用于產(chǎn)生和純化來(lái)自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的膠原酶的新方法
【專利摘要】本發(fā)明要求用于產(chǎn)生和純化通過(guò)非致病性需氧細(xì)菌溶藻弧菌解毒化學(xué)變型(NCIMB編號(hào)：11038，異名LMG 3418，后文中稱為溶藻弧菌)產(chǎn)生的微生物膠原酶(微生物膠原酶EC 3.4.24.3)的新方法，該方法以穩(wěn)定、可重現(xiàn)、便宜的發(fā)酵方法提供高產(chǎn)生水平的膠原酶。按照本文所述的方法從溶藻弧菌產(chǎn)生的膠原酶還具有優(yōu)于其他微生物膠原酶的比活，在水溶液中穩(wěn)定，且可以冷凍而無(wú)顯著損傷。本發(fā)明的另一目的是包含按照所述的產(chǎn)生和純化方法獲得的膠原酶的藥物組合物，其用于表征為膠原累積的障礙的治療性處理的目的，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕疵/缺陷的處理。
【專利說(shuō)明】用于產(chǎn)生和純化來(lái)自溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus) 的膠原酶的新方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 膠原酶是具有蛋白水解活性的金屬酶，其需要活性部位中的鋅離子來(lái)執(zhí)行其分解 天然膠原的具體功能。與其他蛋白酶不同，它們可以在生理pH和溫度條件下水解膠原。 許多由細(xì)菌產(chǎn)生的膠原酶為現(xiàn)有技術(shù)中已知（弧菌屬（Vibrio)、梭菌屬（Clostridium)、 鏈霉菌屬（Streptomyces)、假單胞菌屬（Pseudomonas));由梭菌屬產(chǎn)生的那些膠原酶 (Santyl?、Noruxol?)廣泛用于治療多種來(lái)源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷和肥 大性瘢痕的藥物組合物中，因?yàn)樗鼈兎纸獯嬖谟趬乃澜M織中的膠原。這便于去除細(xì)胞碎片， 細(xì)胞碎片常構(gòu)成上皮細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合和再生上皮過(guò)程中遷移的障礙（Rao,D.B.等，1975)。 最近也將來(lái)自弧菌屬的膠原酶用于相似目的（EP1901755);此專利僅描述了包含角叉藻聚 糖作為穩(wěn)定劑的親脂性組合物（脂質(zhì)凝膠（lipogel))。但是，通常由該物質(zhì)發(fā)揮的炎性作 用為技術(shù)人員已知。在任何情況下，不考慮其來(lái)源，膠原酶在水性載體中具有極低的穩(wěn)定 性，因此總是配制在完全親脂的載體中；Santyl?、Noruxol?和BionectStart?,是具 有全親脂基的軟膏劑，其中酶絕非均勻分布，且隨時(shí)間推移而經(jīng)歷顯著的活性喪失。
[0002] 親脂性載體確保酶的穩(wěn)定性和藥物產(chǎn)品的可保存性，而對(duì)其治療活性不利；膠 原酶非常緩慢地從親脂性載體釋放，以致其生物利用率極大地受限。膠原酶也可以用于 諸如粘連性囊炎（凍結(jié)肩）、掌攣縮?。―upuytren'scontracture)、纖維性海綿體炎 (Peyronie'sdisease)、蜂窩織炎和手術(shù)后粘連的障礙的全身治療，尤其是通過(guò)注射。在水 性載體中的穩(wěn)定性對(duì)這些應(yīng)用至關(guān)重要。用于掌攣縮病的注射治療的產(chǎn)品目前已上市（在 使用時(shí)復(fù)溶的親液物質(zhì)），該產(chǎn)品以精確的重量比包含通過(guò)發(fā)酵溶組織梭菌（Clostridium histolyticum)提取和純化的兩種膠原酶的混合物。
[0003] 如已述，后者是膠原酶最常見的來(lái)源之一；但是，它是需要厭氧發(fā)酵的致病微生物 (Mandl,I?等，1958,ArchBiochemBiophys, 74:465-475)。
