專利名稱：大熊貓全基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA基因提取方法，特別是涉及一種大熊貓全基因組DNA提取方法。
目前國內(nèi)外對動物的福爾馬林和石蠟包埋器官組織，陳舊標(biāo)本皮膚等材料的DNA提取，僅僅能得到1.0kb左右的DNA碎片，用于PCR分析，不能獲得動物的全基因組DNA，進行Southern印跡、基因組分析和克隆等方面的研究。與此同時，利用乙醇固定器官組織、新鮮糞便和尿液、乙醇或福爾馬林固定糞便等材料提取動物胃腸道上皮脫落組織細(xì)胞全基因組DNA的研究末見報道。近年來，國內(nèi)外對于大熊貓DNA的分析研究正在逐步開展起來，但研究材料均取自于大熊貓的新鮮血液、精液、皮膚及毛發(fā)?；诖笙鄮X、小相嶺兩個山系的大熊貓，目前僅有部分個體生活在野外，而岷山、涼山、邛崍和秦嶺等四大山系的大熊貓，雖有部分個體生活在自然保護區(qū)飼養(yǎng)場，動物園和大熊貓繁育研究基地，但因個體數(shù)量少，以及出于保護珍稀瀕危動物等諸多原因，若以新鮮或冷凍的血液、精液、皮膚等組織為DNA材料來源，則極其困難，因此，以標(biāo)本館和實驗室中大熊貓的福爾馬林或乙醇固定器官組織、石蠟包埋組織、陳舊標(biāo)本皮膚、甚至野外或圈養(yǎng)大熊貓的新鮮糞便、尿液、福爾馬林或乙醇固定糞便等為DNA材料來源，將是解決大熊貓DNA分析研究中實驗材料難以獲得的新途徑。
本發(fā)明的目的在于提供一種可為大熊貓的新鮮糞便或尿液，福爾馬林固定器官組織或固定糞便，乙醇固定器官組織或糞便，石蠟包埋器官組織和陳舊標(biāo)本皮膚等樣品為分析材料的大熊貓全基因組DNA提取方法。
本發(fā)明大熊貓全基因組DNA提取方法是1)在大熊貓全基因組DNA提取材料(新鮮糞便、火盆烘烤糞便、福爾馬林固定糞便、乙醇固定糞便、尿液、福爾馬林固定器官組織、乙醇固定器官組織、石蠟包埋器官組織、陳舊標(biāo)本皮膚)中按1∶1的比例加入80％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離，取沉淀。但當(dāng)DNA提取材料是糞便和尿液時，應(yīng)進行兩次離心分離，即加入80％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離后，先取上層清液，目的是除去糞渣，再將上層清液再次4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離，病毒和細(xì)菌固定在上層清液中，不再產(chǎn)生酶分解大熊貓DNA，棄上層清液，最后取沉淀。
2)在1)所得沉淀中加入90％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離，取沉淀。
3)在2)所得沉淀中加入100％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離，取沉淀。
4)將3)所得沉淀入濾紙袋內(nèi)，封口，放入臨界點干燥器樣品室，由鋼瓶加入液態(tài)二氧化碳，至液態(tài)二氧化碳液面超過紙袋最高點為止。
5)樣品室加溫至31℃(大氣壓72.8)后，維持兩小時，打開放氣閥門，排出氣體，同時徹底除去福爾馬林和乙醇，取出紙袋，得純干燥樣品。
6)將紙袋內(nèi)樣品放入研缽內(nèi)，加入液氮，0.2分鐘后樣品冰凍變脆，研為粉末，按1∶1比例加入TNE緩沖液，移入離心管內(nèi)，加入蛋白酶K和SDS，使終濃度分別為50mg/l和0.5％(重量)，于55℃保溫消化3小時。
7)用重蒸苯酚提抽2次，除去蛋白質(zhì)和細(xì)菌，再用氯仿提抽一次，除去苯酚，加95％冷乙醇(-10℃)沉淀，用大口吸管吸出大熊貓全基因組DNA，真空干燥1小時，于4℃下保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明大熊貓全基因組DNA提取方法的優(yōu)點在于全基因組DNA提取材料可為新鮮糞便、火盆烘烤糞便、福爾馬林固定糞便、乙醇固定糞便、尿液、福爾馬林固定器官組織、乙醇固定器官組織、石蠟包埋器官組織、陳舊標(biāo)本皮膚等，該DNA能用于大熊貓基因指紋分析，同時也用于脊椎動物(魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類)和人類分子生物學(xué)應(yīng)用與基礎(chǔ)研究中，如認(rèn)定動物數(shù)量、家系結(jié)構(gòu)組成、性別結(jié)構(gòu)、交配行為等，由此獲得種群的群體遺傳學(xué)定量資料，為野生動物的動態(tài)管理，建立唯一且是定量的分子遺傳學(xué)檔案；研究已絕滅、或瀕于絕滅動物的進化生物學(xué)、分子遺傳學(xué)；在醫(yī)學(xué)上，對于一些以往不能確診的疑難病癥的乙醇或福爾馬林固定檢材，可用此法提取全基因組DNA，進行基因分析與診斷；另外，在法庭科學(xué)應(yīng)用中，利用此技術(shù)方法，從嫌疑人現(xiàn)場微量檢材中，提取全基因組DNA，通過基因指紋探針作指紋檢測，認(rèn)定罪犯。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明實施例。
