本發(fā)明屬于dna提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效快速提取農(nóng)作物基因組dna的方法，尤其是適合高效快速提取農(nóng)作物單粒種子dna的方法。

背景技術(shù)：

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于pcr技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)，如qtls定位、基因克隆、分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)等在農(nóng)作物關(guān)鍵性狀研究與育種實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用，而這些技術(shù)的應(yīng)用離不開基因組dna的提取。

植物組織中dna的分離，需要打破細(xì)胞壁的阻礙，將dna從細(xì)胞膜中釋放出來，并與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。然而，目前常用的dna提取方法，如ctab法、sds法、苯酚法等，存在操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、有害試劑影響操作者的身體健康和污染環(huán)境等諸多缺陷，不適合批量樣品的快速分析及微量樣品的精準(zhǔn)鑒定。同時(shí)，隨著pcr技術(shù)的不斷成熟，dna聚合酶的保真度越來越高，pcr反應(yīng)對(duì)dna濃度和純度的要求逐漸降低，這也允許dna提取方法進(jìn)行更多的簡化和改進(jìn)。因此發(fā)明一種簡單快速，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合農(nóng)作物單粒種子精準(zhǔn)分析的的高通量dna提取方法具有很大應(yīng)用前景。

堿裂解法是一種簡單有效的dna快速提取方法。它的原理是利用堿性環(huán)境使膜蛋白變性，dna從細(xì)胞膜中釋放出來，從而達(dá)到分離dna的目的?，F(xiàn)有的堿裂解法有些只加入堿性溶液進(jìn)行變性裂解，提取的dna溶液因ph偏高會(huì)阻礙后續(xù)pcr反應(yīng)；有些在加入堿性溶液后會(huì)加入hcl溶液進(jìn)行中和，但只加hcl溶液又存在使提取的dna溶液ph偏低，影響后續(xù)pcr反應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)；有些加入hcl溶液后再加tris緩沖溶液調(diào)整ph值，步驟和試劑都明顯增多；且以上這些方法均需在高溫水浴中完成堿性裂解細(xì)胞，提取dna的過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種高效快速提取農(nóng)作物基因組dna的方法，尤其是高效快速提取農(nóng)作物單粒種子dna的方法，力求簡單快速，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合dna的高通量提取。

為解決上述問題，本發(fā)明在于提供一種高效快速提取農(nóng)作物基因組dna的方法，具體包括如下步驟：

1)取農(nóng)作物單粒種子發(fā)芽后長出的根系、幼苗或葉片于容器中，加入堿性溶液和鋼珠后進(jìn)行研磨，得到均漿；

2)向步驟1)所得裂解液中加入tris緩沖溶液后收集上層清液。

進(jìn)一步地，所述容器可以是96孔板或2ml離心管等。

進(jìn)一步地，所述農(nóng)作物可以是水稻、玉米、小麥、大豆、油菜、辣椒和西瓜等。

更進(jìn)一步地，所述農(nóng)作物單粒種子發(fā)芽后長出的根系、幼苗或葉片的獲取方法如下：

1)水稻：種子浸種12～24h，置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天即可；

2)玉米：種子置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天即可；

3)小麥：種子置發(fā)芽床上，20℃發(fā)芽4～8天即可；

4)大豆：種子置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽5～8天即可；

5)油菜：種子置發(fā)芽床上，15℃～25℃發(fā)芽5～7天即可；

6)辣椒：種子置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽7～14天即可；

7)西瓜：種子置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽5～14天即可。

進(jìn)一步地，所述堿性溶液為naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液。

更進(jìn)一步地，所述混合溶液中，所述naoh溶液的濃度為0.1～0.5mol/l，優(yōu)選0.1mol/l。

更進(jìn)一步地，所述混合溶液中，所述tritonx-100溶液的體積濃度為0.5％～1.5％。優(yōu)選為1％。

進(jìn)一步地，所述堿性溶液為naoh溶液和np40溶液的混合溶液。

更進(jìn)一步地，所述混合溶液中，所述naoh溶液的濃度為0.1～0.5mol/l，優(yōu)選0.1mol/l。

更進(jìn)一步地，所述混合溶液中，所述np40溶液的體積濃度為0.5％～1.5％。優(yōu)選為1％。

進(jìn)一步地，所述研磨的強(qiáng)度為60～70hz，研磨的時(shí)間為60～90s。使用離心管進(jìn)行研磨時(shí)，研磨強(qiáng)度優(yōu)選60hz，研磨時(shí)間優(yōu)選60s；使用96孔板進(jìn)行研磨時(shí)，研磨強(qiáng)度優(yōu)選70hz，研磨時(shí)間優(yōu)選90s。

