本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種微量核酸釋放劑、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自1985年pcr技術(shù)問世以來，這一技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)各個領(lǐng)域，其特點是敏感性高、特異性強、操作簡便、所需時間短等。由于臨床或直接獲得標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、脂類等可干擾pcr反應(yīng)的物質(zhì)，故在做pcr反應(yīng)前必須進行核酸提取與純化。pcr檢測技術(shù)的第一步就是模板dna/rna的制備，這直接影響后續(xù)pcr反應(yīng)的結(jié)果。一直以來，樣本中核酸的提取和純化是整個實驗中最耗時，最繁瑣的過程，嚴(yán)重影響樣本檢測的速度。樣本中核酸的提取主要包括兩個步驟：裂解細胞和提取核酸。裂解細胞使核酸從細胞中釋放，蛋白解離的常用方法包括物理法(煮沸、凍融、微波、超聲、研磨等)、化學(xué)方法(高鹽、表面活性劑、苯酚等)和酶消化法(溶菌酶、蛋白酶k等)。苯酚-氯仿抽提法、異丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取dna最為經(jīng)典的方法，目前很多方法的改進都是在這些方法的基礎(chǔ)上進行的，這三種方法均是利用蛋白酶k和十二烷基硫酸鈉(sds)消化裂解細胞。在前兩種方法中，裂解液先用苯酚-氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異丙醇雙醇沉淀dna。甲酰胺法是利用高濃度的甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與dna的結(jié)合，然后利用透析來處理dna樣品。這些經(jīng)典方法在不計樣本量情況下獲得的dna純度很高，能夠滿足各種試驗的要求，但操作繁瑣，用時長，且所用試劑具有一定的毒性。堿裂解法是在naoh提供的高ph(12.0～12.6)條件下，用強陽離子去垢劑sds破壞細胞壁，裂解細胞，與naoh共同使細胞的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，釋放出dna。裂解后，細胞壁碎片與變性的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)形成大的復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鉀鹽條件下，可有效沉淀，而dna保留于上清液中，再通過無水乙醇沉淀、乙醇洗滌等步驟純化dna。堿裂解法雖然快速簡便，但去蛋白效果欠佳，明顯影響了后續(xù)pcr效果。煮沸裂解法原理，是在煮沸時將樣品中的dna通過含蛋白酶k等裂解緩沖液的作用釋放出來，溶解在緩沖液中，沸水浴裂解細胞的同時，可破壞dna鏈的堿基配對，并使細胞的蛋白質(zhì)與染色體dna變性。通過離心沉淀去除變性的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，然后回收上清液中的dna用于pcr擴增。然而，經(jīng)高溫煮沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并隨離心沉淀丟失，直接導(dǎo)致上清液中模板核酸量減少；另外，雖經(jīng)煮沸并高速沉淀，上清液中仍含有少量抑制擴增的成分如蛋白、肝素及微量血紅蛋白等，抑制了擴增效率。磁珠法是近幾年才發(fā)展起來的核酸提取方法，磁珠法提取核酸是通過細胞裂解液裂解細胞，從細胞中游離出來的核酸分子被特異的吸附到磁性顆粒表面，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在溶液中。反應(yīng)一定時間之后，再在磁場作用下，使磁性顆粒與液體分開，回收顆粒(即磁珠-dna混合物)，再用洗脫液洗脫，得到純凈的dna。由于其系列試劑不含氯仿、苯酚等毒性大的有機溶劑，提取步驟更簡單，對核酸樣本的回收率高和純度好等優(yōu)勢而倍受研究者青睞。不過產(chǎn)品基本上為國外所壟斷，價格非常昂貴，從而限制了其在我國的廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外臨床應(yīng)用于熒光定量pcr擴增核酸提取方法主要有：(1)堿裂解煮沸法，在樣本中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅膠膜吸附柱法，采用硅膠膜層析柱吸附、清洗、洗脫獲得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脫獲得核酸。這三種方法都需要經(jīng)過多步驟離心(或負(fù)壓抽吸、磁棒分離)、換管或移液操作才能獲得核酸，存在操作步驟繁多、過程中核酸容易丟失或污染的不足。