[0004] 1972年首次鑒定了無(wú)色桿菌屬（Achromobacter)的一些菌株的溶膠原活性 (Thomson,J.A.，Woods,D.R?和Welton,R.L. 1972)，隨后對(duì)解毒無(wú)色桿菌（Achromobacter iophagus)菌株（隨后重新歸類為溶藻弧菌解毒化學(xué)變型（Vibrioalginolyticus chemovar.iophagus)，Emod,I?等1983)進(jìn)行了第一批研究，這些研究證明了具有高比活的 膠原酶的存在（Welton和W〇〇dsl973)。關(guān)于用來(lái)通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生膠原酶的微生物的選擇，溶 藻弧菌的使用比溶組織梭菌更有利，因?yàn)樗欠侵虏⌒缘?，且允許在需氧環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵， 具有相當(dāng)大的工業(yè)優(yōu)勢(shì)。微生物菌株的致病性是重要方面，因?yàn)槌善分械娜我怆s質(zhì)（微生 物或蛋白質(zhì)殘余物）可引起嚴(yán)重的副作用。操作致病菌株明顯需要在純化階段特別注意， 因此是更復(fù)雜、昂貴的工業(yè)方法。
[0005] 產(chǎn)生自溶藻弧菌的微生物膠原酶EC3. 4. 24. 3是Zn2+金屬酶，其還因許多原因而 不同于由溶組織梭菌產(chǎn)生的膠原酶：
[0006] ?它特異性作用于合成肽Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg(其中PZ= 4-苯基偶氮 芐基氧羰基），該合成肽是選擇用于評(píng)價(jià)溶膠原活性的合成底物。按照本發(fā)明產(chǎn)生的來(lái)自 溶藻弧菌的膠原酶是唯一一種能夠在Leu-Gly鍵處分解膠原的膠原酶（Keil，B.，Gilles 八.-]\1.，1^。1'〇1867，六.，11111'；[011，1和1'0叫，1-1'.1975;1(6；[113.]\^1：1'1叉3卯卩1.1992; 1:127-33)；
[0007] ?它具有比獲自溶組織梭菌的類似物高得多的蛋白水解活性；
[0008] ?它在天然膠原的切割位點(diǎn)處具有特異性；它在2個(gè)位點(diǎn)處切割天然膠原的螺旋 鏈，優(yōu)選在距N端3/4的Pro-Y-Gly-Pro序列的Y-Gly鍵處，其中Y是中性氨基酸。相反，來(lái) 自溶組織梭菌的膠原酶在天然膠原鏈中存在多個(gè)切割位點(diǎn)（Lecroisey，A.Keil，B. 1979)。
[0009] 溶藻弧菌解毒化學(xué)變型菌株僅產(chǎn)生一種膠原酶，但純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析證 明保持溶膠原活性的幾個(gè)具有不同分子量的條帶的存在。已將這些低分子量種類歸因于該 酶的自體蛋白水解過(guò)程，該過(guò)程受特別配制的緩沖液抑制（Keil-Dlouha，V. 1976)。
[0010] 1992年，Takeuchi等從溶藻弧菌克隆了編碼膠原酶的整個(gè)序列。從核苷酸序列 推斷的氨基酸序列顯示成熟膠原酶由739個(gè)氨基酸形成，具有81，875Da的分子量。來(lái)自 溶藻弧菌的膠原酶的核苷酸和氨基酸序列未與其他膠原酶的序列顯示任何顯著的相似性 (Takeuchi，H.，1992)。到目前為止，用于從所討論的菌株產(chǎn)生酶的方法產(chǎn)生相當(dāng)?shù)偷漠a(chǎn)率 及尤其是對(duì)注射用途而言具有不能令人滿意的純度的產(chǎn)物。專利EP0115974描述了用于 產(chǎn)生和純化來(lái)自溶藻弧菌膠原酶的方法；終產(chǎn)品是僅在加入牛皮膠原片段（ASF)后穩(wěn)定的 酶混合物（膠原酶、中性蛋白酶和內(nèi)切核酸酶）。
[0011] 所獲得的物質(zhì)具有非常低的純度。此外，在通過(guò)注射施用所選擇的藥物組合物時(shí)， ASF的存在可以在制備所鑒定的藥物形式時(shí)或尤其是在它是動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生問(wèn)題。
