豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒及方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，該試劑盒包括：針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的TaqMan探針和引物對，該探針與豬源附紅細(xì)胞體G1基因第658～793位核苷酸序列特異性結(jié)合，該引物對用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體G1基因第658～793位的核苷酸序列。本發(fā)明基于粘附蛋白G1基因的豬源附紅細(xì)胞體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測出豬血樣品中是否存在附紅細(xì)胞體，可應(yīng)用于豬的附紅細(xì)胞體病的臨床診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查、療效評估和豬場凈化等方面，對于豬的附紅細(xì)胞體病的早期快速診斷、防控和凈化具有重要意義。
【專利說明】豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒及方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物血液中支原體感染檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬源附紅細(xì)胞體 檢測試劑盒及方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬源附紅細(xì)胞體屬于不能體外培養(yǎng)的嗜血支原體家族中的成員，一般寄生在豬紅 細(xì)胞的表面和內(nèi)部。豬源附紅細(xì)胞體感染在全世界廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損 失。其急性感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的菌血癥、急性紅細(xì)胞溶血，有時(shí)可導(dǎo)致年輕仔豬死亡、懷孕母 豬流產(chǎn)等。對于慢性感染的豬只，血液中細(xì)菌含量低，臨床癥狀多變，比如可能出現(xiàn)溫和的 黃疸、亞健康、生長速度緩慢、生產(chǎn)能力低下或?qū)ζ渌母腥拘约膊∫赘?。在?qiáng)烈的免疫作 用和抗生素治療之下，豬源附紅細(xì)胞體依舊可以在宿主體內(nèi)建立慢性和持續(xù)性的感染。豬 感染附紅細(xì)胞體后，極有可能在癥狀消失后轉(zhuǎn)化為慢性感染。目前發(fā)現(xiàn)感染豬的附紅細(xì)胞 體（即豬源附紅細(xì)胞體）有兩種，包括豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis)和小附紅細(xì)胞體 (M. parvum)。由于依靠16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鑒定方法才出現(xiàn)不久，對 小附紅細(xì)胞體的研究尚不充分。
[0003] 盡管早在1932年，附紅細(xì)胞體病原即已在美國被確認(rèn)，但其感染的流行病學(xué)數(shù)據(jù) 仍不甚明確，需要一種準(zhǔn)確可靠的方法對豬源附紅細(xì)胞體感染進(jìn)行診斷和鑒定，進(jìn)而推動 對該病的防控和凈化。豬的附紅細(xì)胞體病的傳統(tǒng)診斷方法包括鏡檢、血清學(xué)檢測、普通PCR 擴(kuò)增等。而臨床上該病的診斷主要以鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和涂片染色。由于附紅 細(xì)胞體主要寄生在紅細(xì)胞表面和血漿中，常導(dǎo)致紅細(xì)胞變形，但紅細(xì)胞的變形可以由多種 因素引起，如涂片技術(shù)、滲透壓的改變等，因此容易將變形紅細(xì)胞錯(cuò)誤判斷為附紅細(xì)胞體， 從而導(dǎo)致誤診。附紅細(xì)胞體在吉姆薩染色時(shí)呈藍(lán)紫色，瑞氏染色呈淡藍(lán)色，吖啶橙染色呈淡 綠色熒光，但是吉姆薩染色和瑞氏染色需要避免變性紅細(xì)胞（嗜堿性紅細(xì)胞、多染性紅細(xì) 胞和豪-周氏小體紅細(xì)胞）、血小板、抗凝劑和染料顆粒的干擾；載玻片上的污染異物和白 細(xì)胞碎片均可能引起非特異性發(fā)光，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。豬源附紅細(xì)胞體的血清學(xué) 檢測方法包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test, CFT)、間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination assay, IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等。由于附紅細(xì)胞體尚無成熟的體外培養(yǎng)方法，難以獲得大量原始抗原而阻 礙了血清學(xué)方法的應(yīng)用。近幾年普通PCR診斷方法主要集中在擴(kuò)增16S rRNA基因上，該基 因序列也是目前最常用的細(xì)菌種屬分類和鑒定的序列片段。比對多個(gè)原核生物、支原體的 16S rRNA基因發(fā)現(xiàn)豬源附紅細(xì)胞體與其他原核生物的相似性很高。在臨床采集的豬血樣 本可能被多種細(xì)菌污染，采用PCR擴(kuò)增16SrRNA基因極易出現(xiàn)假陽性。因此迫切需要建立 一種準(zhǔn)確、特異的豬源附紅細(xì)胞體檢測方法。豬源附紅細(xì)胞體甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣蛋 白 1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-likeproteinl,簡稱 G1 蛋白）基因主 要編碼一種黏附蛋白，具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶的功能，為豬源附紅細(xì)胞體特異性基因。 對小附紅細(xì)胞體的G1基因（MPG1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)其DNA序列與豬附紅細(xì)胞體G1 基因（MSG1)的核苷酸序列相似性在96. 6%?98. 2%之間，而氨基酸的相似性為98. 2%? 100%之間，兩者無顯著差異，其中小附紅細(xì)胞體G1基因在450?550位、600?900位核苷 酸序列與豬附紅細(xì)胞體G1基因?qū)?yīng)序列高度同源。
