專利名稱：一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株、相關(guān)制劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒突變株技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及魚用細(xì)菌性減毒活疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株、相關(guān)制劑及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的不斷增長及人類對海產(chǎn)品需求的持續(xù)增強(qiáng)與天然漁業(yè)資源的日益枯竭這對矛盾的日益突出，水產(chǎn)養(yǎng)殖作為一種傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，在近代得到了快速，有效的發(fā)展，并在社會、經(jīng)濟(jì)和人們生活中突現(xiàn)出其重要地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2002年我國水產(chǎn)品總量占全球總產(chǎn)量的71%和總產(chǎn)值的49. 8%，居世界第一位。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，2009年我國的水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)5120萬噸，同比增長4. 5%左右，其中，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量3635萬噸。水產(chǎn)品總量連續(xù)20年位居世界第一位，連續(xù)7年成為世界第一水產(chǎn)品出口國。但是，由于水土資源的有限性，從提高養(yǎng)殖面積來增加產(chǎn)量難以實(shí)現(xiàn)持續(xù)發(fā)展。因此，規(guī)模化、集約化、高密度養(yǎng)殖模式已成為我國魚類養(yǎng)殖業(yè)的主要發(fā)展方向。然而，伴隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的穩(wěn)步發(fā)展，隨之而來的便是各種水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題。在我國，近幾年發(fā)展起來的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖魚類的突發(fā)性、爆發(fā)性疾病頻繁發(fā)生。目前，我國的海水養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)160億元，病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。為了防治各種病害的發(fā)生，以抗生素為代表的化學(xué)療法曾發(fā)揮了積極作用。但是， 由于盲目投藥，過量用藥，不但污染了水質(zhì)，增強(qiáng)了病原體的抗藥性，提高了養(yǎng)殖成本，還直接危害到人類健康。在歐盟、美國和加拿大，以抗生素為主的化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已逐漸被禁用。其中，根據(jù)歐盟食品安全白皮書的規(guī)定，歐盟國家禁止使用抗生素藥物的養(yǎng)殖水產(chǎn)品進(jìn)入貿(mào)易市場。日本也開始限制使用多種抗生素藥物用于養(yǎng)殖魚類和蝦類病害的防治。2002-2006年，我國水產(chǎn)品及制品出口保持了年均14. 8%的增速。但是自2007年以來，由于國內(nèi)漁業(yè)生產(chǎn)成本上升、質(zhì)量安全問題受到關(guān)注，以及日美歐等主要進(jìn)口市場提高了進(jìn)口的技術(shù)門檻，導(dǎo)致我水產(chǎn)品出口頻頻受阻。2008年中國水產(chǎn)品出口量為四6. 5萬噸，同比下降3.2%，水產(chǎn)品出口量只占國內(nèi)生產(chǎn)量6. 1%。一個(gè)主要的制約因素就是我國的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題突出，藥物和有害物殘留超標(biāo)嚴(yán)重，對中國水產(chǎn)品質(zhì)量信用造成嚴(yán)重的負(fù)面影響，成為擴(kuò)大出口的主要障礙。同時(shí)，由于病害嚴(yán)重，突發(fā)性強(qiáng)，為規(guī)避病害風(fēng)險(xiǎn)，生產(chǎn)者普遍提早收獲，造成產(chǎn)品規(guī)格偏小，也影響了出口率和出口價(jià)格。為了增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的國際市場競爭力，擴(kuò)大水產(chǎn)養(yǎng)殖的出口創(chuàng)匯，國家已提出并開始推廣建立無公害養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范，其中一個(gè)主要技術(shù)指標(biāo)就是禁止使用抗生素藥物，以確保養(yǎng)殖水產(chǎn)品的食品質(zhì)量安全。為了實(shí)現(xiàn)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的養(yǎng)殖魚類病害日益嚴(yán)重的發(fā)展趨勢，世界糧農(nóng)組織結(jié)合發(fā)達(dá)國家漁業(yè)發(fā)展的成功經(jīng)驗(yàn) (Ormonde P.Fisheries resources :trends in production, utilization and trade.
