用于形成生物粘附基質(zhì)的制劑和試劑盒的制作方法
【專利摘要】公開了包含明膠、藻酸鹽和偶聯(lián)劑，能夠形成生物粘附基質(zhì)的生物粘附制劑，其特征為快速固化、最佳粘度、高粘合強度、柔性、生物相容性和生物可降解性。還公開了還包含生物活性劑的這樣的生物粘附制劑，以及由其形成的藥物洗脫生物粘附基質(zhì)，所述生物粘附基質(zhì)能夠遞送生物活性劑至身體部位。還公開了在各種生物和醫(yī)學程序中利用生物粘附制劑和基質(zhì)的方法。
【專利說明】用于形成生物粘附基質(zhì)的制劑和試劑盒
[0001] 發(fā)明領域和背景
[0002] 本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及生物粘附基質(zhì)，且更具體地，但不排他地，涉及 生物粘附基質(zhì)、用于形成生物粘附基質(zhì)的制劑和試劑盒，以及其用于粘附兩個或更多個對 象，包括生物對象諸如有生命力的組織、器官以及類似的對象的用途。
[0003] 在最近幾年，已發(fā)展了對用生物粘附基質(zhì)（在本領域中還稱為生物粘附組合物） 代替或增加縫合線和縫合釘?shù)脑黾拥呐d趣。該增加的興趣的原因包括以其可實現(xiàn)內(nèi)部手 術(shù)程序的潛在速度；粘結(jié)物質(zhì)達到完全封閉，從而防止流體滲漏的能力；處理的組織形成 粘結(jié)而沒有過度變形的可能性；避免需要拆線；引起患者較少疼痛；其應用需要較簡單設 備，該設備不對從從業(yè)者呈現(xiàn)銳器的損傷風險；其提供了較小的疤痕；并且降低感染的可 能性。生物粘附劑還可被用于密封空氣和體液泄漏，其可偶爾抵抗常規(guī)縫合線或縫合技術(shù)； 用于局部傷口愈合；修復主動脈壁夾層；以及用于某些裝置的內(nèi)部和/或外部固定。
[0004] 如同任何粘合劑基質(zhì)，生物粘附基質(zhì)在固化相應制劑后形成。因此，將制劑施加 至IJ，例如，生物對象，并且當經(jīng)歷混合、固化引發(fā)劑或其他固化引發(fā)條件時，固化從而得到生 物粘附基質(zhì)。
[0005] 為了使生物粘附基質(zhì)可接受，其必須具有一些特性，諸如生物相容性和生物可降 解性，以及固化后的最佳結(jié)合強度和彈性。此外，生物粘附基質(zhì)應設計成使得相應的制劑呈 現(xiàn)用戶友好的稠度和固化/粘接時間。更具體地，生物粘附制劑應呈現(xiàn)最佳的初始粘度和 粘性，以允許足夠和方便的應用；不太流動以免從傷口邊緣流走，且不太粘稠，以免干擾均 勻和合理施藥，并同時以短固化/凝膠化時間迅速凝固，然而，不太短的固化/凝膠化時間， 從而允許順利應用到期望的部位。此外，生物粘附制劑/基質(zhì)應呈現(xiàn)在體液的濕條件下迅 速粘接至活組織的能力；生物粘附基質(zhì)應形成橋，通常可滲透柔性橋；并且生物粘附制劑、 基質(zhì)和/或其代謝（降解）產(chǎn)物應不會導致局部毒害組織（histotoxic)或致癌效應，而不 干擾身體的自然愈合機制。
[0006] 生物粘附劑可被用于許多外科手術(shù)過程，包括角膜穿孔、外陰切開術(shù)、剖腹產(chǎn)情 況、唇裂、皮膚和骨移植術(shù)、肌腱修復、疝氣、甲狀腺手術(shù)、牙周手術(shù)、牙齦切除術(shù)、牙植入、口 腔潰瘍、胃靜脈曲張、內(nèi)部器官諸如肝和胰的傷口、外部和內(nèi)部醫(yī)療器械的附著和固定以及 更多。
[0007] 使用適當?shù)纳镎掣讲牧洗鎮(zhèn)鹘y(tǒng)的打釘和鍍覆方法（plating method)固定斷 裂的硬組織也被認為是有吸引力的技術(shù)。優(yōu)勢包括提供從一個斷裂側(cè)面至另一個斷裂側(cè)面 的最佳負荷轉(zhuǎn)換，避免應力遮蔽現(xiàn)象，以及修復小或薄的骨碎片的能力。然而，盡管有明確 的醫(yī)療需要，至今不存在可用于臨床應用的硬組織生物粘附產(chǎn)品。
[0008] 作為組織粘合劑或組織密封劑有用的幾種材料是當前可用的。
[0009] 當前可用的一類粘合劑是氰基丙烯酸酯粘合劑。氰基丙烯酸酯，諸如2-辛基氰 基丙烯酸酯，稱為Dermabond?，對組織形成強大的粘合，使快速止血成為可能，并且具有 與存在于生物表面的流體接觸時聚合的能力。然而，發(fā)現(xiàn)氰基丙烯酸酯粘合劑是細胞毒性 的，預固化的粘合劑制劑的粘度過低，且固化的氰基丙烯酸酯基體是剛性的并不可生物降 解的，干擾正常的傷口愈合。因此，非最佳粘度、高撓曲模量和動物實驗中癌癥的報道限制 使用氰基丙烯酸酯表面施用在口腔黏膜以及危及生命的動靜脈上。
[0010] 其他已知的生物粘附制劑是基于明膠-間苯二酚-甲醛，其中明膠和間苯二酚的 混合物在通過加入甲醛的幾十秒內(nèi)溫熱和交聯(lián)。從此類制劑形成的生物粘合劑的優(yōu)勢是足 夠的粘結(jié)強度；然而，細胞毒性遮蔽了該優(yōu)勢。
[0011] 用作組織封閉劑的另一種類型的當前可用的生物粘附利用源自牛和/或人類來 源的組分。例如，基于纖維蛋白的粘合劑制劑通常通過將纖維蛋白原和因子XIII的溶液與 凝血酶和CaCl2的溶液混合來制備。將兩種溶液通過配備了混合噴嘴的雙注射器施加，并 且該反應類似于血液凝固中白色纖維蛋白凝塊。商購可得的實例包括Baxter Tisseel?和 Ethicon Crosseal?。基于纖維蛋白的生物粘附基質(zhì)的優(yōu)勢包括止血效應、生物可降解性、 對結(jié)締組織的良好粘附力和促進傷口愈合。如同使用任何人類起源的產(chǎn)物，缺點包括低強 度（粘合和凝聚）、低粘度（難于僅應用于期望的部位）和感染的風險。在美國，纖維蛋白 粘合劑從患者自身的血液制備，以防止污染；然而，該過程耗時且昂貴。其他限制因素包括 在手術(shù)后幾日可復發(fā)的肺手術(shù)中的空氣泄漏，可能由于纖維蛋白粘合劑橋的過快的吸收。
[0012] 其他已知的生物粘附劑是基于蛋白的組織粘附劑，其基于白蛋白或明膠。還描述 了加入多胺，特別是聚（賴氨酸）或殼聚糖、或聚羧酸鹽/酯，特別是檸檬酸或聚（丙烯酸）， 以增加交聯(lián)的速率。然而，此類生物粘合劑通常特征為不足的生物相容性和強度。
[0013] Sung 等人[Journal of Biomedical Materials Research,卷 46,期 4, 520 - 530 頁，15S印tember 1999]報道了評價各種生物粘附制劑，包括基于明膠、藻酸鹽和碳二亞胺 的制劑。然而，由Sung等人報道的制劑，是基于約600mg/ml明膠含量或更高，其不提供可 行的生物粘附制劑。
[0014] 另外的【背景技術(shù)】包括美國專利申請?zhí)?0030083286、20040156794、20060013873、 20090098176、US20090099149 和 20110280952,以及美國專利號 5, 284, 659 和 5, 955, 502， 以及 Hsu, S.等人，Biorheology, 2007. 44(1) :17-28 頁；0tani，Y.等人，Biomateri als，1996.17 (14) :1387-1391 頁；Bae，S.K.等人，Journal of Adhesion Science and Technology, 2002. 16 (4) :361-372 頁；Mo, X.等人，Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 2000. 11(4) :341-351 頁；McDermott，M. K.，等人，Biomacromo lecules, 2004. 5 (4) :1270 頁；Mo, X.等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010. 94(1) :326-332 頁；以及 0kino，H·,等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2002. 59 (2) :233-245 頁。
[0015] 發(fā)明概沭
[0016] 本發(fā)明人已設計并成功地制備和實踐了能夠形成生物粘附基質(zhì)的新穎生物粘附 制劑，其特征為快速固化、最佳的粘度、高粘合強度、柔性、生物相容性和生物可降解性。
[0017] 本文中呈現(xiàn)的生物粘附制劑包括明膠、藻酸鹽和偶聯(lián)劑，并且還可包括生物活性 齊U，用于形成藥物洗脫生物粘附基質(zhì)（drug-eluting bioadhesive matrices)。
[0018] 因此呈現(xiàn)的生物粘附制劑和基質(zhì)可有利地用于各種生物和醫(yī)學程序。
[0019] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的方面，提供了生物粘附制劑，其包含明膠、藻 酸鹽、偶聯(lián)劑、水和至少一種生物活性劑；該制劑特征為范圍從IPa-sec至50Pa_sec的室溫 粘度。
[0020] 在一些實施方案中，生物粘附制劑意圖在固化后形成藥物洗脫生物粘附基質(zhì)，其 中用于形成該基質(zhì)的固化時間范圍為從5秒至30分鐘。
[0021] 在一些實施方案中，生物粘附制劑是使得基質(zhì)特征為以下的至少一個：
[0022] 范圍從2, 000帕至60, 000帕的有生命力的生物對象的粘合強度；
[0023] 生理條件下范圍從0. 5Mpa至200MPa的撓曲強度；以及
[0024] 范圍從7天至6個月的生物可降解速率。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了生物粘附制劑，其包含明膠、藻 酸鹽、偶聯(lián)劑、和水；該制劑特征為范圍從IPa-sec至50Pa_sec的室溫粘度。
[0026] 在一些實施方案中，本文描述的任何制劑中的明膠的濃度范圍為從50mg/ml至 500mg/ml〇
[0027] 在一些實施方案中，本文描述的任何制劑中的藻酸鹽的濃度范圍為從5mg/ml至 100mg/ml〇
[0028] 在一些實施方案中，本文描述的任何制劑中的偶聯(lián)劑的濃度范圍為從lmg/ml至 50mg/ml〇
[0029] 在一些實施方案中，明膠的濃度范圍為從200mg/ml至300mg/ml，藻酸鹽的濃度范 圍為從20mg/ml至40mg/ml，且偶聯(lián)劑的濃度范圍為從10mg/ml至30mg/ml。
[0030] 在一些實施方案中，如本文描述的生物粘附制劑還包括選自由以下組成的組的交 聯(lián)促進劑：NHS-酯、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)、磺基-NHS、HOBt、HOAt、HBtU、HCtU、HAtU、 TBtU、PyBOP、DIC和五氟苯酚。
[0031] 在一些實施方案中，本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑還包括如本文描述的填料。
[0032] 在一些實施方案中，如本文描述的生物粘附制劑被鑒定為用于將至少兩個對象彼 此粘合，該對象中的至少一個為生物對象。
[0033] 在一些實施方案中，如本文描述的生物粘附制劑在離體、體外或原位制備。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了如本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑在 制造用作生物粘附基質(zhì)的產(chǎn)品中的用途，并且，如果該制劑包含生物活性劑，用作藥物洗脫 生物粘附基質(zhì)。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了如本文呈現(xiàn)的制劑在制造用于 將至少兩個對象彼此粘合的產(chǎn)品中的用途，該對象中的至少一個為生物對象。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了通過固化本文呈現(xiàn)的制劑形成 的生物粘附基質(zhì)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了通過制備本文呈現(xiàn)的包括生物 活性劑的制劑，并允許經(jīng)過固化時間而形成的藥物洗脫生物粘附基質(zhì)。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了包括如本文呈現(xiàn)的生物粘附制 劑的試劑盒。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了形成生物粘附基質(zhì)或藥物洗脫 生物粘附基質(zhì)的方法，該方法通過制備如本文呈現(xiàn)的制劑并允許經(jīng)過固化來進行。
[0040] 在一些實施方案中，該方法還包括：將制劑施加在對象的至少一個上；并且鄰接 對象。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了將至少兩個對象彼此粘合的方 法，該對象中的至少一個為生物對象，該方法通過以下來進行：制備如本文呈現(xiàn)的制劑；將 該制劑施加在對象的至少一個上；鄰接對象；并允許經(jīng)過固化時間。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了包括彼此共價偶聯(lián)的明膠和藻 酸鹽的生物粘附基質(zhì)。
[0043] 在一些實施方案中，基質(zhì)還包括封存在其中的至少一種生物活性劑，由此形成藥 物洗脫生物粘附基質(zhì)。
[0044] 在一些實施方案中，本文描述的任何生物粘附基質(zhì)特征為以下的至少一個：
[0045] 范圍從2, 000帕至60, 000帕的有生命力的對象的粘合強度；在生理條件下范圍從 0. 5Mpa至200MPa的撓曲強度；以及范圍從7天至6個月的生物可降解速率。
[0046] 在一些實施方案中，任何生物粘附基質(zhì)通過制備本文中呈現(xiàn)的生物粘附制劑，并 允許經(jīng)過固化時間來形成。
[0047] 在一些實施方案中，制劑的制備發(fā)生在離體、體外或原位。
[0048] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然類似或等于本文描述的方法和材料的方法和材 料可被用于實踐或測試本發(fā)明的實施方案，但是示例性方法和/或材料描述如下。在沖突 的情況下，將以本專利說明書，包括定義為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的，并 非意圖必然是限制性的。
[0049] 附圖簡沭
[0050] 本發(fā)明的一些實施方案在本文中，僅通過示例的方式，參考附圖來描述?，F(xiàn)將詳 細地參考特定附圖，通過示例的方式并出于說明討論本發(fā)明的實施方案的目的突出顯示細 節(jié)。就這點而言，結(jié)合附圖的描述使得可如何實踐本發(fā)明的實施方案對于本領域技術(shù)人員 變得明顯。
[0051] 在附圖中：
[0052] 圖1示出了顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附制劑中明膠和藻 酸鹽濃度對所得的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的比較直方圖，其中制劑中EDC的濃度 為4mg/ml，明膠濃度變化如下：100mg/ml (左列）、150mg/ml (中列）和200mg/ml (右列）， 且藻酸鹽濃度變化如下：20mg/ml (黑色柱）、40mg/ml (灰色柱）和60mg/ml (白色柱）；
[0053] 圖2示出了顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附制劑中偶聯(lián)劑 (EDC)濃度對所得的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的直方圖，制劑中偶聯(lián)劑（EDC)濃度 變化如下：0mg/ml、4mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml EDC，其中在制劑中明膠濃度為 200mg/ml，且藻酸鹽濃度為40mg/ml ;
[0054] 圖3示出了顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附基質(zhì)的粘合強度 作為通過將明膠-藻酸鹽混合物與偶聯(lián)劑EDC混合形成預固化生物粘附制劑后的時間的函 數(shù)的散點圖，所述示例性生物粘附基質(zhì)從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制劑得到；
[0055] 圖4示出了顯示水吸收（溶脹率）作為示例性生物粘附基質(zhì)的浸入時間的函數(shù)的 散點圖，如對從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制 劑獲得的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附基質(zhì)測量的；
[0056] 圖5示出了顯示布比卡因含量對從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、和20mg/ ml EDC的示例性生物粘附制劑得到的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附基質(zhì) 的粘合強度的效應的直方圖，其中"A"表示無藥物樣品、"B"表示裝載了 1% w/v布比卡因 的樣品、"C"表示2% w/v布比卡因、以及"D"表示裝載了 3% w/v布比卡因的樣品；
[0057] 圖6示出了顯示布洛芬含量對從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制劑得到的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附基質(zhì)的粘 合的效應的直方圖，其中"A"表示無藥物樣品、"B"表示裝載了 l%w/v布洛芬的樣品、"C" 表示2% w/v布洛芬、以及"D"表示裝載了 3% w/v布洛芬的樣品；