因此由于臨床上樣本的量比較少，例如臨床樣本包括血液、唾液、擦拭物等，無法通過常規(guī)核酸提取方法得到符合要求的核酸，影響后續(xù)的核酸檢測結(jié)果，因此迫切需要一種可以進行微量核酸釋放的試劑，既可以靈敏地進行核酸的檢測，又免去核酸的回收步驟，避免核酸丟失或污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的提供了一種微量核酸釋放劑，其中，所述核酸釋放劑的各組分配比為：體積百分比0.2％～2.5％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比0.5％～8％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氫氧化鈉，余量為水。其中表面活性劑tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯；吐溫-20)。本發(fā)明是在經(jīng)典堿裂解煮沸法的基礎(chǔ)上，加入多項試劑優(yōu)化而來的。經(jīng)典堿裂解法可以釋放大部分液體樣本dna，但有諸多缺點：1、裂解不夠充分，如果低于1000拷貝/毫升dna，樣本無法得以有效裂解。2、反應(yīng)后溶液ph值比較高，裂解液無法直接用作pcr模板。3、在堿性環(huán)境下，rna極易水解，該方法不能用于提取rna樣本。因此本發(fā)明創(chuàng)新在于：1、加入蛋白酶k，可以在較高ph值條件下解離核酸結(jié)合蛋白，同時高溫滅活蛋白酶k，不影響后續(xù)pcr實驗。2、加入tween-20表面活性劑，由于表面活性劑具有極性和非極性基團，可以很好的破膜作用，使核酸從包膜蛋白中釋放，同時低濃度的tween-20不會抑制后續(xù)pcr反應(yīng)。3、加入適量的kcl鹽，低鹽濃度(<1mol/l)可以增加核酸在溶液中的溶解度。4、加入bsa，bsa是一種很好的穩(wěn)定劑，同時能夠保護核酸水解，結(jié)合螯合劑、血紅素等抑制pcr反應(yīng)的物質(zhì)。5、本發(fā)明研究顯示，合適的tween-20和kcl濃度比例可以降低強堿和蛋白酶k對bsa的水解作用，合適濃度的tween-20和kcl環(huán)境中，bsa可與naoh和蛋白酶k穩(wěn)定共存。本發(fā)明進一步提供了一種微量核酸釋放劑，其中，所述核酸釋放劑的各組分配比為：體積百分比0.5％～2％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1％～5％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.05mg/ml～1mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比1％～8％的牛血清白蛋白和5mg/ml～40mg/ml氫氧化鈉，余量為水。本發(fā)明進一步提供了一種微量核酸釋放劑，其中，所述核酸釋放劑的各組分配比為：體積百分比0.5％～1.5％的tween-20、質(zhì)量體積百分比1.2％～3％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.1mg/ml～0.8mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比2％～6％的牛血清白蛋白和6mg/ml～30mg/ml氫氧化鈉，余量為水。體積百分比％(v/v)，質(zhì)量百分比％(w/v)本發(fā)明進一步提供了一種微量核酸釋放劑，其中，所述核酸釋放劑的各組分配比為：體積百分比0.6％～1.0％的tween-20、質(zhì)量體積百分比1.2％～1.75％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.1mg/ml～0.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比2％～5％的牛血清白蛋白和10mg/ml～24mg/ml氫氧化鈉，余量為水。本發(fā)明更優(yōu)選了一種微量核酸釋放劑，其中，所述核酸釋放劑的各組分配比為：體積百分比0.8％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1.75％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比4％的牛血清白蛋白和20mg/ml氫氧化鈉，余量為水。本發(fā)明還提供了一種微量核酸釋放劑的制備方法，其中，由以下步驟組成：稱取處方量的表面活性劑、氯化鉀、蛋白酶k、牛血清白蛋白、氫氧化鈉和水后，混合配置溶液，將溶液進行過濾除菌即得所述核酸釋放劑。制備方法簡單，符合方便臨床檢測的要求。本發(fā)明還提供一種微量核酸釋放劑在核酸釋放檢測中的應(yīng)用，由以下步驟組成：1)將待測樣本與所述微量核酸釋放劑進行均勻混合，得到混合溶液a；2)將所述混合溶液a進行加熱處理后，室溫平衡得到目的核酸；3)使用目的核酸進行相關(guān)的核酸檢測?？梢詫颖竞退鑫⒘亢怂後尫艅┲糜谑覝仄胶?，顛倒混勻后取一定量的所述微量核酸釋放劑加入pcr管中，再取待測樣本加入管中輕柔混勻。