[0012] 此外，如已述，目前已知的藥物組合物采用軟膏劑的形式，而對(duì)于局部應(yīng)用，尤其 是對(duì)于全身施用，膠原酶處于極純的形式且在水性載體中穩(wěn)定（以改善酶在組合物中的分 布）是至關(guān)重要的；絕對(duì)優(yōu)選水性載體用于注射治療。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)公開用于產(chǎn)生和純化來(lái)自溶藻弧菌的膠原酶的創(chuàng)新方法來(lái)克服這些 問(wèn)題，該方法的特征在于高產(chǎn)率、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及成品的高純度。成品還在水溶液中穩(wěn)定， 因此可以甚至在-20°c和-80°c之間的溫度下長(zhǎng)期保存而不遭受顯著損傷。
[0014] 由于高純度和膠原鏈上切割的特異性，本文所要求的膠原酶還可以用來(lái)解離組織 和分離細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，以用于需要分離的細(xì)胞的所有實(shí)驗(yàn)和治療方法。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明要求用于產(chǎn)生和純化通過(guò)非致病性需氧細(xì)菌溶藻弧菌解毒化學(xué)變型 (NCMB編號(hào)：11038,異名LMG3418,后文中稱為溶藻弧菌）產(chǎn)生的微生物膠原酶（微生物 膠原酶EC3.4.24.3)的新方法：該方法以穩(wěn)定、可重現(xiàn)、便宜的發(fā)酵方法提供高產(chǎn)牛水平 的膠原酶。按照本文所述的產(chǎn)生和純化方法從溶藻弧菌產(chǎn)生的膠原酶的序列（SEQIDN0 : 1)的特征在于，與由來(lái)自溶藻弧菌的膠原酶基因編碼的814個(gè)氨基酸的序列（本文報(bào)道為 SEQIDN0 :2,對(duì)應(yīng)于微生物膠原酶EC3.4. 24. 3)相比，缺失了氨基酸1-75。通過(guò)本發(fā)明 的方法，產(chǎn)生了成熟蛋白質(zhì)，該成熟蛋白質(zhì)是活性核心，由739個(gè)氨基酸組成，更確切而言， 由氨基酸76-814組成：
[0017] TACDLEALVTESSNQLISEILSQGATCVNQLFSAESRIQESVFSSDHMYNIAKHTTTLAKGYTGGGSDE LETLFLYLRAGYYAEFYNDNISFIEWVTPAVKESVDAFVNTASFYENSDRHGKVLSEVIITMDSAGLQHAYLPQVTQ WLTRWNDQYAQHffYMRNAVNGVFTILFGGQffNEQFVQIIGNQTDLAKALGDFALRASSIGAEDEFMAANAGRELGRL TKYTGNASSVVKSQLSRIFEQYEMYGRGDAVWLAAADTASYYADCSEFGICNFETELKGLVLSQTYTCSPTIRILSQ NMTQEQHAAACSKMGYEEGYFHQSLETGEQPVKDDHNTQLQVNIFDSSTDYGKYAGPIFDISTDNGGMYLE⑶PSQP GNIPNFIAYEASYANADHFVWNLEHEYVHYLDGRFDLYGGFSHPTEKIVWWSEGIAEYVAQENDNQAALETILDGST YTLSEIFETTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFENHKDDVNQMLVETRQGNWINYKATITQWANLYQSEFEQWQQTLVS NGAPNAVITANSKGKVGESITFSSENSTDPNGKIVSVLWDFGDGSTSTQTKPTHQYGSEGEYSVSLSVTDSEGLTAT ATHTVVISALGGNDTLPQDCAVQSKVSGGRLTAGEPVCLANQQTIWLSVPAVNESSNLAITTGNGTGNLKLEYSNSG WPDDTNLHGWSDNIGNGECITLSNQSNYWGYVKVS⑶FENAAIVVDFDAQKCRQ(SEQ ID NO :1)
