專利名稱：一種海蜇基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體的說是一種海蜇基因組DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
海蜇因其含水量高、易分解和自溶等生物學(xué)特點(diǎn)，限制了對它的基因組DNA的提 取。海蜇的生活史包括有性世代和無性世代。螅狀體營固著生活、屬于海蜇?zé)o性世代，碟狀 體營浮游生活、屬于海蜇有性世代，兩者在外部形態(tài)以及生物學(xué)功能方面都有很大不同，從 而導(dǎo)致兩個階段基因組DNA的提取方法不同。目前，國內(nèi)外對海蜇的研究并沒有將不同的 生活世代分開研究基因組DNA的提取。報道的海蜇基因組DNA提取方法多為Kit法和CTAB 法。Kit法成本高而且產(chǎn)率低，如要進(jìn)行大規(guī)模的群體分析就不實際；CTAB法樣品用液氮研 磨、酚仿抽提，方法煩瑣且毒性大，同時其并不適于海蜇碟狀體基因組的提取，不能保證后 期實驗的進(jìn)行。同時現(xiàn)有技術(shù)多采用試劑盒提取或酚_氯仿抽提法進(jìn)行海洋動物基因組的 提取，這兩種方法用于海蜇基因組DNA的提取均無法保質(zhì)、保量滿足實驗的需要，不能達(dá)到 滿意效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)可行并且操作簡便的海蜇基因組DNA的提取方 法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為基因組DNA提取方法1)將海蜇?zé)o性世代的海蜇螅狀體用手術(shù)剪刀剪碎至無明顯顆粒狀組織，加入CTAB buffer300 400ul，待用；2)將步驟1)得到的原料內(nèi)加入3 5ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，在55 56°C 消化24 26小時至溶液澄清，待用；3)在步驟2)澄清溶液中加入與其等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶液混勻， 離心，吸上清，再加入與上清液等體積的氯仿和異戊醇混合液混勻，離心，吸上清；而后向 上清液中加入上清液的0. 7 1倍體積的異丙醇，-20 -18°C沉淀10 15分鐘，沉淀 后取出，離心，棄去液體，并用體積濃度為70%的乙醇，離心洗1 2次，將多余液體倒去 室溫自然涼干，即得到海蜇螅狀體的基因組DNA ；其中苯酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為 25 24 1，氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為24 1。所述步驟1)中 CTAB buffer 溶液含有 1. 4M Nacl,0. 02M EDTA，0. IMTris-Hcl 禾口 每IOOml的CTAB buffer中加入2g質(zhì)量濃度為2%的CTAB。基因組DNA提取方法1)將海蜇有性世代的海蜇碟狀體置入體積濃度為95%的酒精中脫水并保存；2)將保存的蝶狀體樣品放入離心管中并直接加入buffer300 400ul勻漿、30 40ul質(zhì)量濃度為10%的SDS、3 5ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，封口后55 56°C消化 0.8 1.0小時，待用；
3)將步驟2)中消化后的溶液取出加入6M NaCl,振蕩渾勻20 30S， 10000 12000rpm離心20-30分鐘，吸上清，而后加入上清液的0. 7 1倍體積的異丙 11,-20 -18°c沉淀10 15分鐘，沉淀后取出，以10000 12000rpm離心15-20分鐘，棄 去液體，并用體積濃度為70%的乙醇，離心洗1 2次，自然室溫涼干，即得到海蜇碟狀體的 DNA。所述步驟Dbuffer 溶液含有 0. OlM Tris-Hcl 和 0. IM EDTA。所述得到海蜇DNA溶于滅菌純水中-20 _18°C保存；所述異丙醇和體積濃度為 70%的乙醇可在4°C預(yù)冷；所述海蜇為新鮮或酒精保存的樣品。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明海蜇基因組DNA的提取方法區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)中的Kit法和一般的酚氯仿抽 提法，在于對材料的處理即蝶狀體用無水乙醇保存，可去除多余水分造成的對后期基因組 DNA提取的干擾。而且蝶狀體的提取采用改進(jìn)的高鹽法，毒性小，操作簡單，技術(shù)要求低。螅 狀體基因組DNA的提取我們采用改良的CTAB法，其特征在于樣品不用液氮研磨而采用手術(shù) 剪刀盡量剪碎，長時間消化(24小時)，這樣即簡化了操作步驟又節(jié)約了成本。所得的高質(zhì) 量的基因組DNA可廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種以及系統(tǒng)進(jìn)化分析等方面。



圖1為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)CTAB法提取的海蜇螅狀體基因組電泳圖譜，其中1、6 泳道為MarkerXDNA/Hindlll ；2、3泳道為本發(fā)明方法提取的海蜇螅狀體基因組DNA ；4、5 泳道為現(xiàn)有CTAB法提取的海蜇螅狀體基因組DNA。圖2為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)高鹽法、現(xiàn)有技術(shù)CTAB法提取的海蜇蝶狀體基因組電泳 圖譜，其中1、8泳道為MarkerXDNA/Hindlll ；2、3泳道為本發(fā)明方法提取的海蜇蝶狀體基 因組DNA ；4,5泳道為現(xiàn)有高鹽法提取的海蜇蝶狀體基因組DNA ；6、7泳道為使用本發(fā)明中 螅狀體基因組DNA提取法所提的海蜇蝶狀體基因組DNA。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1將海蜇螅狀體用牙簽從波紋板(或其附著物)上挑起，收集到1. 