[0058] 圖7示出了顯示明膠濃度對布比卡因從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生 物粘附藥物洗脫基質(zhì)（從包含40mg/ml藻酸鹽、20mg/ml EDC、3%w/v布比卡因和兩種明膠 濃度的示例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對具有l(wèi)〇〇mg/ml 明膠的制劑得到的結(jié)果由菱形來標記，以及具有200mg/ml明膠的制劑的結(jié)果由矩形來標 記；
[0059] 圖8示出了顯示藻酸鹽濃度對布比卡因從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性 生物粘附藥物洗脫基質(zhì)（從包含200mg/ml明膠、20mg/ml EDC、3%w/v布比卡因和三種藻酸 鹽濃度的示例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對具有20mg/ ml藻酸鹽的制劑得到的結(jié)果由菱形來標記，具有40mg/ml藻酸鹽的制劑的結(jié)果由矩形來標 記，以及具有60mg/ml藻酸鹽的制劑的結(jié)果由三角形來標記；
[0060] 圖9示出了顯示EDC濃度對布比卡因從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物 粘附基質(zhì)（從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、3% w/v布比卡因和五種EDC濃度的示 例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對不具有EDC的制劑得到 的結(jié)果由圓形來標記，具有4mg/ml EDC的制劑的結(jié)果由X來標記，具有10mg/ml EDC的制劑 的結(jié)果由三角形來標記，具有15mg/ml EDC的制劑的結(jié)果由菱形來標記，以及對具有20mg/ ml EDC的制劑得到的結(jié)果由矩形來標記；
[0061] 圖10示出了顯示布比卡因濃度對布比卡因從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例 性生物粘附藥物洗脫基質(zhì)（從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、20mg/m EDC和三種布比 卡因濃度的示例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對具有1% w/v布比卡因的制劑得到的結(jié)果由三角形來標記，具有2% w/v布比卡因的制劑的結(jié)果由菱 形來標記，以及具有3% w/v布比卡因的制劑的結(jié)果由矩形來標記；
[0062] 圖11示出了顯示EDC濃度對布洛芬從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物 粘附藥物洗脫基質(zhì)（從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、3% w/v布洛芬和三種EDC濃度 的示例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對具有l(wèi)〇mg/ml EDC 的制劑得到的結(jié)果由三角形來標記，具有15mg/ml EDC的制劑的結(jié)果由菱形來標記，以及具 有20mg/ml EDC的制劑的結(jié)果由來矩形標記；
[0063] 圖12示出了顯示布洛芬濃度對布洛芬從根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生 物粘附藥物洗脫基質(zhì)（從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽、20mg/ml EDC和三種布洛芬 濃度的示例性生物粘附制劑得到）的釋放特性的效應的比較散點圖，其中對具有1 % w/v布 洛芬的制劑得到的結(jié)果由三角形來標記，具有2% w/v布洛芬的制劑的結(jié)果由菱形來標記， 以及具有3% w/v布洛芬的制劑的結(jié)果由矩形來標記；
[0064] 圖13示出了顯示明膠濃度對從包含40mg/ml藻酸鹽和20mg/ml EDC的示例性生 物粘附制劑得到的示例性生物粘附基質(zhì)的水吸收的效應的比較直方圖，其中白色柱表示對 包含100mg/ml明膠的生物粘附制劑得到的結(jié)果，且灰色柱表示對包含200mg/ml明膠的生 物粘附制劑獲得的結(jié)果；
[0065] 圖14示出了顯示藻酸鹽濃度對從包含200mg/ml明膠和20mg/mlEDC的示例性生 物粘附制劑得到的示例性生物粘附基質(zhì)的水吸收的效應的比較直方圖，其中白色柱表示對 包含20mg/ml藻酸鹽的生物粘附制劑得到的結(jié)果，且灰色柱表示對包含40mg/ml藻酸鹽的 生物粘附制劑獲得的結(jié)果；
[0066] 圖15示出了顯示EDC濃度對從包含200mg/ml明膠和40mg/ml藻酸鹽的示例性生 物粘附制劑得到的示例性生物粘附基質(zhì)的水吸收的效應的比較直方圖，其中白色柱表示對 包含10mg/ml EDC的生物粘附制劑得到的結(jié)果，且灰色柱表示對包含20mg/ml EDC的生物 粘附制劑獲得的結(jié)果；
[0067] 圖16示出了顯示在預先與根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附制劑的 組分即明膠或藻酸鹽溫育24小時的培養(yǎng)基的存在下，成纖維細胞的細胞活力的變化的比 較直方圖，而在常規(guī)培養(yǎng)基的存在下保持的細胞用作對照，其中白色柱表示時間點〇時獲 得的結(jié)果，且黑色柱表示24小時后獲得的結(jié)果；以及
[0068] 圖17A-B示出了顯示在從包含200mg/ml明膠和40mg/ml藻酸鹽（圖17A)，或 300mg/ml 明膠和 30mg/ml 藻酸鹽（圖 17B)和不同濃度的 EDC(0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、 15mg/ml和20mg/ml)的示例性生物粘附制劑得到的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性 生物粘附基質(zhì)的存在下，成纖維細胞的存活力的變化的比較直方圖，其中白色柱表示24小 時后獲得的結(jié)果，且黑色柱表示48小時后獲得的結(jié)果；
[0069] 圖18A-B示出了顯示基于阿爾瑪藍（Alamar-Blue)還原實驗，溶液中布比卡因 (圖18A)和布洛芬（圖18B)濃度對成纖維細胞的細胞毒性效應的比較直方圖，而將顯著差 異標記為；
[0070] 圖 19A-D 示出了使用明膠（200mg/ml)、藻酸鹽（40mg/ml)和 EDC (20mg/ml)，沒有 加入藥物（圖19A)和以1% w/v布比卡因裝載（圖19B-D)制備的生物粘附基質(zhì)在不同放 大率下的ESEM斷口組織照片；
[0071] 圖 20A-B 示出了使用明膠（200mg/ml)、藻酸鹽（40mg/ml)和 EDC(20mg/ml), 以1 % w/v布洛芬）裝載制備的生物粘附基質(zhì)在不同放大率下的ESEM斷口組織照片 (fractograph)；
[0072] 圖21A-B示出了顯示HA (圖21A)和β-TCP (圖21B)對包含明膠（200mg/ml)、藻 酸鹽（40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附基質(zhì)對 軟組織的粘合強度的效應的比較直方圖，而將顯著差異標記為
[0073] 圖22A-B示出了顯示HA (圖22A)和β -TCP (圖22B)對包含明膠（200mg/ml)、藻 酸鹽（40mg/ml)和減少的EDC(10mg/ml)的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物粘附 基質(zhì)對軟組織的粘合強度的效應的比較直方圖，而將顯著差異標記為；
[0074] 圖23示出了顯示HA和β -TCP的加入對包含明膠（200mg/ml)、藻酸鹽（40mg/ml) 和EDC(20mg/ml)的選擇的生物粘附制劑對硬組織（骨）的粘合強度的效應的直方圖，而將 顯著差異標記為
[0075] 圖 24A-F 是由包含明膠（200mg/ml)、藻酸鹽（40mg/ml)和 EDC(20mg/ml)以 及0.125%￥八擬（圖24六）、0.5%￥八擬（以不同放大率的圖248和24〇、0.125%界/ νβ-TCP (圖24D)和0. 5% ?/νβ---Ρ (以不同放大率的圖24E和24F)的根據(jù)本發(fā)明的一 些實施方案的生物粘附制劑制備的生物粘附基質(zhì)的ESEM斷口組織照片；
[0076] 圖25A-B示出了顯示改變EDC濃度對基于包含200mg/ml明膠和40mg/ml LV藻 酸鹽（Ge-200:Al-40,圖 25A)和 300mg/ml 明膠和 30mg/ml LV 藻酸鹽（Ge-300:Al-30,圖 25B)的生物粘附制劑的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的直方圖，而顯著差異由來指 示；
[0077] 圖26A-B示出了顯示明膠的布魯姆數(shù)（Bloom number)對從包含200mg/ml明膠、 40mg/ml LV藻酸鹽和20mg/ml EDC的生物粘附制劑得到的生物粘附基質(zhì)的粘合強度（圖 26A)，和其相應無 EDC的Ge:Al溶液的粘度（圖26B)的效應的直方圖，而顯著差異由 來指示；
[0078] 圖27A-C示出了顯示明膠和藻酸鹽濃度對由包含20mg/ml EDC、各種LV藻酸鹽濃 度和200mg/ml明膠（圖27A)、300mg/ml明膠（圖27B)和400mg/ml明膠（圖27C)的制劑 制備的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的直方圖，而顯著差異由來指示；
[0079] 圖28A-C示出了顯示藻酸鹽的粘度對由具有200mg/ml (圖28A)、300mg/ml (圖 28B)和400mg/ml明膠（圖28C)的不同明膠濃度（布魯姆數(shù)=90-110)的根據(jù)本發(fā)明的實 施方案的生物粘附制劑制備的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的比較直方圖，而黑色柱表 示LV藻酸鹽，白色柱表示HV藻酸鹽，藻酸鹽濃度以X軸來指示，且EDC濃度在所有測試中 為20mg/ml (在具有類似濃度但不同類型的藻酸鹽的粘合劑的粘合強度之間的顯著差異由 來指示，且各種HV藻酸鹽粘合劑的粘合強度之間的顯著差異由"v"來指示）；
[0080] 圖29示出了顯示藻酸鹽濃度和其粘度對包含具有90-110的布魯姆數(shù)和200mg/ml 的濃度的明膠的明膠-藻酸鹽溶液的粘度的效應的比較直方圖，而黑色柱表示LV藻酸鹽， 白色柱表示HV藻酸鹽；
[0081] 圖30示出了描述生物粘附制劑組分的參數(shù)對粘合強度的效應的定性模式的示意 流程圖表示，而框中的箭頭表示其中某一參數(shù)的減少導致下一個增加的實施方案，而所有 其他實施方案，某一參數(shù)的增加導致下一個的增加；
[0082] 圖31A-B不出了顯不EDC和NHS對根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的基于明膠-藻酸 鹽的生物粘附制劑的粘合強度的組合效應的比較直方圖，而明膠濃度為200mg/ml、藻酸鹽 濃度為40mg/ml，且柱上的數(shù)字表示制劑中NHS的百分比（圖31A)，和比較了展示最高粘合 強度的生物粘附基質(zhì)的直方圖（圖31B);以及
[0083] 圖32A-B示出了顯示示例性抗生素藥物克林霉素對從包含200mg/ml明膠、40mg/ ml藻酸鹽、和20mg/ml EDC的根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性生物制劑得到的示例 性生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應的直方圖，而柱上的數(shù)值表示制劑中克林霉素的百分比 (圖32A)，以及NHS和克林霉素的加入對從包含200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽和10mg/ mlEDC的生物粘附制劑得到的基質(zhì)的粘合強度的效應的直方圖（圖32B)。
[0084] 發(fā)明的特定實施方案的描沭
[0085] 本發(fā)明在其一些實施方案中涉及生物粘附基質(zhì)，且更具體地，但不排他地，涉及生 物粘附基質(zhì)、用于形成生物粘附基質(zhì)的制劑和試劑盒，以及其用于粘附兩個或更多個對象， 包括生物對象諸如有生命力的組織、器官以及類似的對象的用途。
[0086] 參考附圖和所附說明書可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。
[0087] 在詳細地解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應當理解本發(fā)明不限于其應用于 以下說明書中闡述的或由實施例示例的詳細內(nèi)容。本發(fā)明能夠以各種方式實踐或進行其他 實施方案。還應理解，本文應用的措辭和術(shù)語是用于描述的目的，不應被視為限制。
[0088] 當簡化本發(fā)明以實踐時，本發(fā)明人已開發(fā)并研究了基于明膠、藻酸鹽和偶聯(lián)劑諸 如EDC，并尤其可有效地被用于粘附軟組織的高效生物粘附制劑。
[0089] 當進一步開發(fā)這些生物粘附制劑時，證明了這些生物粘附制劑形成可封存生物活 性劑并隨后有效洗脫生物活性劑，諸如各種麻醉劑和止痛藥的生物粘附基質(zhì)。本發(fā)明人使 用布比卡因和布洛芬作為示例性生物活性劑已實踐了這一藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的新穎 概念。研究了生物粘附制劑的組分對所得生物粘附基質(zhì)的粘合強度和藥物釋放特性的效 應，以及這些生物粘附基質(zhì)的生物相容性。
[0090] 當進一步開發(fā)這些生物粘附制劑時，發(fā)現(xiàn)某些填料，諸如羥基磷灰石（HA)和 β-磷酸三鈣（β-TCP)的加入提供了對硬組織的高效生物粘附。當簡化本發(fā)明的一些實 施方案以實踐時，還證明了這些填料增加生物粘附基質(zhì)對硬組織的粘合強度的潛力；發(fā)現(xiàn) ΗΑ和β -TCP改進生物粘附基質(zhì)，因此得到可被用于軟組織和硬組織兩者應用的生物粘附 制劑。
[0091] 如本文使用的術(shù)語"生物粘附"是指物質(zhì)（例如，制劑或基質(zhì)）的以下特征，根據(jù) 該特征，當物質(zhì)與活組織接合時，該特征使向活組織粘附對象諸如，例如，另一個活的軟和/ 或硬組織、活組織本身和/或無生命對象成為可能。
[0092] 因此如本文使用，生物粘附制劑是指應用于此類活組織和/或待粘附到活組織的 對象，以期粘附活組織和對象的制劑；且生物粘附基質(zhì)是指將粘附于其上的活組織和對象 粘合在一起的物質(zhì)。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了包括以下的生物粘附制劑：
[0094] a)明膠；
[0095] b)藻酸鹽；
[0096] c)偶聯(lián)劑；和
[0097] d)水。
[0098] 此處應當注意和下文中所詳細討論的，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，制劑被定義 為成分的集合，其可被發(fā)現(xiàn)呈其中將所有組分混合成同一混合物的一種調(diào)和物的形式，或 呈單獨定量的成分，例如，單獨定量的溶劑和干成分的形式。
[0099] 如本文所提到的生物粘附制劑是相應生物粘附基質(zhì)的前體。
[0100] 在一些實施方案中，生物粘附基質(zhì)通過固化生物粘附制劑來形成，使得該生物粘 附制劑可被視為預固化制劑。
[0101] 生物粘附制劑的基本成分：
[0102] 如本文公開的生物粘附制劑包含至少兩種類型的聚合物（例如，藻酸鹽和明膠） 和偶聯(lián)劑。
[0103] 生物粘附制劑設計為在偶聯(lián)劑的存在下經(jīng)歷交聯(lián)反應。
[0104] 不受限于任何特定的理論，假設交聯(lián)反應涉及明膠鏈與藻酸鹽鏈的交聯(lián)，基本上 通過將明膠中的伯胺與藻酸鹽中的羧基基團，和/或與一個或更多個其他的明膠分子偶 聯(lián)。當使用包含明膠作為主要組分和藻酸鹽作為相對于明膠的次要組分的流體制劑時，假 定大部分交聯(lián)在明膠和藻酸鹽之間形成?；旧鲜敲髂z和藻酸鹽的交聯(lián)聚合物的這一網(wǎng) 絡，在本文中稱為基質(zhì)，是流體生物粘附制劑的固化的半固體、凝膠產(chǎn)物。因此，該基質(zhì)被視 為通過使用偶聯(lián)劑將明膠和藻酸鹽偶聯(lián)得到的偶聯(lián)的明膠-藻酸鹽基質(zhì)。