[0018] 此外，按照本發(fā)明的方法從溶藻弧菌產(chǎn)生的膠原酶還具有優(yōu)于其他微生物膠原酶 的比活，￥純，在水溶液中穩(wěn)定，目.可以冷凍而無(wú)顯著損傷。
[0019] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是按照所述的產(chǎn)生和純化方法獲得的膠原酶，其用于 表征為膠原的累積的病理的治療性處理，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕疵/缺陷的 處理；例如，值得一提的是，多種來(lái)源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷、燙傷和肥大性瘢 痕、蜂窩織炎、手術(shù)后粘連，以及"凍肩"或粘連性囊炎、掌攣縮病、陰莖纖維性海綿體炎。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是包含按照所述的產(chǎn)生和純化方法獲得的膠原酶的藥物組合 物，其用于表征為膠原的累積的障礙的治療性處理，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕 疵/缺陷的處理；實(shí)例是多種來(lái)源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷、燙傷和肥大性瘢痕、 蜂窩織炎、手術(shù)后粘連、粘連性囊炎（凍肩）、掌攣縮病和陰莖纖維性海綿體炎。
[0021] 按本文所述獲得的膠原酶還適合應(yīng)用于組織解離，及細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的分離。此 應(yīng)用用于例如胰島細(xì)胞移植方法，以從周圍胰腺組織分離胰島細(xì)胞，且通常用于需要組織 解離的所有實(shí)驗(yàn)和治療方法。
[0022] 通過(guò)下文所述的方法獲得的膠原酶表征為：
[0023] 分子量為82Kda ;
[0024]比活在1000和1800nkat/mg之間；
[0025] 純度在98. 0和100%之間；
[0026] 缺乏微生物和蛋白質(zhì)污染物，特別是缺乏內(nèi)毒素和DNA ;
[0027] 在5. 5和11之間的pH下穩(wěn)定；
[0028] 在4°C和40°C之間的T下在水溶液中穩(wěn)定，尤其是在37°C下穩(wěn)定；
[0029] 在4°C下在水溶液中穩(wěn)定30天；
[0030] 在-20°C和-80°C之間的T下在水溶液中穩(wěn)定24-48個(gè)月；
[0031] 獲得穩(wěn)定冷凍粉末的親液性（lyophilisability)。
[0032] 它優(yōu)選還表征為：
[0033] N端序列：H2N-Thr-Ala-Cys-Asp-Leu-Glu-Ala-Leu-Val-Thr-Glu-Se;r-Se;r-Asn-G ln(SEQ ID NO:3)；
[0034] 受Ag和Cu鹽及螯合劑EDTA抑制；
[0035] 可在_20°C和-80°C之間的溫度下（即以冷凍形式）保存而無(wú)酶活性的顯著喪失 (5-15% )〇
[0036] 本發(fā)明的膠原酶產(chǎn)生和純化方法包括以下階段：
[0037] 階段A:將溶藻弧菌解毒化學(xué)變型接種入三角瓶，并用非牛動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)液發(fā) 酵；
[0038] 階段B:通討用100_500kD分子量截留（MWC0)盒（優(yōu)選300kD)進(jìn)行切向流超濾 (TFF1)來(lái)澄清這樣獲得的發(fā)酵液；
[0039] 階段C:通討用5-30kDMWC0盒（優(yōu)選10kDMWC0)進(jìn)行切向流超濾（TFF2)來(lái)透 析和濃縮階段B中獲得的澄清培養(yǎng)基；
[0040] 階段D:在6. 9和7. 4之間的pH下，優(yōu)選在7. 1的pH下，通過(guò)攜帶弱堿性基團(tuán)的 陰離子交換樹脂來(lái)純化階段C中獲得的含有膠原酶的溶液；