所述待測樣本為全血，血漿，血清，咽試子洗脫液或分泌物。所述微量核酸釋放劑與待測樣本的體積比為1:1-1.5。所述加熱處理為加熱溫度90～100℃，加熱時間為10～15分鐘，所述室溫平衡為室溫下平衡2-3分鐘。所述加熱處理可采用液體石蠟油加熱或者直接用帶熱蓋的金屬浴進行加熱。所述目的核酸為dna或rna。所述核酸釋放劑的定義為既能裂解dna，又可以進行rna裂解的核酸釋放劑，而并非只能進行dna裂解或者rna的釋放劑。本發(fā)明微量核酸釋放劑及其釋放方法解決了常規(guī)核酸提取方法的核酸回收率低，操作步驟繁瑣，成本高等問題。采用本發(fā)明試劑及對應(yīng)方法，無需單獨提取核酸，只需要將待測樣本與所述微量核酸釋放劑按比例混合后按照所述釋放方法處理即可達到目的核酸的釋放，無需以往方法的抽提、離心和轉(zhuǎn)管等步驟。在很大程度上減少操作步驟，減少了核酸丟失，增加了檢測的靈敏度并且降低了成本，并且裂解液可以直接用于核酸檢測，不會影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和靈敏度。附圖說明圖1：實施例1中dnapcr凝膠圖；m為分子標(biāo)記梯度蛋白，陰性對照為：無菌水；hbvdnapcr產(chǎn)物片段為1225bp；圖2：kcl和tween20濃度調(diào)整實驗dna鑒定結(jié)果；圖3：kcl和tween20濃度調(diào)整實驗rna鑒定結(jié)果；圖4：實施例2中rnapcr凝膠圖；ev71rnart-pcr產(chǎn)物片段為676bp；圖5：ip-10pcr凝膠圖；ip-10pcr產(chǎn)物片段為503bp；圖6：foxp3pcr凝膠圖；foxp3pcr產(chǎn)物片段為486bp；圖7：ev71rt-pcr凝膠圖；3ul和4ul是逆轉(zhuǎn)錄后，cdna擴增時加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量。具體實施方式下面實驗例用于進一步說明本發(fā)明但不限于本發(fā)明。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明范圍。實驗引物匯總：dnahbvhbvrtupprimer5’-ttcctgctggtggctccagttc-3’hbvrtdownprimer5’-ctttgaagtatgcctcaaggtc-3’rnaev71ev71upprimer5’-ccctgaatgcggctaatcc-3’ev71downprimer5’-ccactgctgtagcgtcagaatc-3’foxp3fox-upprimer5’-ctatctcttgttctctcttgctcgc-3’fox-downprimer5’-ttctctcttgctcgctctttgtg-3’ip-10ip-upprimer5’-tcaaggaggactgtccaggtaaatc-3’ip-downprimer5’-tggcagtttgattcatggtgc-3’hbvdna熒光定量引物探針hbq-upprimer5’-ggagtgtggattcgcactcc-3’hbq-downprimer5’-gatcttctgcgacgcggcga-3’hbq-p5’-fam-cctatcttatcaacacttccg-bhq-3’實施例1不同試劑加入對經(jīng)典堿裂解煮沸法提取核酸pcr擴增比較堿裂解煮沸法：0.5mol/lnaoh水溶液方案1:2％kcl+0.5mg/ml蛋白酶k+0.5mol/lnaoh水溶液方案2:1％tween-20+2％kcl+0.5mg/ml蛋白酶k+0.5mol/lnaoh水溶液方案3:4％bsa+1％tween-20+2％kcl+0.5mg/ml蛋白酶k+0.5mol/lnaoh水溶液方案4：4％bsa+0.8％tween-20+1.75％kcl+0.5mg/ml蛋白酶k+0.5mol/lnaoh(20mg/ml)水溶液所述濃度與權(quán)利要求書和說明書中處方的濃度單位相對應(yīng)。所有試劑均用雙蒸水配制后過濾除菌。1dna樣本擴增樣本材料為乙型肝炎患者血清，hbvdna定量為5×102拷貝/毫升。分別用堿裂解煮沸法，方案1～方案4核酸釋放劑配方與樣本1:1混合。核酸釋放方法：99℃，10分鐘，室溫平衡2分鐘。pcr擴增試劑為北京全式金2×easytaqpcrsupermixpcr擴增體系為50ul，見表1表1pcr擴增條件：94℃3分鐘；94℃25秒，56℃25秒，72℃50秒；╳45循環(huán)72℃10分鐘；4℃forever。實驗結(jié)果：pcr擴增完成后，取5ulpcr產(chǎn)物，經(jīng)1％tae瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果顯示，方案3和方案4釋放樣本dna效果較好，結(jié)果條帶單一穩(wěn)定，能夠達到實驗要求。2.rna樣本擴增樣本材料為ev71病毒細胞培養(yǎng)上清，ev71病毒定量為5×104拷貝/毫升。分別用堿裂解煮沸法，方案1～方案4核酸釋放劑配方與樣本1:1混合。核酸釋放方法：99℃，10分鐘，室溫平衡2分鐘。