了EPHA2基因的致病突變圖譜，進一步闡明了先天性白內障的分子發(fā)病機制，為先天性白內障的早期致病基因篩查和干預治療提供科學依據。

下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為可通過常規(guī)市售獲得。未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內容相同。

實施例一

1.樣本采集

發(fā)明人收集了一個中國安徽的先天性白內障家系，家系中的患者表現出先天性白內障的表型，呈常染色體顯性遺傳模式，家系圖如圖5所示，圖中實心的表示患者、空心的表示正常人，II1、III11、IV2和IV8是測了外顯子的樣本。我們采集了該家系部分成員的外周血，并提取DNA，選取其中的4個成員(3個患者，1個正常人)進行外顯子測序，所有提供血樣的參與人員均簽屬知情同意書，并獲得倫理委員會批準。

2.芯片設計、文庫構建和高通量測序

發(fā)明人用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0(NimbleGen,Madison,WI,USA)結合Solexa高通量測序技術對該家系中的4名成員的外顯子組序列進行了測序，具體如下：

1)利用捕獲芯片(NimbleGen SeqCap EZ Exome(44M))對基因組的外顯子、剪接位點和鄰近的內含子序列進行捕獲。

2)將基因組DNA隨機打斷成200-300bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭，制備文庫(參見http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa標準建庫說明書)。

3)文庫經純化后經過ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴增與custom capture array進行雜交富集，再經過LM-PCR的線性擴增后進行上機測序。測序平臺為Illumina Hiseq 2000，讀取長度為100bp。

3.變異檢測、注釋及與數據庫比較

1)測序后獲得的原始數據由Illumina basecalling Software 1.7進行處理。然后過濾低質量reads和包含接頭污染reads。使用Burrows–Wheeler Aligner(BWA)【H.Li and R.Durbin,Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform,Bioinformatics.,25(2009)1754-1760.】和Short Oligonucleotide Analysis Package(SOAPaligner 2.21)【R.Li,C.Yu,Y.Li,T.W.Lam,S.M.Yiu,K.Kristiansen,and J.Wang.SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment,Bioinformatics.,25(2009) 1966-1967.】將高質量reads比對到參考基因組(hg19)，獲得比對到基因組上的唯一比對reads。然后對SOAP比對的結果用SOAPsnp1.05【R.Li,Y.Li,X.Fang,H.Yang,J.Wang,K.Kristiansen,and J.Wang,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing,Genome Res.,19(2009)1124-1132.】進行SNP的檢測，對BWA比對的結果用Genome Analysis Tool Kit(GATK1.4)【M.A.DePristo,E.Banks,R.Poplin,K.V.Garimella,J.R.Maguire,C.Hartl,A.A.Philippakis,A.G.del,M.A.Rivas,M.Hanna,A.McKenna,T.J.Fennell,A.M.Kernytsky,A.Y.Sivachenko,K.Cibulskis,S.B.Gabriel,D.Altshuler,and M.J.Daly,A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data,Nat.Genet.,43(2011)491-498.】進行indel的檢測。

2)對于檢出的SNP和indel變異，我們進行注釋，即確定變異所處基因組環(huán)境，以及變異的類型。我們關注非同義突變，剪接受體/供體位點突變和編碼區(qū)插入和缺失突變這三類最有可能與疾病相關的突變。將檢出的變異和dbSNP數據庫、千人基因組數據庫和ESP數據庫等公共數據庫進行了比較，保留了低頻的變異(MAF≤0.01)。根據遺傳模式(常染色體顯性遺傳)，選取了患者中為突變雜合而正常人為野生純合的位點，基于上述過濾，我們對剩余的突變進行了已知基因的掃描，發(fā)現且僅發(fā)現EPHA2基因上有一個剪切位點突變，我們對該突變進行了Sanger驗證，4個成員的樣本的Sanger驗證結果如圖6所示。

3)通過以上分析，我們在患者的EPHA2基因上發(fā)現了未報道過的雜合突變c.2825+1G>A,p.D942E*，該突變在患者中是突變雜合，在正常人中是野生純合，我們后續(xù)對家系中其他成員的該位點進行了sanger驗證，該家系的其他成員的Sanger驗證結果如圖7-9所示，結果證明了該突變在家系中與疾病共分離。同時該突變在我們之前用同樣的外顯子捕獲探針測序的1000個外顯子數據庫中不存在。

突變說明：

c.2825+1G>A：cDNA第2825位堿基后面1位內含子(內含子序列不出現在cDNA序列中)上的G突變成了A，造成了可變剪切，導致之后的cDNA序列發(fā)生了很大變化(在此例中，導致之后的106個堿基被ATAA四個堿基替代)。

p.D942E*：蛋白質序列第942位的天冬氨酸被谷氨酸替代，同時其后原有的氨基酸由于新的終止密碼子的出現而提前終止翻譯，造成了蛋白質的截短。

實施例二

1.樣本制備

采集家系中成員外周血，利用常規(guī)酚-氯仿法抽提外周血白細胞中的基因組DNA，利用分光光度計測量DNA的濃度及純度，所得的每個標本基因組DNA的OD260/OD280 均位于1.7-2.0之間，濃度不少于200ng/μl，總量不少于30μg。

2.疾病突變位點檢測

分別對家系內測了外顯子的3個患者樣本和1個正常樣本以及其他愿意捐贈樣本的家系成員進行Sanger測序，包括引物設計，PCR擴增，產物純化，測序得到序列，根據序列測定結果屬于突變型還是野生型，驗證突變與先天性白內障之間的相關性。具體方法步驟如下：

1)DNA提取：

分別對參與研究人員的外周靜脈血按照實施例一的方法提取基因組DNA，分光光度計測DNA含量。

2)引物設計及PCR反應

引物設計參考人類基因組序列數據庫hg19/build36.3，具體見下。

a)引物序列：

正向引物：5'-CGGCACATAGCCCTCAGTAA-3'(SEQ ID NO：3)

反向引物：5'-GAGGGGCAGCAGTAGTTACA-3'(SEQ ID NO：4)

b)反應體系：25μL

c)反應條件：

3)將步驟2中獲得PCR擴增產物純化后用ABI的3730進行DNA測序。

在該家系中，患者均為致病突變的突變雜合體，正常人均為野生純合體。因此我們 認為EPHA2基因上的c.2825+1G>A突變?yōu)橄忍煨园變日系囊粋€致病突變。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。

盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。