[0004] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的累積 實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定時(shí)分析的方法。與已有的診 斷方法相比，熒光定量PCR -次可同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行檢測和診斷；檢測速度更加迅速，結(jié) 果判斷不需要借助電泳分析，從而大大節(jié)省時(shí)間并降低了對環(huán)境的污染；對檢測樣品可以 實(shí)時(shí)定量分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決目前豬源附紅細(xì)胞體的檢測方法假陽性率高的技術(shù)問題，提供一種 基于粘附蛋白G1基因的豬源附紅細(xì)胞體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒特異性 強(qiáng)、靈敏性高，可快速、準(zhǔn)確地檢測出豬血樣品中是否存在附紅細(xì)胞體。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0008] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細(xì)胞體 G1基因第658?793位核苷酸序列特異性結(jié)合；
[0009] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的引物對，該引物對用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0010] 優(yōu)選的，所述探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物對的序列如SEQ ID N0 : 2 和 SEQID NO :3 所示。
[0011] 所述試劑盒還包括：含有豬附紅細(xì)胞體G1基因的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012] 所述試劑盒還包括：突光定量PCR反應(yīng)緩沖液及聚合酶。
[0013] 所述探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測豬源附紅細(xì)胞體濃度的方法，包括以下 步驟：
[0015] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細(xì)胞體G1 基因第658?793位核苷酸序列特異性結(jié)合；
[0016] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)一對引物，該對引物用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列；
[0017] 用所述TaqMan探針及引物，對含有豬附紅細(xì)胞體G1基因的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] 用所述TaqMan探針及引物，對待測豬血樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，根 據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線分析待測豬血樣品中豬源附紅細(xì)胞體的濃度。
[0019] 所述探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物的序列如SEQ ID N0 :2和SEQ ID NO :3所示。
[0020] 所述陽性重組質(zhì)粒是將豬附紅細(xì)胞體G1全長編碼基因插入PMD18-T載體而制得。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒在制備診斷豬的 附紅細(xì)胞體病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明基于粘附蛋白G1基因的豬源附紅細(xì)胞體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，具 有特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測出豬血樣品中是否存 在附紅細(xì)胞體，可應(yīng)用于豬的附紅細(xì)胞體病的臨床診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查、療效評估和豬 場凈化等方面，對于豬的附紅細(xì)胞體病的早期快速診斷、防控和凈化具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的豬源附紅細(xì)胞體G1基因 PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的豬源附紅細(xì)胞體G1基因陽性質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；
[0026] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3敏感性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖；