進(jìn)一步地，所述堿性溶液和tris緩沖溶液的體積比為1:1。

進(jìn)一步地，所述tris緩沖溶液的濃度為0.1～0.5mol/l，優(yōu)選濃度為0.1mol/l。

進(jìn)一步地，所述tris緩沖溶液的ph值為8.0～10.0，優(yōu)選ph值為8.0。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供一種高效快速提取農(nóng)作物基因組dna的方法，首先，本方法在不需要加入hcl溶液，只需加入tris緩沖溶液調(diào)整ph值的情況下，獲得的dna質(zhì)量完全滿足pcr反應(yīng)的需要，有效減少酸的攝入從而避免dna溶液ph值偏低對(duì)pcr反應(yīng)的影響；其次，本方法加入的堿性溶液采用naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液，提升破壁速度和細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)變性速度同時(shí)保證提取的效果；或本方法加入的堿性溶液采用naoh溶液和np40溶液的混合溶液，促進(jìn)細(xì)胞破碎釋放出基因組dna，同時(shí)保證提取的效果；再次，本方法省略高溫水浴過程，只需堿性研磨裂解后，加入tris緩沖溶液收集上層清液2步，簡化提取步驟，降低試劑成本，縮短提取時(shí)間；第四，本方法適用于單粒種子的dna提取，將單粒種子發(fā)芽后直接用于提取該種子的dna，實(shí)現(xiàn)單粒種子的dna快速提取，且提取的dna完全滿足pcr反應(yīng)的要求。

本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)的dna提取方法相比，省去離心、沉淀和抽提等過程，通過研磨破除細(xì)胞壁，利用堿性環(huán)境加速細(xì)胞膜破裂和蛋白質(zhì)變性，實(shí)現(xiàn)dna的快速提取，且提取后的dna可直接用于pcr擴(kuò)增。dna的提取步驟由傳統(tǒng)的5～8步減少為2步，提取時(shí)間由傳統(tǒng)的5h以上縮短為1～1.5min，樣品的提取成本也顯著降低，同時(shí)避免了有害試劑對(duì)操作者的身體健康和環(huán)境污染的影響。

本發(fā)明的方法相比現(xiàn)有的堿裂解法，因加入tris緩沖溶液，可以調(diào)整提取的dna溶液ph值，避免因ph值偏高(只加堿性溶液)或偏低(加入堿性溶液后加hcl溶液)對(duì)后續(xù)pcr反應(yīng)的影響。同時(shí)，只需加入兩種溶液即可提取出較高質(zhì)量的dna，相較先加hcl溶液再加tris緩沖溶液的堿性裂解方法，提取步驟和提取試劑明顯減少；現(xiàn)有的堿裂解法均需在高溫水浴中完成裂解細(xì)胞、提取dna的過程，而本發(fā)明省去這個(gè)步驟，依靠堿性環(huán)境下研磨裂解，使細(xì)胞壁破碎，細(xì)胞膜變性，釋放出基因組dna。本發(fā)明建立的方法適用于農(nóng)作物種子純度、真實(shí)性、轉(zhuǎn)基因成分快速檢測(cè)及農(nóng)作物關(guān)鍵性狀分子標(biāo)記輔助選擇研究，特別是農(nóng)作物單粒種子的高通量精準(zhǔn)分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的方法獲得的水稻dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的方法獲得的玉米dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的方法獲得的油菜dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4提供的方法獲得的辣椒dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5和6提供的方法獲得的小麥和大豆dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖中1～6孔為小麥dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；圖中7～12孔為大豆dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例1提取的dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例2提取的dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明對(duì)比實(shí)施例3提取的dnapcr擴(kuò)增結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，例如pcr反應(yīng)，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

本實(shí)施提供的水稻品種dna的提取過程如下：取單粒水稻種子浸種12～24h，置于發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天，長出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗樣品和2粒鋼珠。每孔加入naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液50μl，其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％，70hz研磨90s，得到勻漿；加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，收集上清液，取1μl用于pcr反應(yīng)。