[0105] 如本文中使用的，并且是本領域中已知的，術(shù)語"明膠"描述了可在特定條件下形 成凝膠的水溶性蛋白。明膠通常通過在膠原的酸性或堿性和部分水解條件下熱溶解來獲 得。A型明膠通過酸方法來獲得，并具有引起正電荷的高密度的氨基基團。B型明膠通過堿 方法來獲得，并具有引起負電荷的高密度的羧基基團。存在不同來源的膠原，諸如動物皮和 骨，其提供具有一系列物理和化學特性的各種明膠形式。通常，明膠包含以部分有序的方式 連接的十八種氨基酸；甘氨酸或丙氨酸是殘基的約三分之一至一半，脯氨酸或羥脯氨酸是 約四分之一，且剩余等等包括酸性或堿性氨基酸殘基。通常，為了在水中溶解明膠，有必要 通過加熱或攪拌并加入熱水以達到至少35°C的溫度。適度加熱提高溶解度，而重度加熱可 導致明膠的聚集或部分水解。明膠的粘度隨種類、濃度、時間和溫度而變化。與堿處理過的 明膠相比，酸處理過的明膠具有輕微較大的固有粘度。明膠相對便宜，其是生物相容的，具 有可忽略的免疫問題，并且其是可生物降解的。"布魯姆（Bloom)"是測量凝膠或明膠的強 度的測試。該測試確定由探針（通常具有0.5英寸的直徑）偏轉(zhuǎn)凝膠的表面4_而不破壞 它需要的重量（以克為單位）。結(jié)果以布魯姆等級或布魯姆數(shù)來表示，且通常在30布魯姆 和300布魯姆之間。為了對明膠進行布魯姆測試，在進行測試之前，將6. 67%明膠溶液在 10°C下保持17-18小時。
[0106] 在本發(fā)明的實施方案的上下文中，明膠的替代選擇可包括非動物來源的凝膠， 諸如瓊脂（從海藻收獲的復雜碳水化合物）、角叉菜膠（從海藻收獲的復雜碳水化合 物）、果膠（在成熟的水果和蔬菜中存在的膠體碳水化合物）、魔芋（konjaka)(從魔芋屬 (Amorphophallus)植物提取的膠體碳水化合物）、瓜爾膠（瓜拉納（guaran)，從屬瓜爾豆 (Cyamopsis tetragonolobus)的瓜爾豆（cluster bean)提取的半乳甘露聚糖類型）及其 有或沒有明膠的各種組合。
[0107] 如本文中使用的，并且是本領域中已知的，術(shù)語"藻酸鹽（alginate)"描述了陰離 子多糖。在本文和本領域中還稱為藻酸（alginic acid)的藻酸鹽，是包含β-D甘露糖醛 酸單體（M段）和α-L古洛糖醛酸（G段）的嵌段共聚物，不同形式的藻酸鹽具有Μ/G的不 同比。如本文使用的術(shù)語"藻酸鹽"包含各種Μ/G比。Μ/G比根據(jù)藻類/植物的種類、來源 和收獲季節(jié)而變化。
[0108] 在一些實施方案中，藻酸鹽具有范圍從0. 3至4、從0. 7至3、或從1至2的Μ/G比。 在其他實施方案中，Μ/G 比為 0· 7、0· 9、1、1· 3、1· 5、1· 7、1· 9、2、2· 3、2· 5、2· 7、3、3· 5 或 4。
[0109] 已知藻酸鹽通過結(jié)合水形成粘性膠狀物（在水中能夠吸收其自身重量的200-300 倍）。
[0110] 在溫和條件下在水溶液中，通過與在相鄰藻酸鹽鏈的G-段之間結(jié)合的二價陽離 子相互作用，藻酸鹽經(jīng)歷可逆凝膠化，產(chǎn)生離子間鏈橋。由于藻酸鹽通常為具有羧基端的陰 離子聚合物，其是已知的并用作良好的粘膜粘附劑。
[0111] 天然存在的藻酸鹽通常在海洋褐藻（例如，巨藻（Macrocystis pyrifera)、泡葉 藻（Ascophyllum nodosum)和海帶（Laminaria)和土壤細菌（假單胞菌（Pseudomonas)和 固氮菌（Azotobacter)中產(chǎn)生。還涵蓋了合成制備的藻酸鹽。
[0112] 藻酸鹽相對便宜，其是生物相容的，在哺乳動物中不引起免疫應答，并且其是可生 物降解的。
[0113] 在本發(fā)明的一些實施方案的上下文中，藻酸鹽可以展示多于2Pa_SeC的高粘度 (HV)形式使用，或以展示0. 1-0. 3Pa-sec的低粘度（LV)形式使用。如下文實施例部分所 示，LV/HV藻酸鹽形式的應用增加微調(diào)和優(yōu)化本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑的另一個參數(shù)。
[0114] 如本文使用的術(shù)語"偶聯(lián)劑"，是指可在兩個或更多個官能基團之間分子內(nèi)、分子 間或兩者催化或形成鍵的試劑。偶聯(lián)劑被廣泛用于增加聚合物網(wǎng)絡并促進聚合物鏈之間的 交聯(lián)，因此，在本發(fā)明的一些實施方案的上下文中，偶聯(lián)劑是可促進聚合物鏈之間的交聯(lián)的 偶聯(lián)劑；或是可促進氨基官能基團和羧基官能基團之間，或在聚合物鏈的其他化學相容的 官能基團之間的交聯(lián)的偶聯(lián)劑；或者是可促進凝膠和藻酸鹽之間的交聯(lián)的偶聯(lián)劑。在本發(fā) 明的一些實施方案中，術(shù)語"偶聯(lián)劑"可被替換為術(shù)語"交聯(lián)劑"。在一些實施方案中，聚合 物中的一種用作偶聯(lián)劑并充當交聯(lián)聚合物。
[0115] "化學相容的"意指兩種或更多種類型的官能團可彼此相互反應以形成化學鍵。
[0116] 通常存在于明膠和藻酸鹽中的示例性官能基團，包括，但不限于，胺（主要為伯 胺-NH 2)、羧基（_C02H)、巰基和羥基（分別為-SH和-0H)、和羰基（-C0H醛和-C0-酮）。
[0117] 如在明膠中，以及各種天然存在的多糖和氨基糖苷類中發(fā)現(xiàn)的，伯胺存在于多肽 鏈的N末端（稱為α -胺）、賴氨酸（Lys，K)殘基的側(cè)鏈處（ε -胺）。因為在生理條件下 其帶正電荷，所以伯胺通常是蛋白和其他大分子向外面向的（即，發(fā)現(xiàn)在外表面上）；因此， 其通常是綴合可及的。
[0118] 羧基存在于多肽鏈的C-末端、天冬氨酸（Asp，D)和谷氨酸（Glu，E)的側(cè)鏈、以及 天然存在的氨基糖苷類和多糖諸如藻酸鹽中。如同伯胺，羧基通常在大的聚合化合物諸如 蛋白和多糖的表面上。
[0119] 巰基和羥基分別存在于半胱氨酸（Cys，C)和絲氨酸（Ser，S)的側(cè)鏈。羥基在多糖 和氨基糖苷類中是豐富的。
[0120] 羰基如酮或醛可經(jīng)各種合成和/或天然的氧化處理在糖蛋白、糖苷類和多糖類中 形成。
[0121] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，偶聯(lián)劑可根據(jù)官能基團的類型以及其間可形成的 交聯(lián)鍵的性質(zhì)來選擇。例如，羧基直接偶聯(lián)至胺可使用碳化二亞胺類偶聯(lián)劑，諸如EDC來 得到；胺可通過以下被偶聯(lián)至羧基、羰基和其他反應性官能基團：N-羥基琥珀酰亞胺酯 (NHS-酯）、亞氨酸酯（imidoester)、PFP-酯或羥甲基膦；巰基可通過以下被偶聯(lián)至羧基、羰 基、胺和其他反應性官能基團：馬來酰亞胺、鹵乙?；ㄤ?或碘_)、吡啶基二硫化物和乙 烯基砜；如在氧化的碳水化合物中的醛類，可被酰肼偶聯(lián)至其他反應性官能基團；且羥基 可被異氰酸酯偶聯(lián)至羧基、羰基、胺和其他反應性官能基團。
[0122] 因此，可在本發(fā)明的一些實施方案中使用的合適的偶聯(lián)劑包括，但不限于，碳化二 亞胺、NHS-酯、亞氨酸酯、PFP-酯或羥甲基膦。
[0123] 碳化二亞胺是促進羧基對伯胺直接偶聯(lián)（綴合）的完全交聯(lián)劑。因此，不像其他 試劑，碳化二亞胺是零長度交聯(lián)劑；其不會成為偶聯(lián)的分子之間的最終交聯(lián)的部分。因為 肽、蛋白、多糖和氨基糖苷類包含多個羧基和胺，所以直接碳化二亞胺介導的偶聯(lián)/交聯(lián)通 常導致多肽的無規(guī)聚合。
[0124] EDC，或N-(3-二甲基氨基丙基）-Ν' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽，是使羧基和氨基基團 之間縮合以形成酰胺鍵和副產(chǎn)物脲成為可能的廣泛使用的碳化二亞胺類偶聯(lián)劑和交聯(lián)劑。 與胺/羥基反應物進行反應后，EDC不存在于偶聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中；因此其生物相容性和生物 可降解性在本實施方案的上下文中不是問題。當明膠分子顯示羧基和氨基基團兩者時，該 類型的聚合物可通過EDC經(jīng)歷分子間交聯(lián)。
[0125] 已知EDC和其尿素衍生物是細胞毒性的并抑制細胞生長。在活組織中針對氨基和 羧基基團的該高反應性，以及尿素衍生物的釋放，可能是EDC的細胞毒性的基礎。
[0126] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，碳化二亞胺類偶聯(lián)劑的替代選擇，包括但不限于，乙 二醛、甲醛、戊二醛、聚戊二醛、葡聚糖、檸檬酸衍生物、微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和京尼平。
[0127] 在一些實施方案中，偶聯(lián)劑在偶聯(lián)反應期間被用完，并且生成尿素衍生物作為胺 和羧基基團之間的偶聯(lián)反應的副產(chǎn)物。尿素衍生物的性質(zhì)由所用的偶聯(lián)劑的性質(zhì)決定。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，各種偶聯(lián)劑和交聯(lián)劑可被組合或用作基于明膠和藻 酸鹽和偶聯(lián)劑的任何給定的生物粘附制劑中的添加劑，以進一步促進交聯(lián)反應。在一個代 表性的實施例中，將NHS-酯加入至碳化二亞胺類偶聯(lián)劑，諸如EDC中。
[0129] 向EDC的交聯(lián)反應加入NHS得到NHS活化的羧酸基團，其不太易水解，并且防止重 排。另一方面，高濃度下的NHS可與EDC反應并與交聯(lián)反應競爭，由此減少用于交聯(lián)的EDC 的有效量。因此，試劑諸如NHS在本文中被稱為交聯(lián)促進劑。
[0130] 在本發(fā)明的上下文中，通過加入促進偶聯(lián)反應和促進形成生物粘附基質(zhì)中交聯(lián)的 形成的各種試劑，意圖提高交聯(lián)效率和/或降低形成顯示如上文討論的期望的特性的基質(zhì) 需要的偶聯(lián)劑的量。因此，此類試劑在本文中被稱為"交聯(lián)促進劑"。交聯(lián)促進劑的量被給 定為重量/體積每重量/體積百分比（w/v/w/v)，即相對于偶聯(lián)劑的量，并根據(jù)本發(fā)明的一 些實施方案，該量的范圍為從約1 %至100%、或從1 %至200%重量/體積每重量/體積百 分比。
[0131] 交聯(lián)促進劑的代表性實例包括，但不限于，磺基-NHS、HOBt、HOAt、HBtU、HCtU、 HAtU、TBtU、PyBOP、DIC 五氟苯酚等。
[0132] 如以下實施例部分中所示，交聯(lián)劑和交聯(lián)促進劑在本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑中的 組合得到了具有改進的粘合強度的生物粘附基質(zhì)。此外，交聯(lián)劑諸如EDC和交聯(lián)促進劑諸 如N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的組合，允許顯著減少生物粘附制劑中的EDC含量。由于使用 EDC的醫(yī)療安全性和細胞毒性影響，EDC的含量的減少是有益的。
[0133] 在一些實施方案中，相對于偶聯(lián)劑的量，交聯(lián)促進劑的量可以是1%、2 %、3 %、 4 %,5 %,6 %,7 %,8 %,9 %U0 %> 12 %U4 %U6 %U8 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %, 45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%，包括1%和200%之間的任何值，或甚至可以 為更高。在本發(fā)明的一些實施方案中，相對于偶聯(lián)劑的量，交聯(lián)促進劑的量為5%、10%、 15%、20%、30%或40%，包括從5%至40%之間的任何值。
[0134] 當一前一后使用時，甚至當使用相對低濃度的EDC時，EDC和NHS得到更強粘合的 生物粘附基質(zhì)。示例性制劑包括為l〇mg/ml的EDC的量，以及相對于EDC的量為10%的NHS 的量。
[0135] 用于軟和硬組織生物粘附制劑的填料：
[0136] 為了提供適合用于在例如硬組織的環(huán)境下展示機械和化學性能的生物粘附制劑/ 基質(zhì)，生物活性填料可被加入至制劑中。已知此類填料促進骨形成和骨整合，其被視為對于 硬組織生物粘附制劑/基質(zhì)高度期望的。
[0137] 如在本發(fā)明的一些實施方案的上下文中使用的術(shù)語"填料"，是指通?；诟缓V 物質(zhì)來源的物質(zhì)，其是生物相容的、無毒的，并且能夠機械地加強基質(zhì)，并在一些實施方案 中，能夠促進骨形成和骨整合。在一些實施方案中，"填料"物質(zhì)以水不溶性物質(zhì)，即具有水 性介質(zhì)中低溶解度的細粉末的形式存在于本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑中。
[0138] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，一些填料，至少在一定顯著程度上，也是生物可吸收 的，如可通過其生理吸收時間來評估的。已表明，一些生物可吸收的填料物質(zhì)不僅作為防止 軟組織向內(nèi)生長的簡單的空間填料。此類填料物質(zhì)，在經(jīng)歷生理吸收后，可留下被發(fā)現(xiàn)是長 期穩(wěn)定的并充當用于新骨形成的骨傳導框架的一致網(wǎng)格的礦物質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)其促進對骨形成 是必不可少的血管的形成。
[0139] 如本文使用的術(shù)語"可吸收的"是指可經(jīng)受吸收的物質(zhì)，如該術(shù)語在下文中被定義 的。當吸收過程在生物系統(tǒng)中發(fā)生時，該物質(zhì)被稱為"生物可吸收的"。
[0140] 如本文使用的術(shù)語"吸收"，描述了物質(zhì)通過化學、生物和/或生理過程的損耗。通 常，該術(shù)語在本文和本領域中用于描述這樣的過程，其涉及物質(zhì)的分解，通過例如，化學或 物理分解，諸如溶解、水解和/或吞噬作用，其可隨后通過人體經(jīng)由，例如，代謝吸收和/或 排泄分解產(chǎn)物。因此，術(shù)語吸收通常在本文和本領域稱為"生物吸收"。因此，如本文使用的 短語"吸收期間"，是指吸收過程的時間段。
[0141] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，填料的非限制性的實例，包括以下所列的材料（一 些在括號中列出了其近似生理性吸收時間）：所有水合形式的硫酸鈣、各種結(jié)晶形式的磷 酸三鈣（Ca 3(P04)2)、β-磷酸三鈣（β-TCP) (4-12個月）、微多孔羥基磷灰石（HA)顆粒 (18-36個月）、具有合成肽的牛衍生的羥基磷灰石（18-36個月）、鈣化藻（6-18個月）、 合成顆粒狀玻璃陶瓷（生物活性玻璃，18-24個月）、自體骨屑（3-7個月）、異體松質(zhì)骨 (allogeneic cancellous bone) (6-15 個月）、福射松質(zhì)異體骨（irradiated cancellous allogeneic bone) (4-12個月）、無機牛骨（15-30個月）、多孔無機晶體（4-10個月）、多孔 珊瑚羥基磷灰石（5-7年）以及涂覆了氫氧化鈣的微孔Bioplant HTR聚合物的復合材料 (10-15 年）。
[0142] 本文中應注意，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，取決于應用和預期用途，填料可呈細粉末 或粗粉末的形式，即其顆?？烧宫F(xiàn)直徑范圍從約1 μ m至約2mm的平均粒徑。在一些實施方 案中，填料的平均粒徑范圍為從直徑2 μ m-30 μ m、5 μ m-20 μ m、15 μ m-40 μ m、20 μ m-50 μ m、 50 μ m_60 μ m 或 50 μ m-100 μ m〇
[0143] 如以下的實施例部分所示，將兩種類型的示例性生物活性陶瓷填料羥基磷灰石 (HA)和β -磷酸三鈣（β -TCP)加入至本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑，以在使用更低量的交聯(lián)劑 (例如，EDC)時得到相對于相應無填料制劑，展現(xiàn)改進的粘合強度的生物粘附制劑/基質(zhì)， 并且還發(fā)現(xiàn)非常適合于硬組織，諸如骨。這兩種示例性填料特征為良好的生物相容性和無 毒性，但并作為能夠促進骨形成和骨整合。
[0144] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，根據(jù)所得的生物粘附基質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)和所得的粘合 強度，已研究了加入至生物粘附制劑中的填料諸如HA和β -TCP對離體軟組織和硬組織兩 者的效應。發(fā)現(xiàn)，由于其與制劑中的水性介質(zhì)的獨特相互作用以及其在其中的低溶解度，填 料形成推測作為基質(zhì)的機械加固起作用的纖維和聚集物。
[0145] 如以下實施例部分所示，填料諸如HA和β-TCP可被用在本文呈現(xiàn)的生物粘附 制劑中，以諸如以下的生物粘附制劑的百分比重量/體積（％w/v)的量作為粉末：0. 025、 0· 05、0· 075、0· 1、0· 125、0· 15、0· 2、0· 225、0· 25、0· 275、0· 3、0· 35、0· 4、0· 45、0· 5、0· 55、 0. 6、1、1. 5、2、3或更高。根據(jù)一些實施方案，填料的應用可允許相對于相應的無填料的生物 粘附制劑，以低濃度使用EDC。如在下文呈現(xiàn)的試驗結(jié)果中可見，根據(jù)本發(fā)明的一些示例性 實施方案，發(fā)現(xiàn)分別包含0. 5 %和0. 125% w/v濃度的HA或β -TCP的生物粘附基質(zhì)具有比 其無填料的對應物更高的粘合強度。