5ml的離心管中。 用手術(shù)剪刀仔細(xì)的剪碎至無明顯顆粒狀組織加入400ul的CTABbufTer，待用。加入5ul蛋 白酶K，55°C消化24小時至溶液澄清，待用。而后再加入與澄清溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，混合均勻 12000rpm離心30min吸上清，再加入與所得上清等體積的氯仿和異戊醇的混合溶液，上下 顛倒混勻12000rpm離心30min吸上清。所得上清液中加入其0. 7倍體積的異丙醇_20°C沉 淀10分鐘，12000rpm離心20min棄去液體。并用500ul體積濃度為70%的乙醇，12000rpm, 5min洗2次。將多余液體倒去室溫自然涼干，即得到海蜇螅狀體的DNA ；海蜇螅狀體的DNA 滅菌純水中-20°C保存。將得到海蜇螅狀體的DNA溶于40ul滅菌純水中，30min后可用于瓊脂糖凝膠電泳 檢測(參見圖1)。
其中苯酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為25 24 1;氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為 24 1 ；CTAB buffer 溶液含 1. 4M Nacl,0. 02M EDTA，0. IMTris-Hc 1,2 % CTAB(2g/100ml))；所述異丙醇和體積濃度為70%的乙醇在4°C預(yù)冷。實施例2將95%酒精保存的海蜇蝶狀體收集到一個1. 5ml的離心管中。加入400ul勻漿 buffer,40ull0% SDS、2ul蛋白酶K，封口后在55°C消化1小時。消化好后取出加入400ul 6M NaCl，振蕩渾勻30S后12000rpm離心30min。吸上清800ul加入560ul異丙醇，-20°C 沉淀10分鐘，然后12000rpm離心20min，去上清。在用70 %乙醇離心洗兩遍，離心條件為 12000rpm離心5min，自然室溫涼干。即得到海蜇碟狀體的DNA ；海蜇碟狀體的DNA滅菌純 水中-20°C保存。將得到海蜇螅狀體的DNA溶于40ul滅菌純水中，30min后可用于瓊脂糖凝膠電泳 檢測(參見圖2)。其中buffer溶液含0. OlM Tris-Hcl和0. IM EDTA ；所述異丙醇和體積濃度為70% 的乙醇在4°C預(yù)冷。實施例3與實施例1不同之處在于將海蜇螅狀體用手術(shù)剪刀剪碎至無明顯顆粒狀組織，加入CTABbuffer300ul，待 用；而后加入3ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，在56°C消化26小時至溶液澄清，待用；向用氯仿和異戊醇混合離心后的上清液中加入上清液的1倍體積的異丙 醇，_18°C沉淀15分鐘，沉淀后取出，離心，棄去液體，并用體積濃度為70%的乙醇，離心洗1 次，將多余液體倒去室溫自然涼干，即得到海蜇螅狀體的基因組DNA。實施例4與實施例2不同之處在于將海蜇碟狀體置入體積濃度為95%的酒精中脫水并保存；將保存的蝶狀體樣品放入離心管中并直接加入buffer300ul、30ul質(zhì)量濃度為 10%的SDS、5ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，封口后56°C消化0. 8小時，待用；消化后的溶液取出加入6M NaCl，振蕩渾勻20S，IOOOOrpm離心30分鐘，吸上清，而 后加入上清液的1倍體積的異丙醇，_18°C沉淀15分鐘，沉淀后取出，以IOOOOrpm離心20 分鐘，棄去液體，并用體積濃度為70%的乙醇，離心洗1次，自然室溫涼干，即得到海蜇碟狀 體的DNA。
權(quán)利要求
一種海蜇基因組DNA提取方法，其特征在于1)將海蜇有性世代的海蜇碟狀體置入體積濃度為95％的酒精中脫水并保存；2)將保存的蝶狀體樣品放入離心管中并直接加入buffer300～400ul勻漿、30～40ul質(zhì)量濃度為10％的SDS、3～5ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，封口后55～56℃消化0.8～1.0小時，待用；3)將步驟2)中消化后的溶液取出加入6M NaCl，振蕩渾勻20～30S，10000～12000rpm離心20 30分鐘，吸上清，而后加入上清液的0.7～1倍體積的異丙醇， 20～ 18℃沉淀10～15分鐘，沉淀后取出，以10000～12000rpm離心15 20分鐘，棄去液體，并用體積濃度為70％的乙醇，離心洗1～2次，自然室溫涼干，即得到海蜇碟狀體的DNA。
2.按權(quán)利要求1所述的海蜇基因組DNA提取方法，其特征在于所述步驟1)buffer溶 液含有 0. OlM Tris-Hcl 和 0. IM EDTA0
3.按權(quán)利要求1所述的海蜇基因組DNA提取方法，其特征在于所述海蜇為新鮮或酒 精保存的樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體的說是一種海蜇基因組DNA的提取方法。具體為將海蜇用手術(shù)剪刀剪碎至無明顯顆粒狀組織，加入CTAB buffer、蛋白酶K，在55～56℃消化24～26小時至溶液澄清；或?qū)⒑ｒ刂萌?5％的酒精中脫水并加入buffer、SDS、蛋白酶K，封口后55～56℃消化0.8～1.0小時；而后混合苯酚、氯仿和異戊醇，離心，吸上清，再加入氯仿和異戊醇混合液混勻，離心，吸上清；再在上清液中加異丙醇，沉淀10～15分鐘，沉淀后取出，離心，棄去液體，并用乙醇，離心洗滌，將多余液體倒去室溫自然涼干，即得到海蜇基因組DNA。采用本發(fā)明可提取高質(zhì)量的海蜇全基因組DNA，且方法簡單、經(jīng)濟(jì)、易于操作，適合在普通生物實驗室中進(jìn)行。
文檔編號C07H21/04GK101988055SQ20101016612
公開日2011年3月23日 申請日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者劉媛, 崔朝霞, 張姝, 欒維莎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所