本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大豆轉(zhuǎn)錄因子gmdiss1及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化,例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發(fā)育有重要影響，嚴(yán)重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，應(yīng)用基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞有多種途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫。其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。大豆是重要的油料作物，是植物蛋白質(zhì)的主要來源，弄清其耐逆機理，進(jìn)而改善其耐逆性，具有重要的理論及現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物抗逆性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種與植物抗逆性相關(guān)蛋白；本發(fā)明所提供的與植物抗逆性相關(guān)蛋白的名稱為gmdiss1，為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。其中，序列2由173個氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述c)中的蛋白質(zhì)gmdiss1，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)gmdiss1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)gmdiss1的編碼基因可通過將序列1所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：a1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述生物材料中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1的cdna分子或dna分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列1由522個核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼gmdiss1的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的gmdiss1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼gmdiss1且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進(jìn)行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，a2)所述的含有編碼gmdiss1的核酸分子的表達(dá)盒(gmdiss1基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)gmdiss1的dna，該dna不但可包括啟動gmdiss1轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止gmdiss1轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動子及誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35s：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動子(pin2)或lap啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pf128(cn101063139b(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述gmdiss1基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、 pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗鹽脅迫和/或抗旱脅迫。上述提高植物抗逆性具體體現(xiàn)為將編碼蛋白gmdiss1的dna分子通過含有編碼蛋白gmdiss1的dna分子的重組載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因毛狀根相對生長率高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根、轉(zhuǎn)基因毛狀根的萎蔫程度低于轉(zhuǎn)空載體毛狀根；在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因毛狀根相對生長率高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根。其中，所述轉(zhuǎn)空載體毛狀根為將prokii載體轉(zhuǎn)入植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根。所述含有編碼蛋白gmdiss1的dna分子的重組載體為重組載體prokii-gmdiss1；所述重組載體prokii-gmdiss1為將gmdiss1基因(序列1)正向插入prokii植物表達(dá)載體的 bamhi和kpni酶切位點之間，且保持prokii植物表達(dá)載體的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜?；蛩S皮；所述大豆可為大豆南農(nóng)1138-2或大豆科豐1號等品種。本發(fā)明將編碼蛋白gmdiss1的dna分子導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因毛狀根相對生長率高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根、轉(zhuǎn)基因毛狀根的萎蔫程度低于轉(zhuǎn)空載體毛狀根；在peg模擬的干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因毛狀根相對生長率高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根。說明gmdiss1蛋白及其編碼基因gmdiss1與植物耐旱和耐鹽相關(guān)，能顯著提高植物的耐鹽性和耐旱性。本發(fā)明的耐鹽/耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤秃?