一種高質(zhì)量薏苡基因組dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種薏苡基因組DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從植物組織中提取基因組DNA是植物分子生物學(xué)研究中的一個(gè)基本操作步驟，可應(yīng)用于文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和輔助育種等多個(gè)方面。DNA質(zhì)量好壞直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗，經(jīng)典的基因組DNA提取方法主要為CTAB法和SDS法兩種，但研究發(fā)現(xiàn)，由于不同植物葉片中所含次生代謝產(chǎn)物的含量和種類(lèi)存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中適合一種植物基因組DNA提取的方法并不能在另一種植物基因組DNA提取中獲得同樣好的效果，因此，分子生物學(xué)科學(xué)家們根據(jù)不同植物組織的特質(zhì)和研究目的，開(kāi)發(fā)了適合不用植物組織提取基因組DNA的方法，包括改良的CTAB法和SDS法，CTAB-SDS法、高鹽低pH法和尿素法等，以期獲得產(chǎn)量高、純度好的基因組DNA。
[0003]薏苡是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其根、葉和果實(shí)均可入藥，與目前對(duì)薏苡種仁藥理學(xué)方面開(kāi)展了較多的研究相比，薏苡分子生物學(xué)研究還處于起步階段，開(kāi)發(fā)一種適合薏苡提取高質(zhì)量基因組DNA的方法是順利開(kāi)展薏苡分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。薏苡葉片中生物堿和多糖類(lèi)物質(zhì)含量較高，傳統(tǒng)的DNA提取方法獲得的薏苡DNA含有較多雜質(zhì)，很難滿(mǎn)足包括酶切在內(nèi)的很多對(duì)DNA質(zhì)量要求較高的實(shí)驗(yàn)需求，因此，現(xiàn)有的薏苡DNA提取方法依然在不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可有效去除雜質(zhì)，DNA得率和純度都較高的薏苡基因組DNA提取方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種高質(zhì)量薏苡基因組DNA提取方法，包括如下步驟:取在液氮中充分研磨的薏苡葉片迅速放入提取液中，混勻后置于65°C水浴中30 min ;冷至室溫后加入0.25倍體積無(wú)水乙醇和0.11倍體積的5 mmol/L KAc溶液，渦旋混勻；加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合液抽提，低溫離心的離心條件溫度為4°C，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm，離心時(shí)間為15 min ;取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合液進(jìn)行第二次抽提，同樣離心條件進(jìn)行離心后獲得第二次上清液；將二次離心上清液加入4倍體積CTAB沉淀緩沖液，混勻后室溫靜置I h，然后4°C離心，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm，離心時(shí)間為5 min ;將沉淀溶于400 yL Imol/L NaCl溶液中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，絮狀沉淀析出后用槍頭挑出放于1.5mL離心管中；DNA沉淀用70%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干后溶于500 μ L TE溶液中。
[0006]所述的提取液由如下成分組成:濃度2% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, 1.4mol/LNaCl，20 mmol/L EDTA，濃度2% PVP，濃度1% SDS, pH為8.0，提取液使用前加入β -巰基乙醇至終濃度為2%。所述的CTAB沉淀緩沖液由如下成分組成:濃度1% CTAB, 100 mmol/LTris-HCl, 10 mmol/L EDTA，pH 為 8.0。所述的 TE 溶液由如下成分組成:I mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl，pH 為 8.0。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在將植物組織DNA抽提到提取液中后，添加了無(wú)水乙醇和高鹽KAc溶液的步驟，增強(qiáng)了除去生物堿、多糖、多酚類(lèi)等雜質(zhì)的效果。另外，通過(guò)離心方式獲得第一次DNA沉淀，保證了 DNA的得率，將其溶于NaCl溶液后再用無(wú)水乙醇進(jìn)行第二次沉淀，保證了獲得DNA的純度，尤其能滿(mǎn)足需要酶切實(shí)驗(yàn)操作的研究項(xiàng)目。
【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1為薏苡葉片DNA的瓊脂糖電泳圖，圖中，l:marker DL2000; 2:傳統(tǒng)CTAB法提取黔薏苡I號(hào)嫩葉DNA，3 μ L; 3:改良CTAB法提取黔薏苡I號(hào)嫩葉DNA，3 μ L; 4:改良CTAB法提取黔薏苡I號(hào)老葉DNA，3 μ L; 5:改良CTAB法提取興仁小白殼嫩葉DNA，3 μ L;6:改良CTAB法提取興仁小白殼老葉DNA，3 μ L; 7:改良CTAB法提取薏苡新品系嫩葉DNA，
3 μ L0
[0009]圖2為薏苡品種黔薏I號(hào)DNA酶切結(jié)果電泳圖，圖中，l:mariier DL2000，2..EcoRI，?>\BanR I，4:: JJ1 I，b\Dra I，6:marker 150000
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0011]實(shí)施例1:
如圖1和圖2所示，以黔薏I號(hào)為原料，按如下步驟實(shí)施:
(I)將新鮮或冷凍的的薏苡葉片在液氮中充分研磨，取約10mg加入到0.8 mL提取液中，渦旋徹底混勻，于65 °C水浴中放置30 min。
[0012](2)將步驟(I)中水浴的離心管置于室溫冷卻，加入0.25倍體積的無(wú)水乙醇和
0.11倍體積的5 mol/L KAc溶液(ρΗ4.8)，渦旋混勻。