[0041] 階段E:通討用10-50kDMWC0盒（優(yōu)選30kDMWC0)進(jìn)行切向流超濾（TFF3)來(lái)透 析和濃縮所收集的源自階段D的具有溶膠原活性的級(jí)分；
[0042] 蹌段￡:在6. 9和7. 4之間的pH下，優(yōu)選在7. 1的pH下，通過(guò)攜帶強(qiáng)堿性基團(tuán)的 陰離子交換樹脂來(lái)純化這樣獲得的溶液；
[0043] 階段G:通討用10_50kDMWC0盒（優(yōu)選30kDMWC0)進(jìn)行切向流超濾（TFF4)來(lái)滲 濾和濃縮源自階段F的具有> 95%的溶膠原活性的級(jí)分；
[0044] 階段H:通過(guò)0.2um絕對(duì)過(guò)濾器過(guò)濾這樣獲得的含有膠原酶的溶液，并保存 在-20°C和_80°C之間的溫度下。
[0045] 在每個(gè)階段結(jié)束時(shí)用下文"測(cè)試方法"段落中所述的材料和方法測(cè)試。
[0046] 階段A:是分批發(fā)酵法；在含有培養(yǎng)液的三角瓶中制備接種物，該培養(yǎng)液由非牛動(dòng) 物來(lái)源（如豬來(lái)源）的蛋白胨或非牛動(dòng)物和植物來(lái)源的蛋白胨的混合物、NaCl、CaCljP TRIS(三羥甲基氨基甲烷）在6. 9和7. 4之間，優(yōu)選7. 1的pH下形成。在600nm下測(cè)量的 光密度（〇D_J達(dá)到1和4之間的值時(shí)，接種物即可轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐。
[0047] 用來(lái)進(jìn)行發(fā)酵的培養(yǎng)基與用來(lái)制備接種物的相同，加入少量消泡劑來(lái)防止由通氣 和攪拌引起的泡沫形成。
[0048] 一次發(fā)酵持續(xù)14-20小時(shí)，通常為16小時(shí)。發(fā)酵期間，通過(guò)無(wú)菌方法取樣來(lái)檢驗(yàn) 純度、〇D6Q(lmi、酶活性和pH。
[0049] 在酶活性彡25,OOOnkat/升時(shí)，終止發(fā)酵，并加入0&(：12來(lái)穩(wěn)定酶。使溫度降至約 8 °C，并使混合物處于攪拌之下。
[0050]對(duì)在階段A獲得的溶液進(jìn)行以下控制測(cè)試：0D6(l(lnm、pH、酶活性、蛋白質(zhì)濃度、 SDS-PAGE。
[0051] 除目的膠原酶外，源自階段A的發(fā)酵液含有（present)在發(fā)酵期間由細(xì)菌產(chǎn)生的 其他蛋白酶（主要是絲氨酸蛋白酶）、具有高分子量的蛋白質(zhì)聚集體和培養(yǎng)基的殘留物。
[0052] 階段B:通討用100_500kDMWC0盒（優(yōu)選300kD)進(jìn)行切向流超濾（TFF1)來(lái)澄清 源自階段A的發(fā)酵液；這消除了微生物細(xì)胞和具有高分子量的蛋白質(zhì)聚集體。
[0053] 對(duì)在階段B獲得的溶液進(jìn)行以下控制測(cè)試：pH、酶活性、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE、酪 蛋白酶測(cè)定。
[0054] 階段C:通討用5-30kDMWC0盒（優(yōu)選10kDMWC0)進(jìn)行超濾來(lái)濃縮和透析源自階 段B的澄清培養(yǎng)基15-25倍。在階段C獲得的溶液通常含有500-700nkat/ml的酶活性，且 在-20°C下穩(wěn)定12個(gè)月。用5-30kDMWC0盒進(jìn)行的切向流過(guò)濾的目的是顯著減小體積，并 用25mMTRIS-HCl、10mMCaCl2、pH7. 1緩沖液替換培養(yǎng)基，該緩沖液穩(wěn)定膠原酶，且適合用 于隨后的純化方法。
[0055] 對(duì)在階段C獲得的溶液進(jìn)行以下控制測(cè)試：pH、酶活性、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE。