耐鹽植物品種，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。附圖說明圖1為gmdiss1在耐鹽和鹽敏大豆品種中的表達(dá)特性。圖2為gmdiss1表達(dá)受高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)。圖3為轉(zhuǎn)基因毛狀根的分子鑒定。圖4為轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)在正常條件下和鹽脅迫條件下的表型和相對生長率。圖4a為轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)在正常條件下的表型；圖4b為轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)在100mmnacl條件下的表型；圖4c為轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)在80mmnacl條件下的相對生長率。圖5為轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的在干旱脅迫下的相對生長率。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。下述實施例中的大豆科豐1號(glycinemaxl.merr.kefeng1)在文獻(xiàn)“w.k.zhang,y.j.wang,g.z.luo,j.s.zhang,c.y.he,x.l.wu,j.y.gai,s.y.chen,qtlmappingoftenagronomictraitsonthesoybean(glycinemaxl.merr.)geneticmapandtheirassociationwithestmarkers,theor.appl.genet,2004,108:1131-1139”中公開過，公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；下述實施例中的大豆南農(nóng)1138-2(glycinemax(l.)merr)購買于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心種質(zhì)庫，公眾可從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心獲得。下述實施例中的prokii載體(雙元表達(dá)載體)在文獻(xiàn)“d.c.baulcombe,g.r.saunders,m.w.bevan,m.a.mayoandb.d.harrison,expressionofbiologicallyactiveviralsatelliternafromthenucleargenomeoftransformedplants.nature321(1986),pp.446–449”中公開過，公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。下述實施例中的pzh01載體是stratagene公司的產(chǎn)品。下述實施例中的發(fā)根農(nóng)桿菌k599在文獻(xiàn)“attilakereszt,etal.,agrobacteriumrhizogenes-mediadedtransformationofsoybeantostudyofrootbiology,natureprotocols,2007,2(4),549-552)”中公開過，公眾可從petermgressnon教授，theuniversityofqueensland,stlucia,queensland4072,australia獲得，或經(jīng)petermgressnon教授同意(書面同意書)后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。實施例1、大豆gmdiss1基因的獲得一、大豆gmdiss1基因的獲得以科豐1號(鹽敏)和南農(nóng)1138-2(耐鹽)為親本的重組自交系為定位群體，在染色體上定位了大豆耐鹽區(qū)域。在該區(qū)域所涉及到的基因中，篩選到位點名為glyma.03g173100(locusname：glyma.03g173100)的基因，該基因是含鋅指結(jié)構(gòu)的zat11類的轉(zhuǎn)錄因子，其核苷酸序列如序列1所示，將序列1所示的基因命名為gmdiss1，gmdiss1基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，將序列2所示的氨基酸序列命名為gmdiss1蛋白。二、gmdiss1基因在耐鹽和鹽敏大豆品種中的表達(dá)特性在正常條件下，檢測了gmdiss1基因在耐鹽和鹽敏大豆品種中的表達(dá)特性。具體步驟如下：1、將大豆耐鹽品種南農(nóng)1138-2(1138)和鹽敏品種科豐1號(kf)種子分別種在盆中，光照培養(yǎng)，生長2個星期后取幼苗的根、莖和葉，分別提取rna。2、以步驟1獲得的rna為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cdna。3、以步驟2獲得的cdna為模板，采用qrt-f2-1和qrt-r2-1引物進(jìn)行realtime-pcr，引物序列如下：qrt-f2-1：5’ggtcgaaacttgagggagatgaac；qrt-r2-1：5’gaagaaaaatcttcgttaatggttgtc。大豆tublin基因為內(nèi)參基因，所用引物為primer-tf：5’-aacctcctcctcatcgtact和primer-tr：5’-gacagcatcagccatgttca。real-timepcr反應(yīng)使用toyobo公司的realtimepcrmastermix試劑盒，并按照說明進(jìn)行操作。real-timepcr檢測結(jié)果如圖1所示：gmdiss1基因在耐鹽和鹽敏親本的莖中表達(dá)無顯著性差異；gmdiss1基因在耐鹽和鹽敏親本的根和葉中表達(dá)有明顯差異，耐鹽親本南農(nóng)1138-2(1138)的根和葉中的gmdiss1基因的表達(dá)量明顯高于鹽敏親本科豐1號(kf)。三、逆境脅迫處理下大豆gmdiss1基因的表達(dá)特征分別將大豆耐鹽品種南農(nóng)1138-2(1138)和鹽敏品種科豐1號(kf)種子種在盆中，生長2個星期后，取幼苗分別進(jìn)行干旱脅迫和高鹽脅迫處理，然后通過real-timepcr檢測在脅迫處理后的gmdiss1基因表達(dá)情況。具體步驟如下：1、將豆苗根部小心的吸去水分，置于濾紙上暴露于室溫空氣(干旱脅迫)中，或置于1％nacl溶液(高鹽脅迫)中，于0、3、6、9小時分別收集新鮮的根部和葉片各1g，分別提取總rna。2、以步驟1獲得的rna為模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cdna。