[0013](3)在步驟(2)中的混合液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提，上下顛倒混勾后，4°C離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0014](4)將步驟(3)中得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液進(jìn)行第二次抽提，離心條件同步驟(3)。
[0015](5)將步驟(4)中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入4倍體積的CTAB沉淀緩沖液，混勻后室溫靜置I h，然后4°C離心5 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0016](6)將步驟(5)中獲得的沉淀溶于400 μ L I mol/L NaCl溶液中，加入2.5倍預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置數(shù)分鐘使DNA沉淀析出。
[0017](7)將步驟(6)獲得的DNA沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于500 μ L TE溶液中，即獲得高質(zhì)量薏苡基因組DNA。
[0018](8 )將步驟(7 )中獲得的DNA溶液，取5uL分別進(jìn)行EcoR I，BanR I，Xhol和DraI酶切反應(yīng)，酶切3h，瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，薏苡基因組DNA可被四種限制性?xún)?nèi)切酶分別完全酶切，表明其DNA質(zhì)量好，純度高。
[0019]實(shí)施例2:
如圖1所示，以興仁小白殼為原料，按如下步驟實(shí)施:
(I)將新鮮或冷凍的的薏苡葉片在液氮中充分研磨，取約100 mg加入到0.8 mL提取液中，渦旋徹底混勻，于65 °C水浴中放置30 min。
[0020](2)將步驟(I)中水浴的離心管放于室溫冷卻，加入0.25倍體積的無(wú)水乙醇和
0.11倍體積的5 mol/L KAc溶液(ρΗ4.8)，渦旋混勻。
[0021](3)在步驟(2)中的混合液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提，上下顛倒混勾后，4°C離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0022](4)將步驟(3)中得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液進(jìn)行第二次抽提，離心條件同步驟(3)。
[0023](5)將步驟(4)中的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入4倍體積的CTAB沉淀緩沖液，混勻后室溫靜置I h，然后4°C離心5 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0024](6)將步驟(5)中獲得的沉淀溶于400 μ L I mol/L NaCl溶液中，加入2.5倍預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置數(shù)分鐘使DNA沉淀析出。
[0025](7)將步驟(6)獲得的DNA沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于500 μ L TE溶液中，即獲得高質(zhì)量薏苡基因組DNA。
[0026]當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高質(zhì)量薏苡基因組DNA的提取方法，其特征在于:取在液氮中充分研磨的薏苡葉片迅速放入提取液中，混勻后置于水浴中；冷至室溫后加入無(wú)水乙醇和KAc溶液，渦旋混勻；加入等體積的氯仿/異戊醇混合液抽提，進(jìn)行低溫離心處理；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液進(jìn)行第二次抽提，第二次進(jìn)行離心處理后獲得第二次上清液；將二次離心上清液加入CTAB沉淀緩沖液，混勻后室溫靜置，然后第三次進(jìn)行離心處理；將沉淀溶于NaCl溶液中加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，絮狀沉淀析出后挑出并用70%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干后溶于TE溶液中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高質(zhì)量薏苡基因組DNA的提取方法，其特征在于:所述的提取液由如下成分組成:濃度 2% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, 1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，濃度2% PVP，濃度1% SDS，pH為8.0，提取液使用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2% ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡基因組DNA提取方法，其特征在于:所述的CTAB沉淀緩沖液由如下成分組成:濃度 1% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, pH 為 8.0。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡基因組DNA提取方法，其特征在于:所述的TE溶液由如下成分組成:1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris-HCl，pH 為 8.0。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高質(zhì)量薏苡基因組DNA的提取方法，它主要是在提取過(guò)程中添加了在提取液中加入無(wú)水乙醇和高鹽KAc溶液的步驟，增強(qiáng)了去除葉片組織中多糖、生物堿、多酚等雜質(zhì)的效果，在常規(guī)的除蛋白操作步驟后，對(duì)基因組DNA進(jìn)行兩次沉淀，進(jìn)一步提升獲得DNA的純度，獲得得率和質(zhì)量均高的基因組DNA，尤其能滿(mǎn)足對(duì)DNA純度要求高的實(shí)驗(yàn)需求。
【IPC分類(lèi)】C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105087548
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510574684
【發(fā)明人】付瑜華, 楊成龍, 劉凡值, 周明強(qiáng), 李志芳, 黎青, 班秀文, 蒙秋伊, 敖茂宏, 劉鵬飛, 王建, 羅凱, 周祥
【申請(qǐng)人】貴州省亞熱帶作物研究所
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月11日