[0056] 階段D:用攜帶二乙基氨基烷基，優(yōu)選二乙基氨基乙基的陰離子交換樹脂，如 DE-52 (二乙基氨基乙基纖維素DEAEWhatman)對(duì)源自階段C的含有膠原酶的溶液進(jìn)行第一 次層析純化。這些樹脂攜帶弱堿性基團(tuán)，因此在6. 9和7. 4之間的窄pH范圍內(nèi)，優(yōu)選7. 1 具有依賴于pH的離子化程度。
[0057] 然后將源自階段C的含有膠原酶的溶液上樣至用DE-52樹脂裝填的柱（Pall ChromatographyColumnResoluteMod. 400-V-EP7040)內(nèi)。通過(guò)紫外-可見光檢測(cè)器在 280nm監(jiān)測(cè)層析運(yùn)行。
[0058] 在對(duì)柱進(jìn)行上樣前，用與在階段C期間在其中透析膠原酶的緩沖液相同的緩沖液 (后文稱為"平衡緩沖液"（25mMTRIS-HCl、10mMCaCl2、pH7. 1))平衡柱。
[0059] 上樣后，用相同的平衡緩沖液洗脫具有結(jié)合的膠原酶的樹脂，以消除未與樹脂結(jié) 合的蛋白質(zhì)。用具有更高電導(dǎo)的緩沖液（后文稱為"洗滌緩沖液"（300mMTRIS-HC1和 10mMCaCl2、pH7. 1))進(jìn)行第二次洗滌，以消除低分子量雜質(zhì)。用稱為"洗脫緩沖液"(300mM TRIS-HCl、700mMNaCl和10mMCaCl2、pH7. 1)的第三緩沖液通過(guò)進(jìn)一步提高電導(dǎo)來(lái)洗脫與 樹脂結(jié)合的膠原酶。
[0060] 階段E:將洗脫期間收集的含有膠原酶活性且在SDS-PAGE中顯示良好純度的級(jí)分 組合，并轉(zhuǎn)移至具有10_50kDMWC0盒（優(yōu)選30kD)的超濾系統(tǒng)，以在穩(wěn)定膠原酶且適合用 于隨后的純化方法的緩沖液中濃縮和透析。
[0061] 對(duì)在階段E獲得的溶液進(jìn)行以下控制測(cè)試：pH、酶活性、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE、酪 蛋白酶測(cè)定。
[0062] 階段F:將源自階段E的溶液轉(zhuǎn)至具有陰離子交換層析的第二純化階段，該陰離子 交換層析使用攜帶由季銨形成的強(qiáng)堿性交換基團(tuán)的樹脂，如Source?15Q(GE Healthcare)。 通過(guò)紫外-可見光檢測(cè)器在280nm監(jiān)測(cè)層析運(yùn)行。
[0063] 上樣前，用與在階段E期間在其中透析膠原酶的緩沖液相同的緩沖液（平衡緩沖 液）平衡用Source?15Q樹脂裝填的柱（MilliporeGS70-550)。
[0064] 將源自階段E的含有膠原酶的溶液上樣至柱中，并用平衡緩沖液洗脫具有結(jié)合的 膠原酶的樹脂，以消除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用第二緩沖液（洗脫緩沖液，2-300mMTRIS-HC1和 10mMCaCl2、pH7. 1)通過(guò)進(jìn)一步提高電導(dǎo)來(lái)洗脫與樹脂結(jié)合的膠原酶。
[0065] 階段G:將洗脫期間收集的含有溶膠原活件目.在SDS-PAGE中顯示彡95%的純度的 級(jí)分組合，并轉(zhuǎn)移至具有10_50kDMWC0盒（優(yōu)選30kD)的超濾系統(tǒng)，以在穩(wěn)定膠原酶的緩 沖液中濃縮和透析。
[0066] 對(duì)在階段G獲得的溶液進(jìn)行以下控制測(cè)試：pH、酶活性、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE。 [0067] 階段H:將源自階段G的膠原酶溶液稀釋在穩(wěn)定緩沖液中，并濾過(guò)0. 2ym絕對(duì)過(guò) 濾器。這樣獲得的無(wú)菌溶液是純化方法的終產(chǎn)品，針對(duì)以下特征進(jìn)行分析：
[0068]-蛋白質(zhì)濃度
[0069] _酶活性
[0070] -pH
[0071] _酪蛋白酶測(cè)定
[0072]-SDS純度
[0073] -UPLCSEC二聚體和高分子量分析
[0074] _內(nèi)毒素