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用fermentas公司的revetaid逆轉(zhuǎn)錄試劑產(chǎn)品規(guī)格：30次/盒，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟。每管20ulmix(包括，逆轉(zhuǎn)錄酶，引物，buffer，dntp，rnaseinhibiter與5ul核酸釋放劑處理后的樣本混合于pcr管中，上pcr儀逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：42℃30分鐘，70℃10分鐘，4℃forever。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物及為rna的cdna產(chǎn)物。cdnapcr擴增試劑為北京全式金2×easytaqpcrsupermixpcr擴增體系為50ul，見表2表2pcr擴增條件：94℃3分鐘；94℃25秒，52℃25秒，72℃50秒；╳45循環(huán)72℃10分鐘；4℃forever。實驗結(jié)果：pcr擴增完成后，取5ulpcr產(chǎn)物，經(jīng)1％tae瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖4實驗結(jié)果顯示，方案3和方案4釋放樣本rna均有效，結(jié)果條帶單一穩(wěn)定，方案4結(jié)果最好，能夠達到實驗要求。3.kcl和tween20濃度調(diào)整實驗樣本dna材料為乙型肝炎患者血清，hbvdna定量為5×102copies/ml.樣本rna材料為ev71病毒細胞培養(yǎng)上清，ev71病毒定量為5×104copies/ml.優(yōu)化試劑4：4％bsa+0.8％tween-20+1.75％kcl+0.5mg/ml蛋白酶k+0.5mol/lnaoh水溶液按照優(yōu)化方案4中，調(diào)整tween20和kcl濃度來選擇最佳配比的優(yōu)化配方。#4-1:0.2％tween-20+1％kcl+其余組分不變；#4-2:0.6％tween-20+1.2％kcl+其余組分不變；#4-3:0.8％tween-20+1.75％kcl+其余組分不變(優(yōu)化方案4配方)；#4-4:1.0％tween-20+1.75％kcl+其余組分不變；#4-5:1.2％tween-20+2.0％kcl+其余組分不變；#4-6:2.0％tween-20+2.5％kcl+其余組分不變；dna樣本前處理步驟、反應(yīng)體系和擴增條件同前述dna實驗。rna樣本前處理步驟、反應(yīng)條件和擴增體系同前述rna試驗。實驗結(jié)果：pcr擴增完成后，取5ulpcr產(chǎn)物，經(jīng)1％tae瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如下：dna樣本鑒定結(jié)果：見圖2實驗結(jié)果顯示，4-2、4-3和4-4釋放樣本dna效果較好，結(jié)果條帶單一穩(wěn)定，其中4-3的tween-20和kcl配比效果最優(yōu)，能夠達到實驗要求。rna樣本鑒定結(jié)果：見圖3實驗結(jié)果顯示，4-3和4-4釋放樣本rna效果較好，其中4-4的效果更好，結(jié)果條帶單一穩(wěn)定，其tween-20和kcl配比效果最好。優(yōu)化方案4在實施例1和2中表現(xiàn)最佳，這并不意味著此方案為唯一可行技術(shù)方案，dna和rna屬于不同樣本的不同試驗，上述實驗結(jié)果也與樣本中dna或rna的濃度相關(guān)，申請人以方案4為基礎(chǔ)處方，分別對tween-20、kcl、蛋白酶k、牛血清白蛋白、naoh進行濃度調(diào)整試驗，測定處方為體積百分比0.2％～2.5％的tween-20、質(zhì)量體積百分比0.5％～8％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氫氧化鈉，余量為水的核算釋放劑均可在其他樣本中進行微量核酸裂解，效果明顯(試驗數(shù)據(jù)較多，限于篇幅暫未提供，可根據(jù)要求，進行提供)。以下實施例中的微量釋放劑配方都是按照方案4配制。實施例2人全血基因擴增：ip-10是c-x-c類elr族趨化因子，是由干擾素(ifn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類細胞因子，foxp3是叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個成員，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性t細胞(treg)的標(biāo)志性分子，foxp3基因突變能引起嚴(yán)重的自身免疫性疾病，因此foxp3在調(diào)節(jié)機體免疫自穩(wěn)中起關(guān)鍵作用。1.實驗步驟a.用200ulpcr管加入5ul微量核酸釋放劑溶液，再加入5ul全血，輕柔混勻；b.