[0146] 可將各種添加劑加入至制劑以修飾其固化前特性，諸如例如，用于改進的應用和 延展限制的粘度調(diào)節(jié)劑、滲透促進劑、和用于在應用過程中和后續(xù)允許追蹤的著色劑或熒 光劑?？蓪⒏鞣N添加劑加入至制劑以修飾其固化后特性，即影響所得基質(zhì)的特性的添加劑， 諸如例如，另外的偶聯(lián)劑/交聯(lián)劑、借助于為用于各種藻酸鹽物質(zhì)的交聯(lián)劑充當膠凝劑的 鈣離子及其他稀土金屬離子、塑化劑、硬化劑、軟化劑和用于修飾基質(zhì)的撓曲模量的其他試 齊IJ，以及影響當存在時的生物活性劑的釋放速度、滲透和吸收的添加劑，如下文更詳細地討 論的。
[0147] 在本文中應注意，如同填料，可將本文描述的一些添加劑、以及一些生物活性劑以 干粉的形式加入至制劑中。這可以是為了使用簡便，希望維持減少或增加生物粘附制劑的 一定的粘度值，或簡單地因為生物活性劑的添加劑不溶于水性介質(zhì)。
[0148] 生物粘附制劑的特性：
[0149] 如上文所討論的，有效的生物粘附制劑的設計應同時考慮若干要求，包括，例如， 可加工性和效率來做出，可加工性和效率還可翻譯為安全性。
[0150] 在可加工性和安全性考慮下，有效的生物粘附制劑應在室溫下展現(xiàn)允許從業(yè)者在 例如，臨床條件下應用和使用制劑的粘度。例如，太粘并因此不容易被涂開的制劑將難以被 應用于組織，而不夠粘性并因此過度流動的制劑將是流動的并可能伴隨不期望的泄漏、粘 附不足，以及整體提高的副作用和降低的安全性。
[0151] 還在可加工性和安全性考慮下，有效的生物粘附制劑應展示以下固化時間：如本 文所定義，其允許在相對短時間內(nèi)利用制劑完成操作，使得避免可導致提高的不良副作用 和降低的安全性的延長的操作，然而，在另一方面，足夠長以允許精確定位并如果需要，任 選重定位。在一些實施方案中，例如在對象不易被最佳定位并且可需要重定位步驟的情況 下，對象的瞬時粘合可以是不被期望的；因此，在本發(fā)明的一些實施方案中極短的固化時間 可能是不切實際的。在這種情況下，期望生物粘附制劑允許一段時間用于重定位（分離和 重鄰接）待彼此粘合的對象。該時間的范圍（窗口）被稱為制劑的可工作時間，如下文進 一步討論。
[0152] 在本文中應注意，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，制劑可保持在多個分離的部分、 或溶液中，至少直到所有這些部分被混合為包含結(jié)合或伴隨其應用和使用的所有成分的 單一調(diào)和物（at least until all these parts are mixed into a single concoction comprising all ingredients in conjunction or concomitant to its application and use)。關(guān)于生物粘附制劑的多部分制劑、存儲工具、制備和應用的詳細討論在下文中來呈 現(xiàn)。
[0153] 當提及多部分生物粘附制劑的粘度時，其本質(zhì)上涉及制劑的較粘稠部分，即包含 明膠、藻酸鹽或有或沒有生物活性劑或其他添加劑的明膠和藻酸鹽的混合物的部分。只 要維持其化學組成，即賦予粘度的聚合物的濃度（或水含量）、溫度和分子結(jié)構(gòu)，則該粘性 部分將基本上保持相似的粘度?？蛇x地，關(guān)于粘度涉及在其混合后立即的包含所有成分 的制劑（a formulation comprising all ingredients shortly subsequent to their mixing)。盡管溶解的聚合物對高粘度貢獻最大，偶聯(lián)劑的加入將通過實現(xiàn)不可逆改變粘度 的交聯(lián)改變聚合物的化學組成，基本上與溫度和含水量無關(guān)。由于實際原因，當本文提及粘 度時，是指包含明膠和藻酸鹽的制劑部分，而相對于粘性部分，包含偶聯(lián)劑的部分被認為是 較少粘性和小體積。由于相對短的固化時間，使用標準和常用做法和設備測量生物粘附制 劑的粘度可能是不切實際的。明膠和藻酸鹽是粘度的主要貢獻者，而所有其他組分和添加 劑都是次要的粘度調(diào)節(jié)劑。未解決的組分是交聯(lián)劑和交聯(lián)促進劑，因為這些試劑負責硬化 制劑為固體生物粘附基質(zhì)，所以其具有對制劑的粘度的直接效應。因此，當測量制劑的粘度 時，人們可在加入交聯(lián)劑和/或交聯(lián)促進劑之前測量制劑的粘度。安全地假定缺少硬化劑 的制劑的粘度與完整制劑的粘度基本上相同。
[0154] 如下文所討論的，將生物粘附制劑表征為"可工作時間"，是指在其中所有成分被 混合在一起的時間點至其中制劑太粘稠而不能工作的時間點之間的時間段。因此，根據(jù)本 發(fā)明的一些實施方案，報道的生物粘附制劑的粘度在可工作時間期間是有效粘度。
[0155] 取決于測定方法和其他因素，動力粘度通過各種單位來量化。在本實施方案的上 下文中，動力粘度是指以牛頓秒/平方米（N s πΓ2或Pa-sec)的單位，其中IPa-sec等于1 千克/米秒（kg ι--)并等于10泊（P)。例如，據(jù)稱20°C下水具有l(wèi)mPa_sec(0. 001Pa-sec) 的動力粘度，37°C下血液特征為3-4mPa-sec的粘度，且20°C下蜂蜜為10Pa-sec。
[0156] 在本發(fā)明的上下文中，當提及生物粘附制劑的粘度時，采取沒有交聯(lián)劑和/或交 聯(lián)促進劑的制劑的實際測量的結(jié)果，并且視為完整生物粘附制劑的結(jié)果。
[0157] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的制劑特征為以下的至少一個：
[0158] 范圍從IPa-sec至50Pa_sec的室溫粘度（參考在加入偶聯(lián)劑溶液之前的明膠-藻 酸鹽溶液，或在混合在一起后立即的包含所有組分的最終生物粘附制劑）；以及
[0159] 在生理條件下，范圍從5秒至30分鐘的固化時間。
[0160] 盡管以Pa-sec單位提供動力粘度的標準，并且其值源自給定環(huán)境溫度下的特定 粘度測量值，本文應注意，動力粘度可由其他單位來表示，并由各種方法和技術(shù)來測量，所 有這些均可被用于表征任何給定的生物粘附制劑或其部分。例如，雖然室溫下測量動力粘 度是更簡單的，但由于在更高溫度，諸如50°C下對混合并制備制劑是更有效的和實用的，因 此報告并還考慮比工作溫度更高的溫度下的生物粘附制劑的動力粘度也可是有用的?？蛇x 地，由于例如，大部分操作室被保持在比室溫更低的標準溫度下，報告并考慮比標準室溫更 低的溫度下的動力粘度可以是更有益的；以及意圖在體溫應用和使用制劑時，報告并考慮 生物粘附制劑在或接近體溫下的粘度。
[0161] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附制劑的動力粘度，或包含明膠和藻酸 鹽的制劑部分的動力粘度，范圍為從20°C下IPa-sec至50Pa_sec，和/或37°C下0. 5Pa_sec 至 25Pa_sec。
[0162] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附制劑的室溫動力粘度，或包含明膠和藻 酸鹽的制劑部分的動力粘度，范圍為從IPa-sec至5Pa_sec、從5Pa_sec至10Pa-sec、從 lOPa-sec 至 15Pa_sec、從 15Pa_sec 至 20Pa_sec、從 20Pa_sec 至 25Pa_sec、從 25Pa_sec 至 30Pa_sec、從 30Pa_sec 至 35Pa_sec、從 35Pa_sec 至 40Pa_sec、從 40Pa_sec 至 45Pa_sec、或 從 45Pa_sec 至 50Pa_sec。
[0163] 如本文使用的，短語"固化時間"描述了在生物粘附制劑形成生物粘附基質(zhì)期間的 時間段，如本文描述的。
[0164] 在本文中應注意，雖然生物粘附制劑在偶聯(lián)劑與明膠和/或藻酸鹽的一種或兩種 接觸后開始固化，但該偶聯(lián)反應和交聯(lián)反應不瞬間跨越制劑的塊的整個體積（the entire bulk of the mass of the formulation)。因此，定義術(shù)語"固化時間"使得其包含基質(zhì)形 成的所有階段的整個過程，包括"可工作時間"和"粘合時間"。"可工作時間"是在將制劑的 所有成分混合在一起的時刻，與推測由于其固化過程，制劑的粘度太高而不允許制劑工作， 即應用、擴散、定位和重定位的時刻之間的時間-窗口，如上文所討論的。在上文呈現(xiàn)的生 物粘附制劑的粘度特性的上下文中，在可工作時間期間粘度是相對的，直到交聯(lián)普遍并使 制劑變得太粘稠。"粘合時間"被定義為從該制劑被施加在對象上的時刻，到彼此粘合的對 象被認為在足夠強度下粘合使得允許例如，釋放任何緊固/緊致工具（如果使用）和/或 繼續(xù)或完成該過程的時刻經(jīng)過的時間。在一定程度上，取決于制劑、其作為單個或多個部分 制劑的使用模式、使用條件和對象的類型和粘合區(qū)域，可工作時間和粘合時間可重疊，可分 別繼續(xù)彼此（continue one another respectively)，或可不連續(xù)。
[0165] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的包含混合在一起的所有成分的生物粘附 制劑的可工作時間，跨越從5秒至30分鐘。取決于制劑的需要和預期用途，可將其設計為 展示各種可工作時間，其可跨越至少30秒、至少60秒、至少120秒、至少300秒、至少600 秒、至少900秒、或至少1800秒（30分鐘）。
[0166] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑的固化時間范圍為從5秒 至30分鐘。取決于制劑的需要和預期性能，可將其設計為展示各種固化時間，其范圍可為 從5秒至30秒、從5秒至30秒、從5秒至60秒、從5秒至120秒、從10秒至300秒、從30 秒至300秒、以及從60秒至1800秒（30分鐘）?？蛇x地，在粘附過程不限于時間并且其他 參數(shù)諸如強度和柔韌性是更重要的，諸如例如裝置至患者的皮膚的局部（外部）粘附的情 況下，固化時間可比前述值更長，并且范圍可為從數(shù)秒至多于30分鐘，并且為，例如40分 鐘、50分鐘、60分鐘、以及甚至120分鐘，包括從30分鐘至120分鐘的任何中間值。
[0167] 所得的生物粘附基質(zhì)：
[0168] 生物粘附基質(zhì)是在生物粘附制劑中的一些成分之間發(fā)生的固化過程的結(jié)果，并因 此基質(zhì)包括如本文所討論的彼此偶聯(lián)的明膠和藻酸鹽，以及任選地變得與基質(zhì)相關(guān)（例 如，包埋于其中）的制劑的其他成分。
[0169] 如上文所討論的，設計如本文描述的生物粘附制劑以形成相應的生物粘附基質(zhì)， 并因此設計使得生物粘附基質(zhì)展現(xiàn)期望的性能。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，設計如本文 描述的生物粘附制劑使得在其固化后，其形成特征為以下的生物粘附基質(zhì)：如本文所定義 的有生命力的生物對象的高粘合強度、生理條件下的最佳撓曲模量、和最佳的可生物降解 速率。
[0170] 如本文所用，措辭"最佳"涉及制劑和/或相應基質(zhì)在期望的應用下的性能。就這 一點而言，應注意，不同應用可需要最佳性能的不同參數(shù)，其通?？扇Q于待粘合的對象的 類型、待粘合的對象的維度、粘合區(qū)域、需要粘附的程序的條件性質(zhì)以及取決于對象和程序 的其他參數(shù)。
[0171] 雖然各種活體組織和其他活的或無生命對象的粘合強度是生物粘附制劑/基質(zhì) 的高度期望的特性，但本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑在粘液/血漿/血液潮濕環(huán)境的生理條件 下粘附各種對象，諸如有生命力的和無生命力的組織、骨、皮膚、金屬、塑料和其他天然以及 合成的聚合物質(zhì)是有意義的能力。
[0172] 粘合強度可從在對粘合的對象的樣品進行的拉伸試驗期間創(chuàng)建的應力應變曲線 的斜率實驗性地來確定，并以力/單位面積（牛頓/平方米（N/m 2)或達因/平方厘米），即 帕斯卡（Pa)、兆帕（MPa)或千兆帕斯卡（GPa)的單位來表示。
[0173] 如本文使用的短語"粘合強度"描述了一對給定材料的粘合對象在其分裂開之前 可經(jīng)歷的拉伸應力的最大量。
[0174] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，由本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑得到的生物粘附基質(zhì)特 征為在粘合峰值下范圍從約2, 000帕斯卡（2MPa)至約60, 000帕斯卡（60MPa)的有生命 力的生物對象的最大粘合強度。根據(jù)一些實施方案，由本文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)展現(xiàn)的有 生命力的生物對象的最大粘合強度范圍為從2MPa至lOMPa、從5MPa至20MPa、從15MPa至 30MPa、從 20MPa 至 40MPa、從 30MPa 至 50MPa、或從 40MPa 至 60MPa。
[0175] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附基質(zhì)的另一種所需特性，是當在生理條件 下，特別是潮濕并從環(huán)境吸水溶脹時，其在應力和壓力下彎曲和撓曲而不從其粘合的對象 上分裂或分離的能力的程度。
[0176] 取決于預期的用途和條件，期望生物粘附基質(zhì)隨著時間并在間歇或連續(xù)運動、應 力、變形、彎曲、拉伸、壓力和磨損下執(zhí)行（在生理條件下維持其粘合作用）。根據(jù)本發(fā)明的 一些實施方案，基質(zhì)特征為在生理條件下范圍從0. 5MPa至200MPa的撓曲強度（模量）。 可選地，由本文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)在生理條件下展現(xiàn)的撓曲模量，范圍為從0. 5MPa至 5MPa、從 IMPa 至 lOMPa、從 5MPa 至 20MPa、從 lOMPa 至 15MPa、從 15MPa 至 20MPa、從 20MPa 至 30MPa、從 30MPa 至 50MPa、從 50MPa 至 lOOMPa、從 75MPa 至 150MPa、從 lOOMPa 至 150MPa、 或從 155MPa 至 200MPa。
[0177] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)是可生物降解的。
[0178] 為了有效地被用于各種內(nèi)部和外部的醫(yī)療程序中并且特別是內(nèi)部手術(shù)程序中，本 文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)還顯示了最佳的可生物降解速率，允許其以足夠長的時間粘合對象 以在崩解之前顯示其預期的用途。
[0179] 如本文使用的術(shù)語"生物可降解"和其任何形容詞、詞形變化和偏差 (declination)，是指材料從可檢測的固體、半固體、凝膠、粘液或其他情況下局部的形式 (localized form)經(jīng)歷化學和/或物理轉(zhuǎn)化為離域化和/或檢測不到的形式諸如其任何可 溶、可洗、易揮發(fā)、可吸收和/或再吸收分解產(chǎn)物或代謝物的特性。由于化學的、生物學的和 /或物理因素，諸如，例如固有化學鍵易變性、酶分解過程、熔融、溶解及其任何組合，可生物 降解材料在生理條件下經(jīng)歷此類轉(zhuǎn)化。
[0180] 取決于生物粘附基質(zhì)的化學和物理特性和其應用的位置，以及其預期的用途，基 質(zhì)的生物降解的過程可跨越數(shù)天至數(shù)周至數(shù)月。短語"可生物降解速率"在本文中定義為在 應用生物粘附制劑與所得生物粘附基質(zhì)不再作為生物粘附基質(zhì)存在的時間之間的時間段。 "不再存在"意指可歸因于原始基質(zhì)的物質(zhì)在應用生物粘附制劑的部位處可不再以大量水 平被檢測到，或在原始部位超過正常水平仍可被檢測的其痕量在該部位不可再粘合組織或 逗留。
[0181] 通常，由本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑形成的生物粘附基質(zhì)的粘合強度，在一定程度 上，在生理條件下，將開始降解。這種強度的降解由基質(zhì)的分解引起，其由包括以下的因素 的組合實現(xiàn)：化學方法（溶脹、溶解和自發(fā)的化學降解）、生物方法（酶促驅(qū)動的反應、新的 未粘合的細胞和其他組織組分的形成以及粘合的細胞和其他組織組分的死亡）、機械方法 (應力、應變和撕裂）等。為簡單起見，降解本文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的因素和 方法的集合都包括并統(tǒng)一在短語"可生物降解速率"下。
[0182] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附制劑的預期用途是形成可保持彼此附著的 生物對象持續(xù)足夠長的時間段用于接合、融合或治愈對象的基質(zhì)。時間段取決于對象和待 進行的醫(yī)療程序。例如，制劑可被用于形成鄰接切口的兩個邊緣、足夠強壯和長以允許切口 自我修復并愈合的基質(zhì)；所述切口可在身體的內(nèi)部部位或在表面（皮膚和肌肉）上。在另 一個實例中，對象之一是一片皮膚且另一對象是無生命的醫(yī)療裝置，在該情況下，生物粘附 基質(zhì)意圖保持固定至皮膚的裝置直到其實現(xiàn)其目的或直到基質(zhì)被代替。