3、以步驟2獲得的cdna為模板，采用qrt-f2-1和qrt-r2-1引物進(jìn)行realtime-pcr，引物序列如下：qrt-f2-1：5’ggtcgaaacttgagggagatgaac；qrt-r2-1：5’gaagaaaaatcttcgttaatggttgtc。大豆tublin基因為內(nèi)參基因，所用引物為primer-tf：5’-aacctcctcctcatcgtact和primer-tr：5’-gacagcatcagccatgttca。real-timepcr反應(yīng)使用toyobo公司的realtimepcrmastermix試劑盒，并按照說明進(jìn)行操作。real-timepcr檢測結(jié)果如圖2所示：在科豐1號(kf)和南農(nóng)1138-2(1138)根中，與未處理對照(0時)比較，在干旱或高鹽處理3小時，gmdiss1基因的轉(zhuǎn)錄迅速上升，上升直至9小時；而在南農(nóng)1138-2葉中，于處理3小時時到達(dá)峰值，之后下降，但仍高于0時。除鹽脅迫南農(nóng)1138-2根中外，南農(nóng)1138-2中g(shù)mdiss1基因受干旱/高鹽處理的誘導(dǎo)幅度均大于科豐1號。實施例2、轉(zhuǎn)gmdiss1基因大豆毛狀根的獲得及抗逆性分析一、轉(zhuǎn)gmdiss1基因大豆毛狀根的獲得1、gmdiss1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建(1)提取南農(nóng)1138-2幼苗的總rna，以獲得的rna為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cdna。(2)根據(jù)在plantgdb的大豆基因組序列中g(shù)mdiss1全長cdna序列的信息，設(shè)計引物，引物序列如下(下劃線代表酶切位點)：gmdiss1-up:5’-cgggatccatgaagagacagagagatttcgag；gmdiss1-dp:5’-ggggtaccctataaagaatcaactaaggcaccag。(3)以步驟(1)獲得的cdna為模板，采用上述步驟(2)設(shè)計的引物進(jìn)行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，即為gmdiss1基因。(4)gmdiss1超表達(dá)載體prokii-gmdiss1的構(gòu)建將步驟(3)獲得的gmdiss1基因(序列1)正向插入prokii植物表達(dá)載體的bamhi和kpni酶切位點之間，且保持prokii植物表達(dá)載體的其他序列不變，得到重組載體prokii-gmdiss1。(5)gmdiss1rnai表達(dá)載體的構(gòu)建a)pzh01-gmdiss1-rnai-1載體以大豆基因組dna為模板，采用33050ri-f1和33050ri-r1引物進(jìn)行pcr擴增，得到大小為401bp的dna片段；將大小為401bp的dna片段插入到pzh01載體的salⅰ和xbaⅰ酶切位點間，且保持pzh01載體的其他序列不變，得到含有g(shù)mdiss1-rnai的植物表達(dá)載體pzh01-gmdiss1-rnai-1(圖3b)。引物序列如下：33050ri-f1：tgctctagagagctcgactattaattcgtgggagcgtct；33050ri-r1：acgcgtcgacggtaccgctttgagttcatctccctcaag。b)pzh01-gmdiss1-rnai-2載體以大豆基因組dna為模板，采用33050ri-f2和33050ri-r2引物進(jìn)行pcr擴增，得到大小為448bp的dna片段；將大小為448bp的dna片段插入到pzh01載體的salⅰ和xbaⅰ酶切位點間，且保持pzh01載體的其他序列不變，得到含有g(shù)mdiss1-rnai的植物表達(dá)載體pzh01-gmdiss1-rnai-2(圖3c)。引物序列如下：33050ri-f2：tgctctagagagctccatgagaaggcacaggacaac；33050ri-r2：acgcgtcgacggtacctcaaccaaatatatcaatccgtct。2、重組農(nóng)桿菌的獲得將上述得到的重組表達(dá)載體prokⅱ-gmdiss1、pzh01-gmdiss1-rnai-1和pzh01-gmdiss1-rnai-2分別通過電擊法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌k599，分別得到重組農(nóng)桿菌。將含有上述質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌分別命名為k599/prokⅱ-gmdiss1、k599/pzh01- gmdiss1-rnai-1和k599/pzh01-gmdiss1-rnai-2。將prokⅱ載體通過電擊法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌k599，得到k599/pzh01。3、轉(zhuǎn)gmdiss1基因大豆毛狀根的獲得本發(fā)明將文獻(xiàn)“attilakereszt,etal.,agrobacteriumrhizogenes-mediadedtransformationofsoybeantostudyofrootbiology,natureprotocols,2007,2(4),549-552”中的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染法略加改進(jìn)，具體步驟參考文獻(xiàn)“wang,fang；chen,hao-wei；li,qing-tian；wei,wei；li,wei；zhang,wan-ke；ma,biao；bi,ying-dong；lai,yong-cai；liu,xin-lei；man,wei-qun；zhang,jin-song；chen,shou-yi,gmwrky27interactswithgmmyb174toreduceexpressionofgmnac29forstresstoleranceinsoybeanplants,2015,theplantjournal,83,224–236”或授權(quán)專利“陳受宜等，植物耐逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子gmwrky78及其編碼基因與應(yīng)用，授權(quán)號：zl201110053083.7,授權(quán)日2013.10.09”中的方法，分別將上述步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌k599/prokⅱ-gmdiss1、k599/pzh01-gmdiss1-rnai-1和k599/pzh01-gmdiss1-rnai-2接種于生長6天含兩片真葉的大豆科豐1號幼苗，接種后保濕生長(光照16小時，溫度25℃，濕度50％)。