[0027] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0028] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例4特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖；
[0029] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例6豬田間血液樣品附紅細(xì)胞體感染檢測結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。
[0031] 本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的豬附紅細(xì)胞體G1基因序列（GenBank登錄號： AM407404. 1)，設(shè)計(jì)了 1對引物和TaqMan探針，研制了基于TaqMan探針檢測豬源附紅細(xì)胞 體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，并對現(xiàn)場采集的豬血液樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，設(shè) 計(jì)的探針對檢測豬源附紅細(xì)胞體具有很高的特異性；質(zhì)粒DNA的檢測閾值達(dá)100個(gè)拷貝； 檢測了 319份臨床豬血液樣品，豬源附紅細(xì)胞體的感染樣品數(shù)為45份（含34份豬附紅細(xì) 胞體和11份小附紅細(xì)胞體），兩種附紅細(xì)胞體總的感染陽性率為14. 11%，提示豬源附紅細(xì) 胞體TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒操作簡便、快速，在熒光PCR儀中反應(yīng)一小時(shí)內(nèi) 即可獲得準(zhǔn)確結(jié)果，特異性強(qiáng)，敏感度高，重復(fù)性好，可用于豬的附紅細(xì)胞體病的臨床診斷、 分子流行病學(xué)調(diào)查、療效評估和豬場凈化等的快速定量檢測。
[0032] 本發(fā)明的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，包括：
[0033] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的TaqMan探針，該探針與豬源附紅細(xì)胞體G1基 因第658?793位核苷酸序列特異性結(jié)合；
[0034] 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的引物對，該引物對用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0035] 在下述優(yōu)選實(shí)施例中，探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；引物對的序列如SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所示。
[0036] 實(shí)施例1豬源附紅細(xì)胞體G1基因的克隆和序列分析
[0037] ⑴引物設(shè)計(jì)：
[0038] 根據(jù)GenBank公布的豬附紅細(xì)胞體G1蛋白編碼基因序列（GenBank登錄號： AM407404. 1)，應(yīng)用Primer Premier5. 0軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體G1蛋白全長編碼 基因的特異性引物，引物序列如下：
[0039] 上游引物 MF1 :5, -GCGGGATCCATGACAATCCACAAAGTAGC-3，（SEQ ID NO :5);
[0040] 下游引物 MR1 :5, -CGCCTGCAGTTAAAGAGAAATGTAGTA-3'（SEQ ID NO :6)。
[0041] (2)豬血液樣品基因組DNA提?。?br> [0042] 用全血基因組DNA提取試劑盒（樹脂型，購自賽百盛公司，產(chǎn)品目錄號：⑶C-100)， 按照該試劑盒的說明書提取豬血液樣品基因組DNA :取500 μ L無菌抗凝全血到lmL純化樹 脂中，顛倒混勻5-6次。室溫下溫育3min，其間顛倒混勻一次，5000r/min離心3s，收集沉 淀。用lmL GN結(jié)合液將純化樹脂懸浮，顛倒混勻，5000r/min離心3s，收集沉淀。用0. 5mL 漂洗液漂洗純化樹脂兩次，顛倒混勻，5000r/min離心3s，收集沉淀。用0. 8mL無水乙醇懸 浮，裝入離心純化柱，12000r/min離心lmin，倒掉廢液收集管中的乙醇，再離心lmin，盡量 除盡乙醇。將離心純化柱套入一個(gè)潔凈的1. 5mL離心管中，加入100 μ L TE緩沖液于純化 樹脂上，室溫放置3min，12000r/min離心2min，離心管中收集的液體即為洗脫下來的豬血 全基因組DNA。
[0043] (3)豬源附紅細(xì)胞體G1基因全長序列的擴(kuò)增：
[0044] 1)豬源附紅細(xì)胞體G1基因全長序列擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：2. 5 μ L10倍濃度的Ex TaqBuffer，2y LdNTP，0. 2μ L ExTaq，上、下游引物各 0. 15μ L，2y LDNA 模板，用滅菌雙蒸水 補(bǔ)齊至25 μ L。設(shè)滅菌雙蒸水為陰性對照。
[0045] 2)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95°C 5min ;94°C 60s，55°C 45s，72°C 60s，共 35 個(gè)循環(huán)后， 72°C 延伸 8min。
[0046] 3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析：取5 μ LPCR產(chǎn)物，加入至含有0. 5 μ g/mL溴化乙錠染料的2% 的瓊脂糖凝膠中，于125V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的圖譜。并 與陰性對照對比，被檢樣品孔約在l〇〇〇bp左右出現(xiàn)電泳條帶，即進(jìn)行切膠純化。結(jié)果，成 功地?cái)U(kuò)增出了豬源附紅細(xì)胞體G1全長基因（圖1)，擴(kuò)增片段長度為lOllbp。圖1中，Μ : DL2000DNAMarker ;1 :目的片段；Ν :陰性對照。