[0183] 生物粘附基質(zhì)的可生物降解性可由以下的因素的組合來操作：起始于組成，即聚 合物的相對濃度和交聯(lián)密度、可改變基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（更多和多樣的交聯(lián)）的添加劑、生物 降解促進劑/增強劑和生物降解抑制劑/抑制器?？杀挥糜诓倏v降解性的另一個因素是基 質(zhì)的肉眼可見形狀和結(jié)構(gòu)，即其表面面積、對周圍介質(zhì)的可及性、治療的區(qū)域的尺寸等。
[0184] 因此根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)的可生物降解速率范 圍為從約7天至約6個月。在一些情況下，可使降解性周期更短，并且范圍為從1周至1個 月，包括在其間的任何時間段，諸如從10天至3周。在其他情況下，可使降解性周期更長， 例如1-6個月，并且范圍為從1個月至2個月，從2個月至3個月或范圍為從2個月至6個 月。
[0185] 可被用于確定任何給定生物粘附基質(zhì)，包括由本文要求保護的生物粘附制劑形成 的基質(zhì)的粘合強度中涉及的時間因素的另一個參數(shù)，是粘合強度保留的一半時間，即最大 粘合強度達到其值一半的時間段，T1/2
[0186] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，T1/2范圍為從約1天至約5個月，及其間的任何值。 例如，對于短粘附周期應用，T1/2范圍為從約1周至約兩周，或從約10天至約1個月。對 于更長的粘附周期，T1/2范圍為從約1個月至約2個月、或從約2個月至約3個月、或從約 3個月至約4個月、或從約3個月至約5個月。
[0187] 在本文中應注意，雖然討論了最小粘合時間和最佳的可生物降解速率，但本文呈 現(xiàn)的生物粘附基質(zhì)可在其被生物降解之前除去，并且可通過機械和化學手段有意地縮短其 粘合時間。
[0188] 基本成分的濃度：
[0189] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，生物粘附制劑和由其形成的基質(zhì)的以上描述的特性的至少一些 可通過應被優(yōu)化的生物粘附制劑的每種成分的相對濃度來操縱。
[0190] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，如本文描述的生物粘附制劑包括明膠、藻酸鹽和偶 聯(lián)劑，如本文描述的，每種以將賦予制劑本文描述的特性的濃度，和/或以將賦予制劑本文 描述的特性的相對含量比率，如下文呈現(xiàn)的。
[0191] 在本文中應注意，對于是有用的和有效的生物粘附制劑，選擇其聚合物的濃度以 得到可工作的稠度（主要在粘度方面）。因此，可工作制劑的聚合物的濃度，并且特別是明 膠的濃度的范圍的高限，不可超過一定的值。超過這些最大范圍值的一個或更多個可導致 不能實施的制劑。
[0192] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在制劑中明膠的濃度為500mg/ml或更低。
[0193] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在制劑中的明膠濃度范圍為從50mg/ml至500mg/ ml。在一些實施方案中，生物粘附制劑中的明膠含量范圍為從100mg/ml至500mg/ml、從 100mg/ml 至 400mg/ml、從 100mg/ml 至 300mg/ml、從 100mg/ml 至 200mg/ml、或從 50mg/ml 至 400mg/ml、從 50mg/ml 至 300mg/ml、從 50mg/ml 至 200mg/ml 或從 50mg/ml 至 100mg/ml， 包括在以上指示的值之間的任何值。
[0194] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在制劑中藻酸鹽的濃度范圍為從5mg/ml至100mg/ ml。在一些實施方案中，生物粘附制劑中的藻酸鹽含量范圍為從10mg/ml至100mg/ml、從 10mg/ml 至 90mg/ml、從 10mg/ml 至 80mg/ml、從 10mg/ml 至 70mg/ml、從 10mg/ml 至 60mg/ ml、從 10mg/ml 至 50mg/ml、從 10mg/ml 至 40mg/ml、或從 5mg/ml 至 90mg/ml、從 5mg/ml 至 80mg/ml、從 5mg/ml 至 70mg/ml、從 5mg/ml 至 60mg/ml、從 5mg/ml 至 50mg/ml、從 5mg/ml 至 40mg/ml、從 5mg/ml 至 30mg/ml、從 5mg/ml 至 20mg/ml、或從 5mg/ml 至 10mg/ml，包括在以上 指示的值之間的任何值。
[0195] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在制劑中偶聯(lián)劑的濃度范圍為從lmg/ml至50mg/ ml、從 lmg/ml 至40mg/ml、從 lmg/ml 至 30mg/ml、從 lmg/ml 至 20mg/ml、或從 lmg/ml 至 10mg/ ml，包括在以上指示的值之間的任何值。
[0196] 如上文討論的，由于已知某些偶聯(lián)劑為細胞毒性的或為產(chǎn)生細胞毒性的部分，期 望在生物粘附制劑內(nèi)使用相對低量的偶聯(lián)劑。另一方面，減少偶聯(lián)劑在制劑中的量可導致 減少由制劑形成的生物粘附基質(zhì)的粘合強度。本發(fā)明人已證明了包含20-40mg/ml或甚至 更低量的偶聯(lián)劑的制劑可被用于提供生物粘附基質(zhì)，其中粘合強度基本不受影響。
[0197] 一些示例性生物粘附制劑如下所示，每一種包含指定濃度下的明膠、藻酸鹽和偶 聯(lián)劑，表示為制劑的總體積的重量/體積的百分比：
[0198] 示例性制劑I :100mg/ml明膠、20mg/ml藻酸鹽和作為碳化二亞胺類偶聯(lián)劑的4mg/ ml EDC ；
[0199] 示例性制劑 II :100mg/ml 明膠、40mg/ml 藻酸鹽和 4mg/ml EDC ;
[0200] 示例性制劑 III :100mg/ml 明膠、60mg/ml 藻酸鹽和 4mg/ml EDC ;
[0201] 示例性制劑 IV :100mg/ml 明膠、40mg/ml 藻酸鹽和 10mg/ml EDC ;
[0202] 示例性制劑 V :150mg/ml 明膠、40mg/ml 藻酸鹽和 10mg/ml EDC ;
[0203] 示例性制劑 VI :200mg/ml 明膠、40mg/ml 藻酸鹽和 10mg/ml EDC ;
[0204] 示例性制劑 VII :200mg/ml 明膠、40mg/ml 藻酸鹽和 5mg/ml EDC ;
[0205] 示例性制劑 VIII :200mg/ml 明膠、70mg/ml 藻酸鹽和 35mg/ml EDC ;
[0206] 示例性制劑IX :250mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽和25mg/ml EDC ;或
[0207] 示例性制劑X :200mg/ml明膠、40mg/ml藻酸鹽和20mg/ml EDC ;或
[0208] 示例性制劑 XI :500mg/ml 明膠、10mg/ml 藻酸鹽和 25mg/ml EDC。
[0209] 在本文中應注意，在本發(fā)明的一些實施方案中，偶聯(lián)劑的濃度可由添加劑的存在 而降低，并不會影響該制劑的性能。
[0210] 例如，生物粘附制劑包括表示為制劑的總體積的重量/體積的以下量的明膠、藻 酸鹽、偶聯(lián)劑和交聯(lián)促進劑：
[0211] 示例性制劑 XII :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC 和 2mg/ml NHS-酯-類偶聯(lián)劑（相對于EDC濃度的20% );
[0212] 示例性制劑 XIII :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC 和 4mg/ml NHS-酯（相對于EDC濃度的40% );
[0213] 示例性制劑 XIV :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、15mg/ml EDC 和 1. 5mg/ml NHS-酯（相對于EDC濃度的10% );
[0214] 示例性制劑 XV :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、15mg/ml EDC 和 3mg/ml NHS-酯 (相對于EDC濃度的20% );
[0215] 示例性制劑 XVI :250mg/ml 明膠；30mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC 和 4mg/ml NHS-酯 (相對于EDC濃度的20% );
[0216] 示例性制劑 XVII :500mg/ml 明膠；10mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC 和 4mg/ml NHS-酯（相對于EDC濃度的20% );或
[0217] 示例性制劑 XVIII :300mg/ml 明膠；30mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC 和 lmg/ml NHS-酯（相對于EDC濃度的10% )。
[0218] 在本文中應注意，在本發(fā)明的一些實施方案中，制劑可包括填料，而不影響制劑的 性能并且甚至改進制劑的性能，且使得制劑更適合用于更寬范圍的應用，諸如硬組織粘附 (骨粘附等）。
[0219] 例如，生物粘附制劑包含以下量的明膠、藻酸鹽、偶聯(lián)劑、任選的交聯(lián)促進劑以及 填料：
[0220] 示例性制劑 XIX :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC 和 0. 25% w/v 羥 基磷灰石；
[0221] 示例性制劑 XX :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC 和 0· 5 % w/ v β -TCP ；
[0222] 示例性制劑 XXI :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC 和 0· 5% w/v 輕基 磷灰石；
[0223] 示例性制劑 XXII :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC 和 0· 125 % w/ v β -TCP ；
[0224] 示例性制劑XXIII :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC、2mg/ml NHS-酯 (相對于EDC濃度的10% )和0· 25% w/v羥基磷灰石；
[0225] 示例性制劑 XXIV :200mg/ml 明膠；40mg/ml 藻酸鹽、20mg/ml EDC、4mg/ml NHS-酯 (相對于EDC濃度的20% )和0· 5% w/v β -TCP ;
[0226] 示例性制劑 XXV:300mg/ml 明膠；30mg/ml 藻酸鹽、10mg/ml EDC、lmg/ml NHS-酯 (相對于EDC濃度的10% )和0· 5% w/v羥基磷灰石；或
[0227] 示例性制劑 XXVI :300mg/ml 明膠；30mg/ml 藻酸鹽、lOmg/ml EDC、lmg/ml NHS-酯 (相對于 EDC 濃度的 10% )和 0· 125% w/v^-TCP。
[0228] 因此，在一些實施方案中，如本文描述的生物粘附制劑包括藻酸鹽、明膠、水、和偶 聯(lián)劑，如本文描述的，并且還包括交聯(lián)促進劑和/或填料，如本文描述的，其中偶聯(lián)劑的濃 度為20mg/ml或更低（例如，15mg/ml、或10mg/ml、或更低）。
[0229] 任何前述提到的示例性制劑可還包括本文描述的一種或更多種生物活性劑。
[0230] 在本文中應注意，涵蓋了組分濃度的其他組合，其中的一些已在以下的實施例部 分被證實。
[0231] 藥物洗脫生物粘附制劑：
[0232] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，如本文描述的生物粘附制劑還包括一種或更多種生 物活性劑。在一些實施方案中，此類制劑設計為在固化后得到藥物洗脫生物粘附基質(zhì)。換 言之，固化包含生物活性劑的生物粘附制劑以形成其中摻有生物活性劑的藥物洗脫生物粘 附基質(zhì)。在一些實施方案中，形成此類藥物洗脫生物粘附基質(zhì)，使得生物活性劑在基質(zhì)與生 理媒介物接觸后從基質(zhì)上釋放。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附制劑可被用于 各種生物粘附應用，如本文所討論的，而同時用作用于遞送生物活性劑的儲庫和運載物。
[0233] 在本文中應注意，雖然生物活性劑在制劑中的摻入可影響制劑的特性和所得的生 物粘附基質(zhì)的特性，但該生物粘附制劑及其相應基質(zhì)被設計為具有上文提到的期望的性 質(zhì)，同時增加洗脫生物活性劑的能力，如下文討論的。
[0234] 在本文中還應注意，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，不包含生物活性劑的生物粘附 制劑及相應基質(zhì)意圖主要使用其生物粘附性質(zhì)。在此類實施方案中，除了釋放生物活性劑 的量和速率外，本文描述的有效的生物粘附制劑/基質(zhì)的所有其他特性和特質(zhì)，以及主要 成分的最佳相對含量，適用于其中不包含生物活性劑的制劑。
[0235] 如在根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的生物活性劑和生物粘附制劑/基質(zhì)的上 下文中使用的，術(shù)語"摻入的（incorporated) "與以下術(shù)語同義使用：諸如"封存的 (sequestered) "、"負載的（loaded) "、"包封的（encapsulated) "、"締合的（associated with) "、"填充的（charged) "以及這些術(shù)語的任何詞形變化，它們?nèi)靠苫Q使用以描述如 下文所定義的生物活性劑在制劑/基質(zhì)中的存在。封存的生物活性劑可經(jīng)由例如擴散、溶 解、洗脫、提取、浸出從基質(zhì)上洗脫或釋放，作為影響基質(zhì)的潤濕、溶脹、溶解、化學分解、降 解、生物降解、酶分解及其他過程的任何或組合的結(jié)果。還可從基質(zhì)上洗脫生物活性劑，而 對基質(zhì)的結(jié)構(gòu)沒有任何顯著變化、或有部分變化。
[0236] 如本文使用的，短語"生物活性劑"描述了發(fā)揮一種或更多種生物學和/或藥學活 性的分子、化合物、復合物、加合物和/或組合物。因此生物活性劑可被用于，例如，緩解疼 痛、預防炎癥、預防和/或減少和/或消除感染，促進傷口愈合、促進組織再生、實現(xiàn)腫瘤/ 轉(zhuǎn)移消除/抑制、實現(xiàn)局部免疫系統(tǒng)抑制，和/或預防、減輕或治療各種醫(yī)學狀況。
[0237] "生物活性劑"、"藥物活性劑"、"藥物活性材料"、"醫(yī)藥"、"治療活性劑"、"生物學活 性劑"、"治療劑"、"藥"、"藥劑"、"藥物"和其他相關(guān)的術(shù)語可在本文互換使用，并且它們?nèi)?部意圖被術(shù)語"生物活性劑"所涵蓋。
[0238] 術(shù)語"生物活性劑"在本發(fā)明的上下文中還包括診斷劑，包括，例如，用于標記、追 蹤、成像和鑒定各種生物學元件諸如小分子以及大分子、細胞、組織和器官的顯色劑、熒光 齊IJ、發(fā)光劑、磷光劑；以及放射性材料，其可用于放療和追蹤兩者，用于破壞有害組織諸如局 部區(qū)域中的腫瘤/轉(zhuǎn)移瘤，或抑制健康組織的生長，諸如在目前的支架應用中；或作為用于 核醫(yī)學和放射成像中使用的生物標志物。
[0239] 根據(jù)本發(fā)明，可單獨或組合使用生物活性劑，即在一種生物粘附制劑中可一起使 用多于一種類型的生物活性劑，并且因此從生物粘附基質(zhì)上同時釋放。
[0240] 在一些實施方案中，在制劑中生物活性劑的濃度范圍為從所述制劑的總體積的 0. 1 %重量/體積至10%重量/體積，并且在一些實施方案中甚至更多。取決于使用的生物 活性劑的性質(zhì)和生物粘附制劑/基質(zhì)的預期用途，還預期更高及更低值的生物活性劑的含 量。
[0241] 當在釋放或洗脫生物活性劑的上下文中使用術(shù)語"生物活性劑"時，意指生物活性 劑在其釋放后是基本上有效的。
[0242] 如下文所討論的，生物活性劑可憑借其自身與一種或更多種基質(zhì)形成組分和/或 偶聯(lián)劑的反應性，或憑借其本身化學和/或物理性質(zhì)，對偶聯(lián)的明膠-藻酸鹽基質(zhì)化學和/ 或機械性質(zhì)有影響。因此，應注意，通常，生物活性劑被選擇為適合于摻入提供偶聯(lián)的明膠 明膠-藻酸鹽生物粘附基質(zhì)的生物粘附制劑，以使得生物活性劑可以以預期的有效量和釋 放率從生物粘附基質(zhì)上洗脫，同時允許預固化生物粘附制劑展示預期的特性，如本文所討 論的，并且同時允許制劑提供展示預期的特性的生物粘附基質(zhì)，如本文所討論的。
[0243] 如以下實施例部分所討論并示例的，一些生物活性劑可展示一個或更多個官能基 團，其可易受在聚合物和偶聯(lián)劑之間發(fā)生的偶聯(lián)過程的影響，并且因此可影響所得基質(zhì)的 特性。例如，展現(xiàn)羧基基團或伯胺基團的生物活性劑可與由于其針對此類官能基團的反應 性而被選擇的偶聯(lián)劑發(fā)生反應。在此類情況下，為了維持所得基質(zhì)的期望的特性，可在成分 的類型及其濃度方面將一些調(diào)整引入生物粘附制劑。