將加好微量核酸釋放劑混合液的pcr管置于pcr儀(帶熱蓋)中，99℃，10min；c.取出樣本后再室溫平衡2-3min，pcr管底可見白色沉淀物，說明裂解完全；d.直接進行pcr擴增程序；pcr擴增體系50ul，見表3表3組分體積100mmtris-hcl(ph8.8)5ul500mmkcl5ul2.5mmdntp4ul25mmmgcl26ulip-10/foxp3upprimers0.5ulip-10/foxp3downprimers0.5ultaq(5u/ul)1ulddh2o補足到40ul將配好的擴增體系直接加入微量核酸釋放劑處理的樣本管中，置于pcr儀中開始實驗。pcr擴增條件：94℃3分鐘；94℃20秒，56℃20秒，72℃40秒；╳35循環(huán)72℃10分鐘；4℃forever。1.實驗結(jié)果pcr擴增完成后，取5μlpcr產(chǎn)物，經(jīng)1％tae瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖5和圖6。實驗結(jié)果顯示微量核酸釋放劑可以從全血中釋放基因組dna，經(jīng)普通pcr成功擴增基因。實施例3病毒細胞培養(yǎng)上清中rna的擴增ev71是腸道病毒的一種，可引起嬰幼兒的“手足口”病，嚴(yán)重會導(dǎo)致死亡。實驗步驟1、用200ulpcr管加入5ul微量核酸釋放劑溶液，再加入5ul病毒細胞培養(yǎng)上清，輕柔混勻；2、將加好微量核酸釋放劑混合液的pcr管置于pcr儀(帶熱蓋)中，99℃，10min；3、取出樣本后再室溫平衡2-3min，pcr管底可見白色沉淀物，說明裂解完全；4、直接進行pcr擴增程序；(1)逆轉(zhuǎn)錄步驟：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用fermentas公司的revetaid逆轉(zhuǎn)錄試劑產(chǎn)品規(guī)格：30次/盒，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟。每管20ulmix(包括，逆轉(zhuǎn)錄酶，引物，buffer，dntp，rnaseinhibiter加入微量核酸釋放劑處理后的樣本pcr管中，上pcr儀逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：42℃30-60分鐘，70℃10分鐘，4℃forever。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物及為rna的cdna產(chǎn)物。(2)cdnapcr擴增體系：見表4表4組分體積100mmtris-hcl(ph8.8)5ul500mmkcl5ul2.5mmdntp4ul25mmmgcl26ulev71upprimers0.5ulev71downprimers0.5ultaq(5u/ul)1ul模板(cdna產(chǎn)物)5ulddh2o補足到50ul3、cdnapcr擴增條件：94℃5分鐘；94℃20秒，48℃20秒，72℃40秒；╳35循環(huán)72℃10分鐘；4℃forever。實驗結(jié)果1％tae瓊脂糖凝膠，上樣5ul，110v電壓，電泳20-30分鐘，結(jié)果如圖7。實驗結(jié)果顯示微量核酸釋放劑可以從細胞培養(yǎng)上清中釋放病毒rna，經(jīng)普通pcr成功擴增基因。實施例4乙型肝炎病毒(hbv)血清樣本熒光pcr定量檢測乙型肝炎病毒是一種嗜肝性dna病毒，可引起肝炎嚴(yán)重會發(fā)展為肝硬化，肝癌，是目前較常見的傳染疾病，我國乙肝病毒攜帶者約有9300萬。實驗步驟對照商業(yè)試劑盒：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(pcr-熒光探針“一管法”)醫(yī)療器械注冊證書編號：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400344號產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：yzb/國0443-2013產(chǎn)品規(guī)格：48人份/盒公司：北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司采用試劑盒所配的標(biāo)準(zhǔn)品血清樣本：a：1×107iu/ml，b：2×105iu/ml，c：3×103iu/ml樣本dna提?。篴，b，c分別兩份按照試劑盒說明書處理a，b，c分別兩份采用微量核酸釋放劑處理(1)用200ulpcr管加入5ul微量核酸釋放劑溶液，再加入5ul樣本，輕柔混勻；(2)將加好微量核酸釋放劑混合液的pcr管置于pcr儀(帶熱蓋)中，99℃，10min；(3)取出樣本后再室溫平衡2-3min，pcr管底可見白色沉淀物，說明裂解完全；(4)直接進行pcr擴增程序；(5)pcr擴增體系40ul熒光定量pcr反應(yīng)試劑：所有樣本均采用商業(yè)試劑盒的pcr反應(yīng)試劑。