專利名稱：檢測溫氏附紅細(xì)胞體的pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，涉及檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonsis)是由血液寄生生物-附紅細(xì)胞體
(Eperythrozoon)引起的一種人畜共患病,它主要寄生于人和動(dòng)物紅細(xì)胞表面、血衆(zhòng)及骨髓中，具多形態(tài)性。感染后多呈隱性經(jīng)過，急性發(fā)病時(shí)以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床癥狀。附紅細(xì)胞體對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人類健康具有重要的危害性及潛在危害性，主要體現(xiàn)在:①破壞宿主紅細(xì)胞，嚴(yán)重影響動(dòng)物紅細(xì)胞的輸氧功能及免疫力，使患畜的抵抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。②該病可垂直傳播，懷孕動(dòng)物感染時(shí)可引起弱胎、死胎或流產(chǎn)，后代生長發(fā)育遲緩。③不同種動(dòng)物的附紅細(xì)胞體可產(chǎn)生交叉感染，據(jù)資料證實(shí)小鼠、家兔、以及奶牛之間存在著交叉感染，與患病畜頻繁接觸的飼養(yǎng)員或獸醫(yī)，其附紅細(xì)胞體感染率達(dá)到了 90%，因此，推斷奶牛的附紅細(xì)胞體很可能感染人，本病已成為一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題，這給人類健康帶來嚴(yán)重的威脅。附紅細(xì)胞體病流行范圍廣，感染的宿主種類多。目前，世界上已有30多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道過該病，我國已有20多個(gè)省、市、自治區(qū)相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)本病流行，所感染的宿主包括牛、羊、豬、兔、馬、犬、貓和人等。在已經(jīng)報(bào)道的附紅細(xì)胞體種類中，溫氏附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon wenyonii, E.wenyonii)是引起牛發(fā)生附紅細(xì)胞體病的重要病原。目前在對(duì)溫氏附紅細(xì)胞體病的診斷主要采用鏡檢，病初進(jìn)行鮮血壓片或涂片，染色鏡檢能給予檢出，但受檢查者對(duì)溫氏附紅細(xì)胞體的觀察影響和檢查條件的干擾，而當(dāng)病畜患有貧血時(shí)，紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體均受破壞，則檢出附紅細(xì)胞體相對(duì)困難，此外利用此方法無法將一些立克次氏體病原如牛邊緣無漿體區(qū)分開來，因而容易出現(xiàn)誤診。由于宿主產(chǎn)生的抗體是針對(duì)受破壞的紅細(xì)胞而不是針對(duì)附紅細(xì)胞體本身，因而在應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)方法診斷附紅細(xì)胞體感染時(shí)，診斷的特異性不強(qiáng)。因此，探索開發(fā)簡易、敏感、特異的診斷技術(shù)是當(dāng)前研究附紅細(xì)胞體病的首要任務(wù)。PCR檢測技術(shù)以其特異性強(qiáng)，敏感性高、檢出速度快等特點(diǎn)，已被廣泛用于細(xì)菌、病毒等微生物的檢測。但是不同種類的附紅細(xì)胞體親緣性較近，無法將溫氏附紅細(xì)胞體與其他種類的附紅細(xì)胞體區(qū)分開。為準(zhǔn)確和快速診斷溫氏附紅細(xì)胞體病，急需一種對(duì)溫氏附紅細(xì)胞體特異好，擴(kuò)增效率高的檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，為診斷該疾病提供可靠的技術(shù)保障。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，對(duì)溫氏附紅細(xì)胞體特異好，靈敏度高，能夠準(zhǔn)確快速的診斷溫氏附紅細(xì)胞體病。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為:
檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，包括如SEQ ID N0.1所示的上游引物和如SEQ IDN0.2所示的下游引物。優(yōu)選的，所述上游引物的濃度為20 ymol/L，所述下游引物的濃度為20 μ mol/L。優(yōu)選的，還含有PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶和雙蒸水。更優(yōu)選的，所述PCR緩沖液濃度為10 mmol/L, MgCl2濃度為2.5 mmol/L, dNTPs濃度為2.5 mmol/L, DNA聚合酶的濃度為5U/^L。最優(yōu)選的，所述PCR試劑盒的反應(yīng)體系為:每25μ 反應(yīng)體系含有24μ 如下組分，
2.5 μ L 濃度為 IOmmoI/L 的 10XPCR 緩沖液，1.5 μ L 濃度為 2.5mmol/L 的 MgCl2, 2 μ L 濃度為2.5mmol/L的dNTPs, I μ L濃度為20 μ mol/L的上游引物，I μ L濃度為20 μ mol/L的下游引物，0.125μ 濃度為5U/^L的DNA聚合酶，余量為水。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開的溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，引物特異性好，能夠特異擴(kuò)增溫氏附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列，而不能擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體、羊附紅細(xì)胞體等的16S rRNA基因序列，因此能夠避免假陽性，并且該試劑盒的靈敏度高，最小檢測量為1.1Χ10_6μ g/mL ;與常規(guī)的溫氏附紅細(xì)胞體病診斷方法，如與鮮血壓片或涂片染色鏡檢、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)試驗(yàn)相t匕，具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，與現(xiàn)有PCR方法相比，特異性強(qiáng)、靈敏度高，降低假陽性和假陰性。