[0244] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物活性劑可以是，例如，生物大分子或小有機分 子。
[0245] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物活性劑是非蛋白物質(zhì)（non-proteinous substance)，即在其結(jié)構(gòu)中具有不超過四個氨基酸殘基的物質(zhì)。
[0246] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物活性劑是非碳水化合物物質(zhì) (non-carbohydrate substance),即在其結(jié)構(gòu)中具有不超過四個糖（含氨基糖苷類）部分 的物質(zhì)。
[0247] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物活性劑基本上沒有以下官能基團的一種或更多 種：竣基、伯胺、輕基、疏基和醒。
[0248] 如本文使用的術(shù)語"生物大分子"，是指天然存在于活的生物體中的聚合生化物 質(zhì)，或生物聚合物。氨基酸和核酸是聚合生物大分子的一些最重要組成部分，因此生物大分 子典型地包括聚合的氨基酸、聚合的核酸、聚合的糖、聚合的脂質(zhì)及其組合的一個或更多個 鏈。大分子可包括可共價地或非共價地彼此附著的幾個大分子亞基的復合物。因此，核糖 體、細胞器以及甚至完整的病毒可被視為生物大分子。
[0249] 如本文使用的生物大分子，具有比1000道爾頓（Da)更高，并且可比3000Da更高， 比5000Da更高，比10kDa更高以及比50kDa更高的分子量。
[0250] 可有益地摻入本文描述的生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的生物大分子的代表性實例， 包括，但不限于，肽、多肽、蛋白、酶、抗體、寡核苷酸和標記的寡核苷酸、核酸構(gòu)建體、DNA、 RNA、反義、多糖、病毒及其任何組合，以及細胞，包括完整的細胞或其他亞細胞組分和細胞 碎片。
[0251] 如本文中使用的，短語"有機小分子"或"有機小化合物"是指主要由碳和氫，連同 以較低存在比率的氮、氧、磷和硫以及其他元素一起組成的小化合物。在本發(fā)明的上下文 中，關(guān)于化合物、試劑或分子的術(shù)語"小"，是指比約1000克/摩爾更低的分子量。因此，有 機小分子具有比l〇〇〇Da更低、比500Da更低、比300Da更低、或比lOODa更低的分子量。
[0252] 可有益地摻入本文描述的生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的有機小分子的代表性實例， 包括，但不限于，血管發(fā)生促進劑、細胞因子、趨化因子、化學引誘劑、化學驅(qū)避劑、藥物、激 動劑、氨基酸、拮抗劑、抗組胺劑、抗生素、抗原、抗抑郁藥、抗高血壓劑、止痛劑和麻醉劑、抗 炎劑、抗氧化劑、抗增殖劑、免疫抑制劑、凝血因子、骨整合劑、抗病毒劑、化療劑、輔因子、月旨 肪酸、生長因子、半抗原、激素、抑制劑、配體、糖類、放射性同位素、放射性藥物、類固醇、毒 素、維生素、礦物質(zhì)和其任何組合。
[0253] 適合于在本實施方案的上下文中使用的生物活性劑的代表性實例包括，但不限 于，鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、抗生素、抗腫瘤和化療劑、激動劑和拮抗劑藥、氨基酸、血管發(fā)生促進 齊U、減食欲藥物、抗過敏藥、抗關(guān)節(jié)炎藥、抗哮喘藥、抗體、抗膽堿能藥、抗驚厥藥、抗抑郁藥、 抗糖尿病藥、止瀉藥、抗真菌劑、抗原、抗組胺劑、抗高血壓劑、抗炎劑、抗偏頭痛藥、止惡心 藥、抗腫瘤藥、抗氧化劑、抗震顫麻搏藥、抗增殖劑、抗原蟲藥（antiprotozoans)、止癢劑、 抗精神病藥、退熱藥、反義核酸構(gòu)建體、解痙藥、抗病毒劑、膽汁酸、鈣通道阻斷劑、心血管制 劑、細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮齊?、化學引誘齊?、趨化因子、化學驅(qū)避齊?、化療齊?、膽固醇、輔因 子、避孕藥、細胞因子、減充血劑、利尿藥、DNA、藥物和治療劑、酶抑制劑、酶、脂肪酸、糖脂 類、生長因子、生長激素、止血和抗出血齊?、半抗原、激素抑制齊?、激素、安眠藥、免疫活性劑、 免疫抑制劑、抑制劑和配體、標記的寡核苷酸、殺微生物劑、肌肉松弛劑、核酸構(gòu)建體、寡核 苷酸、抗副交感神經(jīng)藥（parasympatholytics)、肽、外周和腦血管擴張劑、磷脂、多糖、蛋白 質(zhì)、精神興奮劑、放射性同位素、放射性藥物、受體激動劑、RNA、糖、皂苷、鎮(zhèn)靜劑、有機小分 子、殺精子劑、類固醇、擬交感神經(jīng)藥、毒素、安定藥、疫苗、血管擴張劑、病毒組分、病毒載 體、病毒、維生素、以及其任何組合。
[0254] 生物活性劑可被選擇以達到局部或全身應答。生物活性劑可以是適合于以下各種 的任何預防劑或治療劑：局部、腸內(nèi)和腸外類型的施用途徑，包括，但不限于皮下或經(jīng)皮、真 皮內(nèi)經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、肌肉內(nèi)施用和粘膜施用。
[0255] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可被包封在生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的一類生 物活性劑，是減輕疼痛的鎮(zhèn)痛劑類，例如NSAID、C0X-2抑制劑、阿片制劑和擬嗎啡樣物 (morphinomimetics)〇
[0256] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可被摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的另一類生物活 性劑，是麻醉劑類。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可被摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的另一 類生物活性劑，是促進血管發(fā)生的治療劑類。非限制性實例包括生長因子、細胞因子、趨化 因子、類固醇細胞存活和增殖劑。
[0257] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，特別是在期望組織再生、和涉及植入裝置和組織愈 合的應用的某些實施方案中，可被摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)中的另一類生物活性劑，是 細胞因子、趨化因子和相關(guān)的因子。
[0258] 免疫抑制藥物或試劑，通常在本文中稱為免疫抑制劑的非限制性實例，包括糖皮 質(zhì)激素、細胞抑制劑、抗體、作用于親免素（immunophilin)的藥物和其他免疫抑制劑。
[0259] 止血劑的非限制性實例包括高嶺土、蒙脫石和氨甲環(huán)酸。
[0260] 在本文中應注意，高嶺土是具有在生物粘附制劑中的有限溶解度的示例性生物活 性劑，并因此以干粉的形式加入，且因此，至少在一定程度上，充當生物粘附制劑中的填料。 這種生物活性劑和填料的雙重功能，可表征由本發(fā)明的實施方案包括并隨后預期的任何添 加劑或生物活性劑。
[0261] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括細胞毒性因子或細胞周期抑制因子以及有助于干擾細胞增殖的其他試劑。
[0262] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括遺傳治療劑和蛋白，諸如核酶、反義多核苷酸和編碼特定產(chǎn)物的多核苷酸（包 括重組核酸），諸如基因組DNA、cDNA或RNA。多核苷酸可以以"裸的"形式或以與增強多核苷 酸吸收和表達的載體系統(tǒng)關(guān)聯(lián)地來提供。這些可包括DNA密實劑（DNA compacting agent) (諸如組蛋白），非感染性載體（諸如質(zhì)粒、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)）和 病毒載體諸如病毒和病毒樣顆粒（即，制成作用如病毒的合成顆粒）。載體還可具有附著的 肽靶向序列、反義核酸（DNA和RNA)、和包括編碼ferry蛋白諸如膜轉(zhuǎn)位序列（"MTS"）的 基因序列的DNA嵌合體、代替有缺陷的或不足的內(nèi)源性分子的tRNA或rRNA以及單純皰疹 病毒-1( "VP22"）。
[0263] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括可被內(nèi)源性或外源性控制的基因遞送試劑。
[0264] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括作為二聚體、同型二聚體、異二聚體，或其組合，單獨或連同其他分子的骨形態(tài) 發(fā)生蛋白（"BMP"）家族?？蛇x地或另外，可提供能夠誘導BMP的上游或下游效應的分子。 此類分子包括任何"刺猬（hedgehog) "蛋白或編碼其的DNA。
[0265] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括化學治療劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基 質(zhì)的另外的生物活性劑，包括抗生素試劑。
[0266] 抗病毒劑可包括核苷膦酸鹽/酯和其他核苷類似物、AICAR(5-氨基-4-咪唑羧酰 胺核糖核苷酸）類似物、糖酵解途徑抑制劑、甘油酯、陰離子聚合物等。
[0267] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括抗病毒和非病毒載體。
[0268] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括留體類抗炎藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫 基質(zhì)的另外的生物活性劑，包括抗氧化劑。
[0269] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括維生素。
[0270] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括激素。
[0271] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，可有益地摻入生物粘附藥物洗脫基質(zhì)的另外的生物 活性劑，包括人源（自體或異體）的細胞，包括干細胞，或來自動物來源（異種），如果需要 可將其進行基因工程改造以遞送感興趣的蛋白。
[0272] 藥物釋放曲線：
[0273] 自用作其儲庫的基質(zhì)的生物活性劑的釋放速率，或藥物釋放曲線，可通過各種因 素，諸如成分在本文描述的生物粘附制劑中的相對濃度來控制。
[0274] 在本實施方案的上下文中相關(guān)的典型的藥物遞送機制由包含預定的和可耗盡的 量的藥物的儲庫和在藥物的儲庫和生理環(huán)境之間的界面組成。通常，當儲庫暴露于生理環(huán) 境時藥物釋放在初始時間點開始，并遵循典型擴散控制的動力學，另外的影響由基質(zhì)的水 吸收（溶脹）、崩解和生物降解等實現(xiàn)。
[0275] 應注意，與在提供其他藥物洗脫基質(zhì)的制劑中使用的合成聚合物，諸如聚乳酸 (PLA)和聚乙醇酸（PGA)相比，既不是天然聚合物，也不是偶聯(lián)產(chǎn)物酰胺鍵的明膠-藻酸鹽 偶聯(lián)的基質(zhì)不是水可降解的。在活的受試者身體中，該基質(zhì)將通過還將影響藥物釋放速率 的酶活性降解。
[0276] "藥物釋放曲線"是描述當在感興趣的特定身體部位測量時作為時間函數(shù)的藥物 (生物活性劑）的瞬時濃度的一般表示，而濃度對時間的斜率表示在任何給定時間點的釋 放速率?？蓪⑺幬镝尫徘€劃分為取決速率的周期，由此該速率線性或以指數(shù)方式上升或 下降，或保持基本恒定。一些典型的探索速率包括突釋速率和持續(xù)釋放速率。
[0277] 如本文使用的，短語"突釋（burst release) "，是與藥物進入感興趣的身體部位的 快速釋放一致，并且通常與藥物的濃度呈指數(shù)增長相關(guān)，以相對短的時間從零增長至高水 平。通常，藥物釋放曲線的突釋部分簡短地結(jié)束，并且然后逐漸改變?yōu)獒尫徘€中的穩(wěn)定水 平、或緩釋部分。
[0278] 如本文使用的，短語"持續(xù)釋放（sustained release) "，是指突釋部分之后的藥物 釋放曲線的部分，并且通常特征為恒定速率和相對長的持續(xù)時間。
[0279] 因此在釋放曲線的突發(fā)部分和持續(xù)部分之間的主要差異為速率（斜率特性）和持 續(xù)時間，對于突釋為指數(shù)性和短的，以及對于持續(xù)釋放為線性和長的；并且二者在藥物施用 方案中起到顯著作用。在大多數(shù)情況下，突釋部分和持續(xù)釋放部分兩者的存在是不可避免 的，并且源于藥物遞送機制的化學和熱力學性質(zhì)。
[0280] 在本發(fā)明的實施方案的上下文中，短語"高突釋"是藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的以下 屬性，如本文所述，該屬性是指在基質(zhì)暴露于其作用的環(huán)境（例如生理環(huán)境）的初始階段期 間從基質(zhì)上釋放的藥物的量，其中，所述量超過基質(zhì)中包含的總量的20%，并且初始階段被 認為是從暴露起的最初六個小時。
[0281] 在本發(fā)明的一些實施方案中，"高突釋"描述了藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的以下屬 性，如本文所述，其中30%、40%、50%、60%以及甚至更高百分比的生物活性劑（藥物）在 基質(zhì)暴露于生理介質(zhì)的最初6小時期間被釋放。預期了在生物活性劑（藥物）的20%和 100 %之間的任何值。
[0282] 因此，短語"低突釋"是指其中小于20%的包含的藥物在暴露的最初六小時內(nèi)被釋 放的藥物洗脫生物粘附基質(zhì)。
[0283] 在本發(fā)明的一些實施方案中，"低突釋"描述了藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的以下屬 性，如本文所述，其中以及甚至更低百分比的生物活性劑（藥物）在基質(zhì)暴 露于生理介質(zhì)的最初6小時期間被釋放。預期了在生物活性劑（藥物）的20%和1%之間 的任何值。
[0284] 通常，并且根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，至少20%的生物活性劑在制劑/基質(zhì)與 生理介質(zhì)接觸的6小時內(nèi)被釋放至周圍的生理介質(zhì)中。根據(jù)本發(fā)明的一些其他實施方案， 至多20%的生物活性劑在制劑/基質(zhì)與生理介質(zhì)接觸的6小時內(nèi)被釋放至周圍的生理介質(zhì) 中。
[0285] 生物粘附制劑的制備和基質(zhì)形成：
[0286] 本文呈現(xiàn)的包含或不包含生物活性劑的生物粘附制劑，通過將所有組分一起混合 為單一調(diào)合物來制備，至少從制劑的意義上說，其能夠固化?？呻x體、在體外或原位形成單 一調(diào)合物，即制劑可以以兩種或更多種子制劑的形式被單獨保存，或作為一套干粉和預測 量的量的溶劑（水）單獨保存，如下文所討論，其通過以下方式中的一種來組合形成單一調(diào) 合物。
[0287] 體外意指作為單一調(diào)合物的制劑在將制劑應用在待粘合的對象之前，通過將制劑 的所有組分混合（例如，在小瓶中）來形成，如這些在本文中被定義、描述和示例的。
[0288] 原位意指作為單一調(diào)合物的制劑通過將一種子制劑應用在一個對象上，并且將另 一種子制劑應用在另一個對象上，且在粘附的部位處將對象鄰接在一起以形成單一調(diào)合 物；或通過將一種子制劑應用在對象上并此后將另一種制劑應用在同一對象上來形成。
[0289] 當應用至活的對象時，體外相應于離體，且原位相應于體內(nèi)。
[0290] 在任何可能的情況下，制劑在基本上不能固化的條件下來保存。
[0291] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了形成生物粘附基質(zhì)的方法，其通 過固化如本文描述的生物粘附制劑實現(xiàn)。
[0292] 如本文使用的術(shù)語"固化"包括主動過程諸如使制劑經(jīng)歷一定條件（例如，加熱和 /或混合，剪切力，等），以及包括允許經(jīng)過固化時間的被動過程。
[0293] 在一些實施方案中，方法還包括，在固化之前，混合制劑的組分，S卩，混合本文所述 子制劑或用適當?shù)娜軇┗旌媳疚乃龅姆勰?br> [0294] 如上文討論的，可離體、在體內(nèi)、體外或原位實現(xiàn)混合。
[0295] 生物粘附制劑和基質(zhì)的用途：
[0296] 如本文討論的，本文呈現(xiàn)的包含或不包含生物活性劑的生物粘附制劑，被用于形 成為藥物洗脫或非藥物洗脫基質(zhì)的生物粘附基質(zhì)，其在許多醫(yī)療和輔助醫(yī)療應用中是有用 的。如以上討論的，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，生物粘附基質(zhì)，例如，在代替或增強外科縫 合線和縫合釘中是有用的。
[0297] 因此，根據(jù)一些實施方案，本文呈現(xiàn)的摻入生物活性劑或不摻入生物活性劑的制 齊U，被標識為用于將對象彼此粘合，其中這些對象中的至少一個是生物對象，如這些術(shù)語在 本文中被定義和討論的。