見表5表5組分體積1╳hbvqpcrmix28.5ulhot-starttaq酶1.5ul模板10ul(核酸釋放劑處理)(6)pcr擴增條件(商業(yè)試劑盒說明書條件)：94℃5分鐘；94℃15秒，60℃30秒，；╳40循環(huán)(采光)實驗結(jié)果熒光定量pcr儀為上海宏石slan-96p擴增結(jié)果如下：按所給標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線為：斜率：-3.00423，截距：41.83828，相關(guān)系數(shù)：-0.99657兩種方法提取dna后hbv熒光定量ct值比見表6表6實驗結(jié)果顯示：微量核酸釋放劑可以釋放血清中hbv基因組dna，定量結(jié)果顯示微量核酸釋放劑比對應(yīng)商業(yè)試劑盒有較好的病毒核酸釋放結(jié)果和重復(fù)性。實施例5處方：體積百分比0.2％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比0.5％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.02mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比0.5％的牛血清白蛋白和2mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例6體積百分比2.5％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比8％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度1.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比10％的牛血清白蛋白和50mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例7體積百分比0.5％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.05mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比1％的牛血清白蛋白和5mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例8體積百分比2％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比5％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度1mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比8％的牛血清白蛋白和40mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例9體積百分比0.5％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1.2％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.1mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比2％的牛血清白蛋白和6mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例10體積百分比1.5％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比3％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.8mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比6％的牛血清白蛋白和30mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例11體積百分比0.6％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1.2％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.1mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比2％的牛血清白蛋白和10mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。實施例12體積百分比1.0％的表面活性劑、質(zhì)量體積百分比1.75％的氯化鉀、質(zhì)量體積濃度0.5mg/ml的蛋白酶k、質(zhì)量體積百分比5％的牛血清白蛋白和24mg/ml氫氧化鈉，余量為水。稱取處方量各組分，配置成溶液，過濾除菌。本發(fā)明申請中的所有引物和pcr技術(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以實現(xiàn)的，相關(guān)技術(shù)請參照分子克隆等教科書。當(dāng)前第1頁12