選取適用于該品種純度鑒定的ssr引物對(duì)該品種的24粒種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。圖1表明，運(yùn)用本發(fā)明方法提取的dna質(zhì)量完全滿足pcr反應(yīng)的需要。樣品編號(hào)2、10、12、18、21為該品種中混入的親本種子或其他品種種子，其余均為該雜交組合種子。檢測(cè)樣品的dna擴(kuò)增條帶清晰，滿足水稻種子純度檢測(cè)的需要。從實(shí)驗(yàn)過程可知，采用本發(fā)明建立的方法提取一批樣品dna平均只需1.5min，一個(gè)品種的純度檢測(cè)(200粒種子)可在2h內(nèi)完成，該方法操作簡單，高效便捷。

實(shí)施例2

本實(shí)施提供的玉米品種dna的提取過程如下：取單粒玉米種子置發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天，長出根系0.5～1cm，取根系加入96孔板中，每孔1株根系樣品和2粒鋼珠。每孔加入naoh溶液和np40溶液的混合溶液50μl，其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，np40溶液的體積濃度為1％，70hz研磨90s，得到勻漿；加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，收集上清液，取1μl用于pcr反應(yīng)。

選取適用于該玉米品種純度鑒定的ssr引物對(duì)該品種的24粒種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。圖2表明，提取的dna質(zhì)量完全滿足pcr反應(yīng)的要求。種子樣品編號(hào)6、10、17、18、23為該品種中混入的親本種子或其他品種種子，其余為該雜交組合種子。檢測(cè)樣品的dna擴(kuò)增條帶清晰，dna的質(zhì)量滿足玉米種子純度檢測(cè)的要求。采用本發(fā)明建立的方法省去了離心、沉淀、抽提等過程，具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)、無污染的特點(diǎn)。

實(shí)施例3

本實(shí)施提供的油菜品種dna的提取過程如下：油菜種子置發(fā)芽床上，15℃～25℃發(fā)芽5～7天，取同一品種50～100根0.5～1cm長的幼苗混合，與1粒鋼珠一同加入2ml離心管中。每管加naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液500μl，其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％，60hz研磨60s，得到勻漿；加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)500μl，收集上清液，取1μl提取的dna用于pcr反應(yīng)。

利用甘藍(lán)型油菜品種鑒定ssr引物對(duì)兩個(gè)油菜品種進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。圖3表明，兩個(gè)品種在圖中的12對(duì)ssr引物位點(diǎn)處表現(xiàn)不完全一致，在2和2’、9和9’兩個(gè)位點(diǎn)處擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。檢測(cè)樣品的dna比對(duì)清晰，提取的dna質(zhì)量完全滿足《nyt2468-2013甘藍(lán)型油菜品種鑒定技術(shù)規(guī)程srr分子標(biāo)記法》的要求。采用本發(fā)明建立的方法提取一批樣品的dna平均只需1min，操作簡單，經(jīng)濟(jì)省時(shí)，而且避免了有害試劑對(duì)人體健康及環(huán)境污染的影響。

實(shí)施例4

本實(shí)施提供的辣椒品種dna的提取過程與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于將油菜幼苗替換為辣椒幼葉，取1μl提取的dna用于pcr反應(yīng)。

利用辣椒品種鑒定ssr引物對(duì)兩個(gè)辣椒品種進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。圖4表明，兩個(gè)品種在圖中的12對(duì)ssr引物位點(diǎn)處表現(xiàn)不完全一致，在12和12’引物位點(diǎn)處擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。檢測(cè)樣品的dna比對(duì)清晰，提取的dna質(zhì)量完全滿足《nyt2475-2013辣椒品種鑒定技術(shù)規(guī)程ssr分子標(biāo)記法》的要求。采用本發(fā)明建立的方法可在3h內(nèi)將2個(gè)品種準(zhǔn)確區(qū)分，該方法簡單快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

實(shí)施例5

本實(shí)施提供的小麥品種dna的提取過程如下：小麥種子置發(fā)芽床上，20℃發(fā)芽4～8天；取同一品種50～100根0.5～1cm長的幼苗混合，與1粒鋼珠一同加入2ml離心管中。每管加naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液500μl(其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％)，60hz研磨60s，得到勻漿；加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)500μl，收集上清液，取1μl提取的dna用于pcr反應(yīng)。