[0047] 4)將目的條帶切膠純化，將回收產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài) 細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行序列測定。結(jié)果，成功地構(gòu)建了含有豬源附紅細(xì)胞體G1基因的 重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果顯示外源片段大小正確（圖2)，圖2中，Ml :DLlkb DNAMarker ;Μ2 : DL2000DNAMarker ;1 :豬源附紅細(xì)胞體G1基因陽性質(zhì)粒酶切片段。豬附紅細(xì)胞體G1基因全 長序列如下：
[0048] ATGACAATCCACAAAGTAGCAATCAATGGATTCGGAAGAATCGGAAGATTACTATTTAGA
[0049] AATCTTCTTTCTTCTCAAGGAGTTCAAGTTGTAGCTGTTAATGACGTAGTTGACATTAAA
[0050] GTTCTTACTCACCTTTTGGTTTATGACAGTGCTCAAGGAAAACTAAAAGATTGAGAAGT
[0051] AAGTTGTGATTCAGAATACATAAGACTAAAGAATGTAAATACTGGAGAAGTTAGAGAAG
[0052] TTAGAGTTTTCAACTTCAATACTGAAAAGATTTATCACTGAGGTGAATTAGAAATTGATT
[0053] GTGTTGTTGAATGTTCAGGAAGATTCTTAACTAAGGAAGCAGTTAAGTGTCACCTTGATG
[0054] CAGGAGCTCAAAAAGTTCTTATTTCAGCTCCTGCAAAGGATGACACTAAGACAGTTGTT
[0055] TACAACGTAAACCATACTCAAATTACCAGCTCAGACAATGTTATTTCAGGAGCTTCATGT
[0056] ACAACTAATGCACTAGCTCCTATCGTAAAAATTATTCACAGAAAATTTGGAATTAATTCTG
[0057] GATTCATGACAACAGTTCATGCTTTCACTTCTGACCAAAGACTTCAAGACTCTCCTCACG
[0058] CTGACCTA AGA AGAGCTAGAGCAGCTGCTGGATCA ATTATTCCTACA ACTACCGGAGCA
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細(xì)胞體G1基 因第658?793位核苷酸序列特異性結(jié)合； 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)的引物對，該引物對用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體G1基 因第658?793位的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，其特征在于，所述探針的序列 如SEQ ID NO :4所示；所述引物對的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包 括：含有豬附紅細(xì)胞體G1基因的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包 括：熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液及聚合酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒，其特征在于，所述探針的5'端 標(biāo)記有突光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。
6. -種檢測豬源附紅細(xì)胞體濃度的方法，其特征在于，包括以下步驟： 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細(xì)胞體G1基因 第658?793位核苷酸序列特異性結(jié)合； 針對豬源附紅細(xì)胞體G1基因設(shè)計(jì)一對引物，該對引物用于擴(kuò)增豬源附紅細(xì)胞體G1基 因第658?793位的核苷酸序列； 用所述TaqMan探針及引物，對含有豬附紅細(xì)胞體G1基因的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線； 用所述TaqMan探針及引物，對待測豬血樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，根據(jù)所 述標(biāo)準(zhǔn)曲線分析待測豬血樣品中豬源附紅細(xì)胞體的濃度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬源附紅細(xì)胞體濃度的方法，其特征在于，所述探針的 序列如SEQ ID NO :4所示；所述引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬源附紅細(xì)胞體濃度的方法，其特征在于，所述陽性重 組質(zhì)粒是將全長豬附紅細(xì)胞體G1基因插入pMDIS-T載體而制得。
9. 權(quán)利要求1所述的豬源附紅細(xì)胞體檢測試劑盒在制備診斷豬的附紅細(xì)胞體病的產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152537SQ201310176304
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月13日
【發(fā)明者】周鵬, 陳兆國, 曹薇, 米榮升, 黃燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所