[0075] -無(wú)菌測(cè)試
[0076] 分析方法
[0077]膠原酶的酶活性的分光光度測(cè)定（Wilnsch，E.，&Heidrich，H.G.，修改）
[0078] 本方法允許測(cè)定存在于水溶液中的膠原酶的活性?；钚员硎緸殚_特，其定義為在 方法指定的條件下在1秒內(nèi)催化1摩爾底物的轉(zhuǎn)化的酶的量。與所分析的溶液的量相關(guān)的 在37°C和pH7. 1下在預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)催化底物轉(zhuǎn)化的酶的量表示為nkat/ml。該方法的原理基 于膠原酶和膠原酶特異的合成底物PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨 酸（其中PZ= 4-苯基偶氮芐基氧羰基）之間的反應(yīng)。與膠原酶反應(yīng)后，合成底物切割為 2個(gè)片段：PZ_L_脯氨酰-L-殼氨酰和甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸。第二片段是無(wú)色的， 而第一片段是生色團(tuán)，且可以在用用檸檬酸酸化的乙酸乙酯的有機(jī)溶液萃取后通過(guò)分光光 度法測(cè)定。該片段在320nm的吸光度與酶活性成比例。
[0079] 為了進(jìn)行酶促測(cè)定，有必要制備樣品的一系列稀釋液，以使酶濃度落入該方法的 線性范圍。
[0080] 將待分析的樣品稀釋在25mMTris、10mMCaCl2、pH7. 1緩沖液中；使0. 5ml此緩 沖溶液與2ml1. 23mM的合成底物溶液在37°C反應(yīng)15分鐘。在酶促反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用含5:1 乙酸乙酯和0. 5%檸檬酸的混合物、pH3. 5的有機(jī)相萃取0. 5ml反應(yīng)混合物。去除有機(jī)相， 并通過(guò)加入300mg無(wú)水硫酸鈉來(lái)脫水。在320nm通過(guò)分光光度法針對(duì)乙酸乙酯分析經(jīng)脫水 的有機(jī)相。用以下公式計(jì)算表示為nkat/ml的酶活性的結(jié)果：

【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生和純化來(lái)自溶藻弧菌解毒化學(xué)變型的膠原酶的方法，其包括以下階段： 階段A :將溶藻弧菌解毒化學(xué)變型接種入三角瓶，并用非牛動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)液發(fā)酵； 階段B :通過(guò)用100-500kD分子量截留（MWCO)盒，優(yōu)選用300kD分子量截留（MWCO)盒， 進(jìn)行切向流超濾來(lái)澄清這樣獲得的發(fā)酵液； 階段C :通過(guò)用5-30kD MWCO盒，優(yōu)選用10kD MWCO盒，進(jìn)行切向流超濾來(lái)透析和濃縮 階段B中獲得的澄清培養(yǎng)基； 階段D :在6. 9和7. 4之間的pH下，優(yōu)選在7. 1的pH下，通過(guò)攜帶弱堿性基團(tuán)的陰離 子交換樹脂來(lái)純化階段C中獲得的含有膠原酶的溶液； 階段E :通過(guò)用10-50kD MWCO盒，優(yōu)選用30kD MWCO盒，進(jìn)行切向流超濾來(lái)透析和濃縮 階段D中收集的具有溶膠原活性的級(jí)分； 階段F :在6. 9和7. 4之間的pH下，優(yōu)選在7. 1的pH下，通過(guò)攜帶強(qiáng)堿性基團(tuán)的陰離 子交換樹脂來(lái)純化這樣獲得的溶液； 階段G :通過(guò)用10-50kD MWCO盒，優(yōu)選用30kD MWCO盒，進(jìn)行切向流超濾來(lái)滲濾和濃縮 源自階段F的具有> 95%的溶膠原活性的級(jí)分； 階段H :通過(guò)0. 2 y m絕對(duì)過(guò)濾器過(guò)濾這樣獲得的含有膠原酶的溶液，并保存在-20°C 和-80°C之間的溫度下。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基具有豬動(dòng)物來(lái)源，或是豬和植物來(lái)源的混合物。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中攜帶弱堿性基團(tuán)的陰離子交換樹脂攜帶二乙基氨基烷 基，優(yōu)選攜帶二乙基氨基乙基；攜帶強(qiáng)堿性基團(tuán)的陰離子交換樹脂攜帶季銨基團(tuán)。