生長2周后，長出的毛狀根即為轉(zhuǎn)基因毛狀根，分別獲得123個轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、119個轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、117個轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)，將其進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)基因鑒定和耐逆性檢測。將上述重組菌替換成k599/pzh01，其他步驟不變，得到122個轉(zhuǎn)空載體毛狀根根系。4、轉(zhuǎn)基因毛狀根的分子鑒定分別提取上述步驟3獲得的轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)的總rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。以cdna為模板，采用qrt-f2-1：5’ggtcgaaacttgagggagatgaac和qrt-r2-1：5’gaagaaaaatcttcgttaatggttgtc進(jìn)行熒光定量pcr，檢測gmdiss1基因表達(dá)量。以大豆gmtubulin基因為內(nèi)參基因。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。檢測結(jié)果圖3所示：gmdiss1在轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)中的表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根，而在轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)中則明顯低于轉(zhuǎn)空載體毛狀根。二、轉(zhuǎn)gmdiss1基因毛狀根和轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai毛狀根的耐鹽和耐旱性檢測1、耐鹽性檢測分別將上述步驟一獲得的轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)、轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照) 和野生型大豆(南農(nóng)1138-2)毛狀根按照處理條件不同分成如下三組(各組取約10個株系)：第一組，經(jīng)100mmnacl水溶液處理5天(25℃)；第二組，經(jīng)80mmnacl水溶液處理3天(25℃)；第三組，浸入水中作為對照(25℃)。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。處理后對植株和葉片進(jìn)行拍照觀察并統(tǒng)計相對生長率。每一根毛狀根的相對生長率＝(處理后根長-處理前根長)/處理前根長，然后取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。100mmnacl水溶液處理5天后，拍照觀察。轉(zhuǎn)空載體毛狀根和3個轉(zhuǎn)基因毛狀根的植株及葉表型的拍照結(jié)果如圖4所示：從圖中可以看出，水處理(正常條件)條件下，轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)的表型無顯著差異(圖4a)；在100mmnacl處理下，轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)有顯著差異，轉(zhuǎn)gmdiss1毛狀根(oe)植株和葉片的萎蔫程度顯著低于轉(zhuǎn)空載體毛狀根對照的植株和葉片，而轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)和轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)植株和葉片的萎蔫程度明顯高于對照(圖4b)。80mmnacl水溶液處理3天，拍照觀察。轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)的相對生長率統(tǒng)計結(jié)果如圖4c所示。從圖中可以看出：在80mmnacl處理3天后，轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)、轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)的相對生長率分別約為38％、55％、19％和26％，轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)與轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)的差異呈極顯著。gmdiss1的過表達(dá)提高了植株的耐鹽性，而干擾gmdiss1的表達(dá)的植株的耐鹽性也相應(yīng)下降。說明gmdiss1具有調(diào)控植物耐鹽性的功能。2、耐旱性檢測將轉(zhuǎn)空載體毛狀根、轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)和野生型大豆(南農(nóng)1138-2)毛狀根分別浸入5％(體積百分含量)peg(聚乙二醇6000)處理3天(25℃)，以在水中生長為對照，處理后統(tǒng)計相對生長率。每個植株處理的根系各約為10個。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。5％peg水溶液處理3天的轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)、轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)的根相對生長率統(tǒng)計結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出：5％peg處理3天后，轉(zhuǎn)空載體 毛狀根(對照)、轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-1大豆毛狀根(ri-1)、轉(zhuǎn)gmdiss1-rnai-2大豆毛狀根(ri-2)的相對生長率分別約為55％、78％、61％和48％，轉(zhuǎn)gmdiss1大豆毛狀根(oe)的相對生長率顯著高于轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)，而ri-1和ri-2毛狀根相對生長率明顯低于oe毛狀根，但是與對照沒有顯著差異。gmdiss1的過表達(dá)提高了植株的耐旱性，然而干擾gmdiss1的表達(dá)的植株的耐旱性沒有下降。說明gmdiss1具有調(diào)控植物耐旱性的功能，但是其機制與對耐鹽性的調(diào)控有所區(qū)別。綜上所述，gmdiss1蛋白及其編碼基因gmdiss1與植物耐旱和耐鹽相關(guān)，能顯著提高植物的耐旱性和耐鹽性。當(dāng)前第1頁12