[0298] 通常，本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑可被用于制造用來粘合對象的產(chǎn)品，所述對象的 至少一個是生物對象。
[0299] 因此，如本文使用的短語"生物對象"，是指動物或植物的任何有生命力的/活的 部分，包括單個活的動物樣本。活的或有生命力的生物對象或組織被定義為植物或動物的 仍保持有生命力或存活并被基本上保持在生理環(huán)境中以保持有生命力或存活的任何主要 或次要部分。生物對象的非限制性實例包括任何植物或動物、活組織樣品、皮膚組織、骨組 織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織和上皮組織。還包括了在器官中做出的切口的邊緣，所述 器官諸如生物體的任何身體部位中的皮膚、肌肉、內(nèi)臟器官。
[0300] 無生命的對象是不可復活的、移植的、增殖或以其他方式顯示如醫(yī)學上定義的生 命的任何跡象的對象，并且包括合成的和/或生物來源的對象。這些包括，例如，貼片、骨替 換部件、起搏器、接口和通風孔，以及需要粘貼并固定至如本文定義的有生命力的生物對象 的任何其他醫(yī)療設備。
[0301] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，無生命的生物對象可部分地或完全地由動物或植物 材料和產(chǎn)物制成，或部分地或全部地由合成物質(zhì)來制成。當設計生物粘附制劑用于在有生 命力的生物對象中或上使用時，在本文中應注意，其可如同任何粘合劑或粘合膠被有效地 用于粘合生物的或合成的無生命的對象。
[0302] 在本文中應注意，術(shù)語"對象"意在包括相同對象的一個或更多個部件或部分，從 而通過使用本文描述的制劑通過粘合組織或器官中的切口的兩側(cè)閉合切口，可被認為粘合 一個對象（組織或器官）或兩個對象（切口的兩側(cè)）。
[0303] 根據(jù)一些實施方案，從摻入生物活性劑的生物粘附制劑獲得的藥物洗脫基質(zhì)，僅 被用于其藥物洗脫和藥物遞送的能力而不論其生物粘附能力。此類基質(zhì)可用作，例如，藥 物貯存庫，并且可粘附至器官或組織，其中藥物的釋放是有利的（不在其上粘合另一個對 象）。
[0304] 形成生物粘附基質(zhì)和粘合對象的方法：
[0305] 根據(jù)本發(fā)明的實施方案的一個方面，提供使用本文描述的生物粘附制劑形成本文 描述的生物粘附基質(zhì)的方法，該方法通過固化所述制劑來實現(xiàn)。
[0306] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，由固化生物粘附制劑形成的包含生物活性劑或不包 含生物活性劑的生物粘附基質(zhì)，在對象上和/或在兩個或更多個對象之間形成，其中所述 對象中的至少一個是如本文描述的生物對象。
[0307] 本文描述的生物粘附基質(zhì)在對象上的形成通過將本文描述的生物粘附制劑應用 在所述對象上并固化該制劑來實現(xiàn)。基質(zhì)在兩個或更多個對象之間的形成通過將制劑應用 在對象中一個或更多上，例如，在其意圖粘合的表面的部分上，并且此后鄰接對象來實現(xiàn)。 鄰接對象意指使每個對象的表面的至少部分接觸。
[0308] 在本發(fā)明的一些實施方案中，粘合對象還伴隨使用力和/或緊固對象的其他工 具，并保持對象至少彼此鄰接（阻止粘合的表面分離），直到制劑固化至對象被粘合并可放 開的程度。
[0309] 因此，提供了至少將兩個對象彼此粘合的方法，其通過以下來實現(xiàn)：
[0310] 將本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑應用于對象的至少一個上；以及
[0311] 鄰接所述對象（以在其間形成接觸），任選地同時將所述對象彼此緊固。
[0312] 應注意，實現(xiàn)鄰接的作用以在對象之間形成接觸，同時使用緊固以允許制劑固化 并在對象之間形成基質(zhì)，由此將對象彼此粘合。
[0313] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑和基質(zhì)可被用于在損傷或 手術(shù)后以及在許多外科手術(shù)中保持身體組織在一起，所述外科手術(shù)包括但不限于切口閉 合、角膜穿孔、外陰切開術(shù)、剖腹產(chǎn)情況、唇裂、皮膚和骨移植術(shù)、肌腱修復、疝氣、甲狀腺手 術(shù)、牙周手術(shù)、牙齦切除術(shù)、牙植入、口腔潰瘍、胃靜脈曲張、內(nèi)臟器官諸如肝和胰的傷口、夕卜 部和內(nèi)部醫(yī)療器械的附著和固定，等。
[0314] 用于存儲、制備和應用生物粘附制劑的裝置（means):
[0315] 如本文中所呈現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的生物粘附制劑由兩種或更多種主 要聚合物組分和偶聯(lián)劑組成，所述偶聯(lián)劑在主要聚合物組分之間形成交聯(lián)鍵。由于偶聯(lián)/ 交聯(lián)反應在使聚合物組分與偶聯(lián)劑接觸后發(fā)生，這兩組的組分，即聚合物和偶聯(lián)劑，應分開 保存直到有必要應用該制劑。因此，應注意，該制劑可以以任何數(shù)目的分開的部分來保存， 至少直到在其應用和使用前將其混合為包含所有的單一調(diào)合物。
[0316] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本文呈現(xiàn)的預固化的生物粘附制劑通過使主 要包含明膠、藻酸鹽和任選的生物活性劑的子制劑A與主要包含一種或更多種偶聯(lián)劑的子 制劑B接觸來形成。
[0317] 可選地，預固化的生物粘附制劑可無限期地作為其每個成分的預測量的量的粉末 的干燥混合物保存，所述組分，包括聚合物、偶聯(lián)劑，各種添加劑和生物活性劑，允許每個可 通過在水中溶解來重構(gòu)。可選地，僅一些成分作為粉末的干燥混合物保存，而其他成分作為 單獨溶液或粉末保存。應注意，設想生物粘附制劑的長期存儲的任何形式，只要阻止偶聯(lián)/ 交聯(lián)反應不受控制地開始。
[0318] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，子制劑A和子制劑B分別保存于密封隔室 中，每個隔室可用作存儲容器，或作為適合于應用本文中呈現(xiàn)的生物粘附制劑的集成敷貼 器（integrated applicator)的儲庫（例如，被配置用于應用糊劑和稠的液體）。
[0319] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了用于儲存、制備和/或應 用本文中呈現(xiàn)的預固化的生物粘附制劑的試劑盒，其包括至少兩個室，諸如第一隔室和第 二隔室，其中第一隔室容納子制劑A，如上文呈現(xiàn)的，且第二隔室容納子制劑B。只要這兩個 隔室都保持密封并在可接受的貯存條件下，生物粘附制劑將不會固化或崩解。
[0320] 在一些實施方案中，試劑盒包括至少兩個隔室，每個包含相應于該特定子制劑的 成分，其以特定濃度已預先溶解于溶劑中使得混合兩個子制劑導致如本文描述的生物粘附 制劑。
[0321] 可選地，試劑盒包括一個或更多個隔室，每個包含預測量的量的生物粘附制劑的 一種或更多種組分的干粉，和包含預測量的量的溶劑的單獨隔室，使得混合粉末和溶劑導 致了如本文描述的生物粘附制劑。
[0322] 試劑盒還可包括混合和攪拌工具、碗、敷貼器、新鮮度指示器，防篡改措施和用于 用戶的說明書印刷品。
[0323] 試劑盒可包括用于可控地并任選地同步排出每個子制劑的測量的量的裝置、敷貼 器或分配器，所述子制劑的每個從用作單獨的子制劑的盒的單獨的隔室分配。
[0324] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，提供了用于在應用本文呈現(xiàn)的 生物粘附制劑中使用的集成雙室分配器，其包括裝配了具有聯(lián)合遞送口的雙桶盒組件，其 中具有用于與混合管結(jié)合的底座。適合于應用本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑的集成敷貼器，可 遵循用于兩部分化學粘合劑的任何敷貼器的設計，所述化學粘合劑需要在控制并安全的條 件下由單獨隔室有效地分配兩種子制劑。
[0325] 可被用于混合、分配和應用本文呈現(xiàn)的生物粘附制劑的示例性兩部分化學粘合劑 敷貼器，被公開于例如美國專利申請?zhí)?007/0289996和2011/0248045中，以及美國專利號 4, 979, M2、5, 〇82, 147、6, 732, 887、7, 53〇, 8〇8、7, 635,糾3、7, 6"，8〇3、8, 0了4,別3 中，其全 部通過引用并入本文，如同在本文完全列出。
[0326] 如本文使用的術(shù)語"約"是指±10%。
[0327] 術(shù)語"包括（comprises) "、"包括（comprising) "、"包括（includes) "、"包括 (including) "、"具有（having) "和其詞形變化是指"包括但不限于"。
[0328] 術(shù)語"由...組成（consisting of)意指"包括并限于"。
[0329] 術(shù)語"基本上由......組成"意指制劑、組合物、方法、基質(zhì)或結(jié)構(gòu)可包括另外的 成分、步驟和/或部分，但只要另外的成分、步驟和/或部分不實質(zhì)上改變所要求保護的制 齊IJ、組合物、方法、基質(zhì)或結(jié)構(gòu)的基本和新穎的特性。
[0330] 如本文使用的，單數(shù)形式"一個（a) "，"一個（an) "和"該（the) "包括復數(shù)指代對 象，除非上下文另有明確指示。例如，術(shù)語"化合物"或"至少一種化合物"可包括多種化合 物，包括其混合物。貫穿本申請，本發(fā)明的各種實施方案可以以范圍格式來呈現(xiàn)。應當理解， 范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并不應被解釋為對本發(fā)明的范圍的硬性限制。因 此，范圍的描述應被認為具有具體公開的所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例 如，諸如從1至6的范圍的描述應被認為具有具體公開的子范圍，諸如從1至3、從1至4、 從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等等，以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如1、2、3、4、5、和 6。這適用，而不論范圍的寬度。
[0331] 每當本文指示數(shù)值范圍時，意指包括在指示的范圍內(nèi)的任何列舉數(shù)字（分數(shù)或整 數(shù)）。短語"范圍/范圍之間"第一指示數(shù)和第二指示數(shù)，且"范圍/范圍從（ranging/ranges between) "第一指示數(shù)"至"第二指示數(shù)在本文可互換使用，并且意指包括第一和第二指示 數(shù)以及在其間的全部分數(shù)和整數(shù)。
[0332] 如本文使用的術(shù)語"方法"是指用于完成給定任務的方式、手段、技術(shù)和程序，包 括，但不限于，化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領域的從業(yè)者已知的，或易于從已知 的方式、手段、技術(shù)和程序開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和程序。
[0333] 應理解，為了清楚起見在單獨實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征，還 可以以組合在單個實施方案中提供。相反，為了簡便起見在單個實施方案的上下文中描述 的本發(fā)明的各種特征，還可以以單獨地或以任何合適的子組合或如適用于本發(fā)明的任何其 他描述的實施方案來提供。在各種實施方案的上下文中描述的某些特征不應被認為是那些 實施方案的必要特征，除非該實施方案沒有這些元素是不起作用的。
[0334] 如上文描繪的以及如以下權(quán)利要求部分要求保護的本發(fā)明的各種實施方案和各 方面在以下實施例中發(fā)現(xiàn)實驗性支持。 實施例
[0335] 現(xiàn)參考以下實施例，其連同以上說明書以非限制性方式闡述本發(fā)明的一些實施方 案。
[0336] 實施例1
[0337] 材料和方法
[0338] 材料
[0339] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的示例性基本的生物粘附基質(zhì)，由包含以下成分的示 例性生物粘附制劑來制備：
[0340] 明膠-在本文呈現(xiàn)的實施例中，來自豬皮的A型明膠（90-100布魯姆）購自 518111 &41(11^(*。對于膠粘機理的研究，使用了來自豬皮具有不同布魯姆數(shù)（90-100、175和 300)的三種類型的"A型"明膠。
[0341] 藻酸鹽-在本文呈現(xiàn)的實施例中，藻酸鈉鹽（粘度約25〇CpS，2% (25°C )購自 Sigma-Aldrich。對于粘合機理的研究，分別使用了具有100-300cP(0. 1-0. 3Pa-sec)的低 粘度（LV)和大于2,000cP(2Pa-sec)的高粘度（HV)的藻酸鈉鹽，2% (25°C)。
[0342] EDC-N_(3-二甲基氨基丙基）-Ν' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽購自Sigma-Aldrich。
[0343] 布比卡因鹽酸鹽購自Sigma-Aldrich。其是用于外周神經(jīng)阻滯、浸潤、和交感神經(jīng)、 骶管或硬膜外阻滯的局部麻醉劑。
[0344] 布洛芬鈉鹽購自Sigma-Aldrich。其-是在疼痛、發(fā)熱、痛經(jīng)、骨關(guān)節(jié)炎、類風濕關(guān) 節(jié)炎和其他風濕性和非風濕性炎性紊亂、和血管性頭痛的治療中使用的常用的非留體抗炎 藥。
[0345] 合成的羥基磷灰石（還稱為羥磷灰石，HA)，以粉末的形式）以及以燒結(jié)粉末的形 式的 β-憐酸三I丐 β-TCP)購自 Sigma-Aldrich，Rehovot，Israel。
[0346] 生物粘附劑制備：
[0347] 藥物洗脫生物粘附劑制備通?；谠诩訜岚迳线_到60°C的加熱條件下，在蒸餾水 中溶解各種量的作為粉末或儲備溶液的明膠、藻酸鹽和生物活性劑。由于最終溶液的高粘 度，攪拌通過攪拌器諸如Fisher' s Vortex Genuine 2?攪拌裝置來實現(xiàn)。
[0348] 簡言之，將預測量的量的生物活性劑溶解于蒸餾水中。此后將預測量的量的藻酸 鹽加入至生物活性劑的清澈并透明的均相溶液中。得到亮黃色均勻粘稠的溶液后，將預測 量的量的明膠i加入其中以得到明膠-藻酸鹽-活性劑混合物，本文中還稱為子制劑A。將 各種預測量的量的偶聯(lián)劑EDC溶解在單獨的蒸餾水管中以得到子制劑B，剛好在使用生物 粘附劑的時間之前，將子制劑B加入至子制劑A中。
[0349] 未封存任何生物活性劑的原始的生物粘附基質(zhì)由沒有生物活性劑的生物粘附制 劑來制備，與以上的程序類似，除了將藻酸鹽首先溶解于純蒸餾水中以外。
[0350] 粘度測量：
[0351] 由于生物粘附制劑的初始粘度主要受明膠-藻酸鹽溶液的粘度的影響，粘度測量 在加入EDC之前來進行。粘度測量使用配備錐和板幾何結(jié)構(gòu)（4°錐角、40_直徑、400 μ m間 隙）的控制應力流變儀（型號AR2000，TA Instruments Ltd·)，在37°C的恒定溫度和10Hz 的恒定剪切速率下來進行以研究在粘合劑的初始粘度和其粘合強度之間的關(guān)系。
[0352] 軟組織粘合強度測量：
[0353] 進行了根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的各種生物粘附基質(zhì)的體外軟組織粘合強度 測量，以檢查該生物粘附制劑的生物活性劑的類型和濃度對粘合強度的效應，即將兩個軟 組織樣品粘合在一起的能力。
[0354] 豬皮（購自Kibbutz Lahav, Israel)被用作粘合試驗的軟組織模型。使用解剖刀 將豬皮切成2cm X 2cm正方形片，并且將片保存于-20°C直至使用。在使用時，將豬皮片在 空氣中解凍，并且將其表皮側(cè)用超級膠水牢固地附著至具有匹配表面積的lcm高度黃銅測 試支架上。將測試支架連接至2cm X 0.4cm X 5cm的黃銅把手環(huán)。
[0355] 將0. 1ml的子制劑A(明膠-藻酸鹽混合物）均勻且平等地分散在具有附著至測試 支架的其表皮側(cè)的兩個豬皮片的真皮側(cè)上，如上文呈現(xiàn)的。此后，將〇. 〇4ml的子制劑B(EDC 溶液）與子制劑A在皮膚片的一個上混合，以得到預固化生物粘附制劑，其固化后變成生物 粘附基質(zhì)。隨后，將附著至另一片的支架以在兩個皮膚片的真皮側(cè)之間建立牢固接觸的方 式放置在第一支架上。然后將兩個支架以1. 25N的恒力壓在一起，并且在37°C和100%濕 度環(huán)境下放置在靜態(tài)培養(yǎng)箱（HeraeuS，B12)中30分鐘。使用各測試的生物粘附制劑制備 五個相同偶聯(lián)的皮膚樣品。
[0356] 在溫育30分鐘后，生物粘附基質(zhì)的粘合強度使用5500Instron Universal Testing Machine (Instron engineering Corp.)和10N測力傳感器在室溫下以拉力來測 量。通過偶聯(lián)的皮膚片鄰接的兩個支架在2mm/min的恒定速度下被拉緊直到實現(xiàn)分離，并 且結(jié)果以千帕斯卡（KPa)來記錄。機械測試過程受到標準測試方法ASTM F-2258-03啟發(fā)。 粘合強度被定義為應力-應變曲線中的最大強度，由Instron Merlin軟件測量。