實施例1取陳舊標(biāo)本皮膚0.5克，加入0.5毫升80％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離，取沉淀。在所得沉淀中加入0.5毫升90％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離，取沉淀。在所得沉淀中加入0.5毫升100％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離，取沉淀。將所得沉淀入濾紙袋內(nèi)，封口，放入臨界點干燥器樣品室，由鋼瓶加入液態(tài)二氧化碳，至液態(tài)二氧化碳液面超過紙袋最高點為止。樣品室加溫至31℃(大氣壓72.8)后，維持兩小時，打開放氣閥門，排盡液態(tài)二氧化碳，取出紙袋。將紙袋內(nèi)樣品放入研缽內(nèi)，加入約10毫升液氮，0.2分鐘后研碎樣品至粉末狀，加入0.5毫升TNE緩沖液(10mmol Tris-10mmol EDTA-100mmol NaCL，PH7.8)移入離心管內(nèi)，加入蛋白酶K和SDS，使終濃度分別為50mg/l和0.5％(重量)，于55℃保溫消化3小時。加入2毫升重蒸苯酚，搖蕩5分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上層液，加入2毫升苯酚，重復(fù)上述搖蕩和離心過程，取上層液，加入2毫升氯仿，重復(fù)上述搖蕩和離心過程，取上層液，加入10毫升95％冷乙醇(-10℃)沉淀，搖動約1分鐘，用大口吸管吸出全基因組DNA，真空干燥1小時，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2取石蠟包埋睪丸器官組織0.5克，加入5毫升二甲苯，渦旋振蕩0.5分鐘，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，取沉淀，以下步驟同實施例1。
實施例3取火盆烤干糞便0.5克，加入0.5毫升加入80％乙醇，室溫靜置0.5小時，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離后，先取上層清液，再次4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離，病毒和細(xì)菌固定在上層清液中，棄上層清液，最后取沉淀。以下步驟同實施例1。
上述三個實施例所得DNA樣品，用探針進行指紋分析，基因指紋圖譜為

圖1和圖2，表明所提取的大熊貓全基因組DNA是純DNA。
權(quán)利要求
1.一種大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟1)在大熊貓全基因組DNA提取材料中按1∶1的比例加入80％乙醇，室溫靜置，離心分離，取沉淀。2)在1)所得沉淀中加入90％乙醇，室溫靜置，離心分離，取沉淀。3)在2)所得沉淀中加入100％乙醇，室溫靜置，離心分離，取沉淀。4)將3)所得沉淀入濾紙袋內(nèi)，封口，放入臨界點干燥器樣品室，由鋼瓶加入液態(tài)二氧化碳，至液態(tài)二氧化碳液面超過紙袋最高點為止。5)樣品室加溫至31℃(大氣壓72.8)后，維持兩小時，打開放氣閥門，排出氣體，取出紙袋。6)將紙袋內(nèi)樣品放入研缽內(nèi)，加入液氮，研為粉末，按1∶1比例加入TNE緩沖液，移入離心管內(nèi)，加入蛋白酶K和SDS，于55℃保溫消化。7)分別用苯酚提抽，氯仿提抽，95％冷乙醇沉淀，吸出大熊貓全基因組DNA，真空干燥，于4℃下保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于大熊貓全基因組DNA提取材料是新鮮糞便、火盆烘烤糞便、福爾馬林固定糞便、乙醇固定糞便、尿液、福爾馬林固定器官組織、乙醇固定器官組織、石蠟包埋器官組織、陳舊標(biāo)本皮膚。
3.如權(quán)利要求1所述的大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于DNA提取材料是糞便和尿液時，應(yīng)進行兩次離心分離，即加入80％乙醇，室溫靜置，離心分離后，先取上層清液，再將上層清液再次離心分離，最后取沉淀。
4.如權(quán)利要求1所述的大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于DNA提取材料是石蠟包埋器官組織時，需先用二甲苯脫蠟。
5.如權(quán)利要求1所述的大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于離心分離速度為3000～4000轉(zhuǎn)/分。
6.如權(quán)利要求1所述的大熊貓全基因組DNA提取方法，其特征在于加入蛋白酶K和SDS后，使終濃度分別為50mg/l和0.5％(重量)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大熊貓全基因組DNA提取方法,包括將DNA提取材料用不同濃度乙醇逐級脫水,沉淀分離,臨界干燥,除去乙醇或福爾馬林,粉碎,加入蛋白酶和SDS消化,再用苯酚、氯仿提抽,冷乙醇沉淀,真空干燥。該方法解決了大熊貓及其它野生和圈養(yǎng)動物DNA的材料來源,可用于動物種群的群體遺傳研究,以及醫(yī)學(xué)上疑難病癥的檢材固定后作基因分析。
文檔編號C07H21/00GK1198439SQ97107478
公開日1998年11月11日 申請日期1997年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月5日
發(fā)明者方盛國, 馮文和, 張安居 申請人:四川師范大學(xué)