圖1為對(duì)感染溫氏附紅細(xì)胞體的水牛、奶牛和黃牛血樣PCR檢測結(jié)果，其中M:DL-2000 ；S1-S3:水牛全血基因組DNA ；N1-N3:奶牛全血基因組DNA ;H1_H4:黃牛全血基因組 DNA。圖2為特異性PCR電泳結(jié)果圖，其中，M:DL2000 ；1:溫氏附紅細(xì)胞體；2:豬附紅細(xì)胞體；3:羊附紅細(xì)胞體；4:大腸桿菌DNA ；5:空白對(duì)照。圖3為溫氏附紅細(xì)胞體特異性PCR敏感性圖，其中M:DL-2000 ;0:陰性對(duì)照；1-8:稀釋濃度分別為 55.14 μ g/mL、11.028 μ g/ mL、2.2056 μ g/ mL、0.44 μ g/ mL、8.8Χ1(Γ2μ g/ mL ml、1.76Χ1(Γ2μ g/ mL、3.529Χ1(Γ3μ g/ mL 和 7.058Χ1(Γ4μ g/ mL。圖4為溫氏附紅細(xì)胞體特異性PCR敏感性圖，其中M:DL-2000 ;0:陰性對(duì)照；9-16:稀釋濃度分別為 7.058Xl(T4yg/ mL、l.412X 1(Γ4μ g/ mL、2.82 X 1(Γ5 μ g/ mL、
5.6 X 10 6 μ g/ mL、1.1 X 10 6 μ g/ mL、2.2Χ 10 7 μ g/ mL>4.4 X 10 8 μ g/ mL和 8.8Χ 10 9 μ g/mL。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1
采集感染溫氏附紅細(xì)胞體的奶牛、黃牛和水牛血樣，利用Promega公司的DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)提取全血基因組 DNA。選取GenBank中收錄的牛、羊、豬、貓、兔附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)擴(kuò)增附紅細(xì)胞體的16S rRNA的引物，理論擴(kuò)增片段為446bp，引物序列如下:
上游引物 Cml:5，-cgaacgagtggaacttgttctgc-3，(SEQ ID N0.1)；
下游引物 Cm2:5，-tagtaccatcaaggcgtgctc-3’ (SEQ ID N0.2)；
弓I物序列由上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成。以制備的基因組DNA為模板，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表I所示:
表1、PCR反應(yīng)體系組成__
權(quán)利要求
1.檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，其特征在于:包括如SEQID N0.1所示的上游引物和如SEQ ID N0.2所示的下游引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，其特征在于:所述上游引物的濃度為20 ymol/L，所述下游引物的濃度為20 ymol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，其特征在于:還包括10XPCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶和雙蒸水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，其特征在于:所述10XPCR緩沖液濃度為10 mmol/L, MgCl2濃度為2.5 mmol/L,dNTPs濃度為2.5 mmol/L，DNA聚合酶的濃度為5U/^L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，其特征在于，所述PCR試劑盒的反應(yīng)體系為:每25μ 反應(yīng)體系含有24PL如下組分，2.5 μ L濃度為IOmmol/L 的 10XPCR 緩沖液，1.5 μ L 濃度為 2.5mmol/L 的 MgCl2, 2 μ L 濃度為 2.5mmol/L 的 dNTPs，I μ L濃度為20μπιΟ1/1的上游引物，I μ L濃度為20μπιΟ1/1的下游引物，0.125μ 濃度為5υ/μ 的DNA聚合酶，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測溫氏附紅細(xì)胞體的PCR試劑盒，含有檢測溫氏附紅細(xì)胞體16SrRNA基因的特異引物，其中上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，該引物能夠特異擴(kuò)增溫氏附紅細(xì)胞體的16SrRNA基因，而不能擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體、羊附紅細(xì)胞體及大腸桿菌的16SrRNA基因片段，并且靈敏度高，最小檢測量為1.1×10-6μg/mL，將本發(fā)明公開的PCR檢測試劑盒用于臨床診斷，性能穩(wěn)定，操作方便，易于標(biāo)準(zhǔn)化。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103160600SQ20131011745
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者蔣勇, 胡洪平, 吳剛 申請(qǐng)人:四川匯博獸藥科技有限公司