[0357] 藥物洗脫研究：
[0358] 進行體外釋放研究以檢查生物粘附組分對以麻醉藥物布比卡因和布洛芬的形式 的兩種類型的生物活性劑的釋放動力學的效應。對各制劑進行五次重復。
[0359] 將0. 1ml的測試的子制劑A (明膠-藻酸鹽混合物）使用1ml無針頭的注射器注射 進6mm X 6mm X 3mm矩形娃膠模具中。此后，立即將0.04ml的子制劑B(EDC水溶液）與子 制劑A混合以在模具中形成預固化生物粘附制劑（140 μ 1)。在之后數(shù)分鐘、生物粘附制劑 完全固化后，將潮濕的生物粘附基質(zhì)樣品擠壓出其硅膠模具，并在化學通風櫥中空氣干燥。
[0360] 將空氣干燥的生物粘附基質(zhì)的長方體放入塑料試管中，并將1ml的ρΗ7下的無菌 PBS緩沖液加入至每個試管中，并作為釋放介質(zhì)。將疊氮化鈉（0.02% w/v)加入至介質(zhì)中 以防止微生物污染。加入介質(zhì)后，將試管（內(nèi)有生物粘附樣品）用塑料蓋密封，并在37°C下 放置于靜態(tài)培養(yǎng)箱（Herae US，B12)中14天。
[0361] 在實驗期間的特定時間點，即6小時、1天、2天、3天、7天和14天，從試管中取出 整個介質(zhì)，并用等體積的新鮮的PBS緩沖溶液和0. 02% w/v疊氮化鈉代替。將取出的介質(zhì) 轉(zhuǎn)移至玻璃HPLC小瓶中并保持在-20°C直至分析。對于藥物釋放動力學的確定，使用HPLC 系統(tǒng)評估在各時間點取出的介質(zhì)中該藥物的濃度。
[0362] 包含布比卡因的樣品的HPLC分析使用配備了設定為在210nm開始的UV 2075正 檢測器、和反相柱（ACE 5C18、內(nèi)徑d = 4. 6_、長度=250mm)的Jasco HPLC系統(tǒng)保持在 40°C來進行。流動相由PBS(pH3. 3)和乙腈混合物的混合物（72:28%，v/v)組成，以1. 5ml/ min的流速，用沒有梯度的四元梯度泵（PU 2089正）。用自動進樣器（AS 2057Plus)注射 1-100 μ 1樣品。各洗脫峰的面積使用EZstart軟件3. 1. 7版本，使用校準曲線進行整合。
[0363] 包含布洛芬的樣品的HPLC分析使用配備了設定為在220nm開始的UV 2075正 檢測器、和反相柱（ACE 5C18、內(nèi)徑d = 4. 6_、長度=250mm)的Jasco HPLC系統(tǒng)保持在 40°C來進行。流動相由PBS(pH3. 3)和乙腈混合物的混合物（40:60%，v/v)組成，以2ml/ min的流速，用沒有梯度的四元梯度泵（PU 2089正）。用自動進樣器（AS 2057Plus)注射 1-100 μ 1樣品。各洗脫峰的面積使用EZstart軟件3. 1. 7版本，使用校準曲線進行整合。
[0364] 在體外藥物洗脫過程已開始后14天，37°C下將生物粘附樣品浸入"胰蛋白酶A"溶 液中4小時，以溶解樣品并提取在最初14天期間不釋放的藥物。根據(jù)上文提到的方案使用 一次性濾器裝置（Whatman，0. 2 μ m)將溶解的溶液過濾，注入HPLC系統(tǒng)并分析以確定余藥 的量。
[0365] 水吸收：
[0366] 將主要包含明膠和藻酸鹽的預固化的生物粘附制劑與EDC混合后兩小時，稱重固 化的生物粘附基質(zhì)并記錄干重W toy。此后將五毫升的PBS緩沖液（pH7)加入其中。在37°C 和100%濕度下，將具有生物粘附基質(zhì)樣品的板插入至培養(yǎng)箱（他^6118,812)0.5小時、1小 時、2小時、5小時、24小時和48小時。當指定的時間到期時，將PBS溶液從板中除去，并且 稱重溶脹的生物粘附基質(zhì)樣品并記錄濕重W wrt。根據(jù)公式（Wwrt-Wtoy)X 100/Wtoy計算水吸收 (溶脹）比率。
[0367] 藥物釋放速率可受負載藥物的水凝膠的溶脹的影響。將空氣干燥的無藥物的生物 粘附長方體置于塑料試管中，并浸泡在lml藥物釋放介質(zhì)（PBS pH7和0. 02 %疊氮化鈉） 中，并在37°C下放置于靜態(tài)培養(yǎng)箱（Heraeus，B12)中6小時。在浸濕前（Wdl7l)、在浸濕6 小時后（W wrt)、以及空氣干燥浸濕的樣品后（Wtoy2)，采集樣品的重量值。水吸收被計算為 (wwet-wdry2)xi〇〇/wdryl〇
[0368] 細胞毒性試驗：
[0369] 將成纖維細胞（第14次傳代）解凍，并在37°C、濕潤氣氛和5% C02下，培養(yǎng)于具 有培養(yǎng)基的75mm2燒瓶中。將細胞用補充了 10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和0.1%青霉 素-鏈霉素-制霉菌素的改良的Eagle培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在70% (在傳代16-19次時）匯 合時，將細胞使用lml胰蛋白酶A培養(yǎng)3分鐘來分離，將游離的細胞加入至培養(yǎng)基中，并播 種于6孔板中。當達到70%匯合時，將培養(yǎng)基替換為2ml的包含10% v/v阿爾瑪藍的培養(yǎng) 基溫育4小時。此后，從每個孔中采集兩個100yL樣品，并插入至96孔板中。將板插入用 于在分光光度計（Spectra max 340PC384, Molecular Devices)在 570nm 和 600nm 下分析。
[0370] 進行兩個實驗，首先將生物粘附劑的每個組分分別插入包含4ml培養(yǎng)基的試管 中，并溫育24小時，且然后將該培養(yǎng)基代替包含阿爾瑪藍的培養(yǎng)基加入至細胞。在第二個 實驗中，將具有阿爾瑪藍的培養(yǎng)基替換為4ml的新鮮培養(yǎng)基，并且將0. lml的生物粘附劑加 入至培養(yǎng)基，并溫育24小時，隨后進行使用阿爾瑪藍的另一個讀數(shù)。
[0371] 阿爾瑪藍的還原是細胞增殖中變化的指示；因此，將結(jié)果與沒有組織粘合劑的初 始讀數(shù)進行比較。阿爾瑪藍的吸光度的減少使用制造商的方案來計算，即阿爾瑪藍還原= (ε 6(IcA 57。_ ε 57(Λ 6。。）/ ( ε 57(Λ 6。。_ ε 6(Ι(Λ 57。），其中 ε 57。和 ε 6。。分力丨j 疋氧化的阿小瑪監(jiān)在 570nm和600nm處的摩爾消光系數(shù)，#和f分別是測試和對照在570nm和600nm處的吸光 度，而對照采集為有阿爾瑪藍但沒有任何細胞的培養(yǎng)基。
[0372] 微觀結(jié)構(gòu)表征：
[0373] 研究了根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的負載藥物的生物粘附基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，以表 征不同的藥物在生物粘附基質(zhì)中的分散，并檢查微觀結(jié)構(gòu)對藥物釋放曲線和粘合強度的效 應。為此目的，由420 μ 1根據(jù)本發(fā)明的實施方案的生物粘附制劑制備的約24X24X3mm的 空氣干燥的負載藥物的生物粘附長方體，經(jīng)冷凍斷裂并使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（Quanta 200FEG ESEM)在高真空模式以10kV的加速電壓觀察其橫截面。藥物晶體和聚集體的平均 直徑使用Sigma Scan Pro軟件來分析。
[0374] 硬組織粘合強度測量：
[0375] 牛股骨（在當?shù)赝涝讏鲑徺I）的皮質(zhì)部分被用作硬組織模型，以評估添加至生物 粘附制劑的填料對所得的生物粘附基質(zhì)的粘合強度的效應。
[0376] 使用"FMB-minor"便攜式帶鋸將股骨樣品鋸成2X2X0. 2cm長方體樣本。將樣本牢 固地附著在具有匹配表面面積的金屬測試支架上。
[0377] 粘合強度的測量系統(tǒng)基于用于如本文呈現(xiàn)的軟組織粘附的系統(tǒng)，并且具有相似的 尺寸。
[0378] 將140 μ 1的包含各種濃度的測試的填料的生物粘附制劑均勻地散布在兩個股 骨樣本的暴露的側(cè)面上。然后將樣本通過施加7. 5Ν的載量立即彼此連接，并置于37°C 和100 %濕度環(huán)境中。在30分鐘后，粘合強度使用5500Instron universal testing machine (Instron Engineering Corp.)和2kN測力傳感器在室溫下以拉力模式來測量。
[0379] 股骨關(guān)節(jié)的兩個部分以2_/分鐘的恒定速度被拉緊，直到實現(xiàn)分離。
[0380] 機械測試過程受到標準測試方法ASTM F-2258-03啟發(fā)。粘合強度被定義為應 力-應變曲線中的最大強度，由Instron Merlin軟件測量。
[0381] 實施例2

【背景技術(shù)】
[0382] 基于 Sung 等人的教導[J. Biomed. Materials Res.，46 (4)，520 - 530 頁，1999]制 備了制劑，用于與根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的生物粘附制劑和基質(zhì)進行比較。簡言之，在 50°C將由預稱重的量的藻酸鹽制備的儲備溶液溶解于蒸餾水中，且溶液澄清后將預稱重的 量的明膠加入其中，并攪拌直到溶液變得澄清。所得的混合物包含600mg/ml明膠和30mg/ ml藻酸鹽。將偶聯(lián)劑EDC溶解于蒸餾水中，以得到10mg/ml溶液和20mg/ml溶液。
[0383] 所得制劑的測試如下進行。使用之前立刻，將0. 1ml明膠-藻酸鹽儲備溶液與 0. 035ml EDC儲備溶液混合以得到445mg/ml明膠、22mg/ml藻酸鹽和2. 6mg/ml EDC的終濃 度。該混合物在一片豬皮上來制備，并且此后將第二片皮膚放置在制劑上，且將偶聯(lián)的皮膚 片在0. 129kg的壓力下放置在潮濕培養(yǎng)箱（100%濕度，37°C )中30分鐘。對偶聯(lián)的皮膚片 進行如上文呈現(xiàn)的機械測試方案，并展示了 4436± 1361Pa的結(jié)果。應注意，由于在室溫下 太迅速凝膠化，所得的制劑難以應用于皮膚片。
[0384] 在重現(xiàn)由Sung等人報道的制劑的另一個嘗試中，由水中840ml/ml明膠和42mg/ml 藻酸鹽的儲備溶液制備了具有600mg/ml明膠、30mg/ml藻酸鹽和20mg/ml EDC的終濃度的 制劑。此制劑不可能應用，不論偶聯(lián)劑濃度。
[0385] 實施例3
[0386] 粘合強度
[0387] 進行了若干系列的測量以闡明生物粘附制劑的每個組分對所得生物粘附基質(zhì)的 粘合強度的效應，以千帕（KPa)來表示。明膠、藻酸鹽和偶聯(lián)劑EDC濃度的效應顯示于表1、 圖1和圖2中。
[0388] 表1顯示了對四個系列的樣品進行的粘合強度測試除以變化的參數(shù)的結(jié)果，其中 藻酸鹽在系列1、2和3中不同，而明膠跨越系列1-3不同，且EDC在系列4中不同而明膠和 藻酸鹽不變。
[0389] 表 1
[0390]

【權(quán)利要求】
1. 一種生物粘附制劑，所述生物粘附制劑包含： a) 明膠； b) 藻酸鹽； c) 偶聯(lián)劑；和 d) 水， 其中在所述制劑中所述明膠的濃度小于500mg/ml， 所述制劑特征為范圍從IPa-sec至50Pa_sec的室溫粘度。
2. 如權(quán)利要求1所述的生物粘附制劑，所述生物粘附制劑在固化后形成生物粘附基 質(zhì)，其中用于形成所述基質(zhì)的固化時間范圍為從5秒至30分鐘。
3. 如權(quán)利要求2所述的制劑，所述制劑使得所述基質(zhì)特征為以下的至少一種： 范圍從2, 000帕至60, 000帕的有生命力的生物對象的粘合強度； 生理條件下范圍從0. 5Mpa至200MPa的撓曲強度；以及 范圍從7天至6個月的生物可降解速率。
4. 如權(quán)利要求1-3的任一項所述的制劑，其中在所述制劑中所述明膠的濃度范圍為從 100mg/ml 至 300mg/ml。
5. 如權(quán)利要求1-4的任一項所述的制劑，其中在所述制劑中所述藻酸鹽的濃度范圍為 從 10mg/ml 至 60mg/ml。
6. 如權(quán)利要求1-5的任一項所述的制劑，其中在所述制劑中所述偶聯(lián)劑的濃度范圍為 從 lmg/ml 至 50mg/ml〇
7. 如權(quán)利要求1-5的任一項所述的制劑，其中所述明膠的濃度范圍為從200mg/ml至 300mg/ml,所述藻酸鹽的濃度范圍為從20mg/ml至40mg/ml,且所述偶聯(lián)劑的濃度范圍為從 10mg/ml 至 30mg/ml。
8. 如權(quán)利要求1-7的任一項所述的制劑，所述制劑還包含交聯(lián)促進劑。
9. 如權(quán)利要求8所述的制劑，其中所述交聯(lián)促進劑為N-羥基琥珀酰亞胺。
10. 如權(quán)利要求8和9的任一項所述的制劑，其中，相對于在所述制劑中所述偶聯(lián)劑的 量，在所述制劑中所述交聯(lián)促進劑的濃度范圍為從1 %至50%。
11. 如權(quán)利要求10所述的制劑，其中所述明膠的濃度范圍為從200mg/ml至300mg/ml， 所述藻酸鹽的濃度范圍為從20mg/ml至40mg/ml,所述偶聯(lián)劑的濃度范圍為從5mg/ml至 20mg/ml，且相對于在所述制劑中所述偶聯(lián)劑的量，所述交聯(lián)促進劑的濃度范圍為從5%至 20%。
12. 如權(quán)利要求1-11的任一項所述的制劑，所述制劑還包含填料。
13. 如權(quán)利要求12所述的制劑，其中在所述制劑中所述填料的濃度范圍為從所述制劑 的 0· 1 % w/v 至 1 % w/v。
14. 如權(quán)利要求1-13的任一項所述的制劑，所述制劑還包含生物活性劑。
15. 如權(quán)利要求14所述的制劑，其中在所述制劑中所述生物活性劑的濃度范圍為從所 述制劑的總體積的〇. 1 %重量/體積至10%重量/體積。
16. 如權(quán)利要求14和15的任一項所述的生物粘附制劑，所述生物粘附制劑用于在固 化后形成藥物洗脫生物粘附基質(zhì)，其中用于形成所述基質(zhì)的固化時間范圍為從5秒至30分 鐘。
17. 如權(quán)利要求1-16的任一項所述的制劑，所述制劑被鑒定用于將至少兩個對象彼此 粘合，所述對象中的至少一個為生物對象。
18. 權(quán)利要求1-16的任一項的生物粘附制劑在制造用作生物粘附基質(zhì)的產(chǎn)品中的用 途。
19. 權(quán)利要求1-16的任一項的生物粘附制劑在制造用作藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的產(chǎn) 品中的用途。
20. 權(quán)利要求1-16的任一項的生物粘附制劑在制造用于將至少兩個對象彼此粘合的 產(chǎn)品中的用途，所述對象中的至少一個為生物對象。
21. -種生物粘附基質(zhì)，所述生物粘附基質(zhì)通過制備權(quán)利要求1-16的任一項的制劑并 允許經(jīng)過固化時間來形成。
22. 如權(quán)利要求21所述的生物粘附基質(zhì)，所述生物粘附基質(zhì)還包括在其中封存的生物 活性劑，所述生物粘附基質(zhì)為藥物洗脫生物粘附基質(zhì)，并且通過制備權(quán)利要求14-16的任 一項的制劑來形成所述基質(zhì)。
23. -種試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-16的任一項的生物粘附制劑。
24. -種形成生物粘附基質(zhì)或藥物洗脫生物粘附基質(zhì)的方法，所述方法包括制備權(quán)利 要求1-16的任一項的制劑并允許經(jīng)過固化時間。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物粘附基質(zhì)在至少兩個對象之間形成，所 述對象的至少一個為生物對象。
26. 如權(quán)利要求24-25的任一項所述的方法，所述方法還包括： 將所述制劑應用于所述對象的至少一個上；以及 鄰接所述對象。
27. -種將至少兩個對象彼此粘合的方法，所述對象的至少一個為生物對象，所述方法 包括： 制備權(quán)利要求1-16的任一項的所述制劑； 將所述制劑應用于所述對象的至少一個上； 鄰接所述對象；以及 允許經(jīng)過固化時間。
28. 如權(quán)利要求26和27的任一項所述的方法，其中所述鄰接和/或所述緊固經(jīng)所述制 劑的固化時間實現(xiàn)，以由此形成生物粘附基質(zhì)。
29. -種生物粘附基質(zhì)，所述生物粘附基質(zhì)包含彼此共價偶聯(lián)的明膠和藻酸鹽和在其 中封存的至少一種生物活性劑。
30. 如權(quán)利要求29所述的基質(zhì)，所述基質(zhì)特征為以下的至少一種： 范圍從2, 000帕至60, 000帕的有生命力的生物對象的粘合強度； 生理條件下范圍從0. 5Mpa至200MPa的撓曲強度；以及 范圍從7天至6個月的生物可降解速率。
31. 如權(quán)利要求29和30的任一項所述的基質(zhì)，所述基質(zhì)被放置在至少兩個對象之間， 所述對象的至少一個為生物對象。
32. 如權(quán)利要求29-31的任一項所述的基質(zhì)，所述基質(zhì)通過制備權(quán)利要求14-16的任一 項的生物粘附制劑并允許經(jīng)過固化時間來形成。
【文檔編號】A61K47/34GK104220096SQ201380020118
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月16日
【發(fā)明者】梅塔爾·茲伯曼, 阿達亞·謝夫-皮勒格, 本亞明·科恩, 梅塔爾·弗克斯 申請人:技術(shù)創(chuàng)新動力基金（以色列）有限合伙公司