4. 按照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)產(chǎn)生和純化的來(lái)自溶藻弧菌解毒化學(xué)變型的膠原酶，其 特征在于： 分子量為82Kda ; 比活在1000和1800nkat/mg之間； 純度在98. 0和100%之間； 缺乏微生物和蛋白質(zhì)污染物； 在5. 5和11之間的pH下穩(wěn)定； 在4°C和40°C之間的T下在水溶液中穩(wěn)定，尤其是在37°C下穩(wěn)定； 在4 C下在水溶液中穩(wěn)定30天； 在-20°C和_80°C之間的T下在水溶液中穩(wěn)定24-48個(gè)月； 獲得穩(wěn)定親液粉末的親液性。
5. 權(quán)利要求4的膠原酶，其在pH 7. 1下在包含25mM TRIS-HC1和10mM CaCl 2的水溶 液中穩(wěn)定。
6. 權(quán)利要求4或5的膠原酶，其處于具有7-20nkat/mg粉末范圍內(nèi)的酶活性的穩(wěn)定親 液粉末的形式，其包含： -麥芽糖：95-96%，優(yōu)選 95. 75% ; -鹽：1. 0-1. 5%，優(yōu)選 1.3% ; -膠原酶：2. 5-3. 5%，優(yōu)選 2. 95%。
7. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的膠原酶，其用于治療不同程度的燒傷、褥瘡、燙傷、多種來(lái) 源的皮膚潰瘍、血管性和糖尿病性潰瘍、蜂窩織炎、手術(shù)后粘連、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩。
8. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的膠原酶，其用于治療粘連性囊炎、掌攣縮病和陰莖纖維性 海綿體炎。
9. 用于局部用途的藥物組合物，其處于撲粉的形式，其包含： 權(quán)利要求4或6中的膠原酶，其量在等同于2和8nkat/g成品之間，優(yōu)選量為5nkat/g 成品； 羥乙酸玉米淀粉，其量為達(dá)到百分比組成所需的量； 可選地，重量平均分子量在130和230kDa之間，優(yōu)選145和210kDa之間、甚至更優(yōu)選 160和200kDa之間的透明質(zhì)酸，其量在0. 1和5%之間，優(yōu)選量在0. 2和2%之間； 可選地，膠態(tài)二氧化硅，其量在0. 1和3%之間，優(yōu)選量在0.2和1%之間。
10. 可注射藥物組合物，其每個(gè)單位劑量包含： 凍干形式的權(quán)利要求4或6中的膠原酶，其量為等同于120和450nkat之間的活性的 量； 無(wú)菌鹽溶液； 可選地，重量平均分子量在750和1200kDa之間的透明質(zhì)酸，其濃度為1和30mg/ml鹽 溶液之間，優(yōu)選濃度為8和20mg/ml之間、甚至更優(yōu)選濃度為10和15mg/ml之間。
11. 權(quán)利要求9的藥物組合物，其用于不同程度的燒傷、燙傷、褥瘡、血管性和糖尿病性 潰瘍、蜂窩織炎、手術(shù)后粘連、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩的外部和/或局部治療。
12. 權(quán)利要求10的藥物組合物，其用于治療粘連性囊炎、掌攣縮病和陰莖纖維性海綿 體炎。
【文檔編號(hào)】A61K38/48GK104508127SQ201380020103
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】S·瓦卡羅, M·卡普托, C·庫(kù)帕里, G·蓋恩納里 申請(qǐng)人:菲迪亞制藥股份公司