利用檢測(cè)小麥內(nèi)參基因(waxy-d1基因)的ssr引物對(duì)提取的小麥dna進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5中1～6孔所示。圖5表明，1～6孔為小麥waxy-d1基因的擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物在100bp左右有清晰條帶，符合waxy-d1基因預(yù)期的擴(kuò)增片段大小(101bp)；說明提取的dna質(zhì)量完全滿足后續(xù)pcr反應(yīng)的要求。采用本發(fā)明建立的方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)高效，安全環(huán)保。

實(shí)施例6

本實(shí)施提供的大豆品種dna的提取過程與實(shí)施例5的區(qū)別僅在于將小麥幼苗替換為大豆幼苗，取1μl提取的dna用于pcr反應(yīng)。

利用檢測(cè)大豆內(nèi)參基因(lectin基因)的ssr引物對(duì)提取的大豆dna進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5中7～12孔所示。圖5表明，7～12孔為大豆lectin基因的擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物在200bp左右有清晰條帶，符合lectin基因預(yù)期的擴(kuò)增片段大小(210bp)，說明提取的dna質(zhì)量完全滿足后續(xù)pcr反應(yīng)的要求。采用本發(fā)明建立的方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)高效，安全環(huán)保。

對(duì)比實(shí)施例1

本實(shí)施提供的水稻品種dna的提取過程如下：取單粒水稻種子浸種12～24h，置于發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天，長出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗樣品和2粒鋼珠。第1～6孔加入0.1mol/l的naoh溶液50μl，第7～12孔加入naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液50μl(其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％)，70hz研磨90s，得到勻漿；第1～12孔均加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，收集上清液，取1μl用于pcr反應(yīng)。

選取適用于該品種純度鑒定的ssr引物對(duì)該品種的12粒種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。圖6表明，第1～6孔dna擴(kuò)增條帶微不可見，僅第2孔有微弱的條帶，無法判定該品種的純度；第7～12孔dna擴(kuò)增條帶清晰，說明堿性研磨裂解時(shí)加入tritonx-100溶液可以促進(jìn)細(xì)胞破碎釋放出基因組dna，提取質(zhì)量更高，提取效果更好。

對(duì)比實(shí)施例2

本實(shí)施提供的水稻品種dna的提取過程如下：取單粒水稻種子浸種12～24h，置于發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天，長出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗樣品和2粒鋼珠。每孔加入naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液50μl(其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％)，70hz研磨90s，得到勻漿；第1～6孔沸水中水浴1min后加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，第7～12孔不經(jīng)水浴直接加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，收集上清液，取1μl用于pcr反應(yīng)。

選取適用于該品種純度鑒定的ssr引物對(duì)該品種的12粒種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。圖7表明，第1～6孔dna擴(kuò)增條帶比較清晰；第7～12孔dna擴(kuò)增條帶非常清晰，說明不需水浴所提取的dna質(zhì)量完全滿足水稻種子純度檢測(cè)的需要。

對(duì)比實(shí)施例3

本實(shí)施提供的水稻品種dna的提取過程如下：取單粒水稻種子浸種12～24h，置于發(fā)芽床上，20℃～30℃發(fā)芽4～7天，長出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗樣品和2粒鋼珠。每孔加入naoh溶液和tritonx-100溶液的混合溶液50μl(其中naoh溶液的濃度為0.1mol/l，tritonx-100溶液的體積濃度為1％)，70hz研磨90s，得到勻漿；第1～6孔加入0.05mol/l的hcl溶液50μl中和naoh溶液，第7～12孔加入0.1mol/ltris溶液(ph值為8.0)50μl，收集上清液，取1μl用于pcr反應(yīng)。

選取適用于該品種純度鑒定的ssr引物對(duì)該品種的12粒種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。圖8表明，第1～6孔dna擴(kuò)增條帶大部分比較清晰，但有些孔(第2、3孔)比較模糊，不利于純度結(jié)果的判定；第7～12孔dna擴(kuò)增條帶非常清晰，說明堿性裂解后加入tris緩沖溶液，可以調(diào)整提取的dna溶液ph值，有利于后續(xù)的pcr反應(yīng)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。