3In :Nomura I (ed.). The State of World Fishery and Agriculture2002. Rome :FA0 Information Division, 2002, p3 p45), fi ^ ^ f= S it (System management approaches, SMA)養(yǎng)殖模式預(yù)防各種病害的發(fā)生。這一措施中的一個(gè)主要內(nèi)容就是提倡以疫苗接種為代表的各種免疫防治技術(shù)的應(yīng)用。這些措施的采用將大大減少化學(xué)藥物的使用，既避免了對環(huán)境的污染，又增加了水產(chǎn)品的消費(fèi)安全性。作為符合環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的經(jīng)濟(jì)有效的疾病控制策略和手段，接種疫苗在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范中正成為世界各國研究和開發(fā)的主要前沿和應(yīng)用領(lǐng)域。目前，接種疫苗因其安全性，可靠性和持久性，已成為世界范圍內(nèi)防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)生及暴發(fā)的主要手段。疫苗具有針對性強(qiáng)、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治主動的特點(diǎn)。以病原菌細(xì)胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗(Kill vaccine)為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護(hù)力)的技術(shù)應(yīng)用缺陷，對于需要免疫成千上萬數(shù)量的魚類養(yǎng)殖業(yè)來說極為不便，給藥成本往往不能被水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所承受。而且，對于病害發(fā)生嚴(yán)重的魚苗和幼魚則無法實(shí)施注射給藥，同時(shí)，對許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無效。這一切都給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來了阻礙。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)要求病害防治技術(shù)必須經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用實(shí)施方便。因此，疫苗產(chǎn)品的開發(fā)除高效價(jià)的技術(shù)要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養(yǎng)殖業(yè)的承受能力。減毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價(jià)高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發(fā)廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護(hù)性)的新技術(shù)優(yōu)勢，已成為當(dāng)前國際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開發(fā)的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域?；【且鸷ＫB(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病危害的一種重要的病原體，可導(dǎo)致魚類弧菌病(Vibriosis)，具有地域廣，周期長，發(fā)生溫度范圍大等特點(diǎn)，且危害種類多，包括鲆類， 鰈類，鱸科等多種海洋魚類。目前，我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中危害比較嚴(yán)重的病原菌主要為溶藻弧菌(Vibrio algnolyticus)，鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。其中溶藻弧菌是我國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類弧菌病爆發(fā)的主要病原體， 危害的魚類主要有石斑魚和大黃魚等；而鰻弧菌則為北方水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類弧菌病的主要病原體，危害的魚類包括牙鲆，大菱鲆，真鯛和鱸魚等名貴經(jīng)濟(jì)魚種。目前弧菌病在我國尚無有效的防治方法。溶藻弧菌廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數(shù)量位居海水類弧菌之首，也是我國南方海水養(yǎng)殖中魚，蝦，貝類等海水養(yǎng)殖動物弧菌病暴發(fā)的主要病原菌，導(dǎo)致被感染魚體表發(fā)白，感染部位，尾部及鰭末端充血，發(fā)炎，嚴(yán)重時(shí)感染部位潰爛，并能引起內(nèi)臟器官充血腫大，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。值得注意的是溶藻弧菌還會對人類帶來威脅，可以引發(fā)創(chuàng)傷面感染，腹瀉以及中耳炎等。目前對于溶藻弧菌的致病機(jī)理研究尚處于探索階段，已鑒定的毒力相關(guān)因子包括胞外蛋白酶類、脂多糖、鞭毛和鐵攝取相關(guān)系統(tǒng)等。目前國內(nèi)用專利報(bào)道利用病原菌外膜蛋白及抗菌肽構(gòu)建的亞單位疫苗對多種弧菌具有防治作用(吳灶和，龐歡瑛，姚紹云，簡紀(jì)常，2007,海水魚致病弧菌外膜蛋白亞單位疫苗的制備和使用方法；中國專利200610124342. X)。但由于亞單位疫苗不具有感染性，只能采取注射給藥的方式進(jìn)行免疫，而不能通過浸泡的方式給藥，操作不便。且由于其只具有病原體的一種或幾種抗原，而不含有病原體的其他抗原和遺傳信息，僅利用單一的抗原分子誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，免疫效果不及活疫苗。此外，亞單位疫苗需要輔以佐劑，免疫劑量及成本相對較高，效果較差?；驘o標(biāo)記缺失減毒疫苗構(gòu)建技術(shù)是目前國際上新興起的活疫苗開發(fā)領(lǐng)域，是疫苗開發(fā)的國際前沿領(lǐng)域與主要發(fā)展方向之一，所開發(fā)的疫苗家具有可靠的產(chǎn)品和環(huán)境安全性。并且構(gòu)建的減毒株具有表達(dá)異源抗原以開發(fā)多效價(jià)疫苗(特別是針對病毒病害)的潛在價(jià)值，也成為疫苗開發(fā)的國際前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的溶藻弧菌野生毒株EPGS020401從我國福建省廈門養(yǎng)殖漁場內(nèi)爆發(fā)的弧菌病的病魚體內(nèi)分離得到，是一種毒性的溶藻弧菌菌株，于2009年10月M日保藏于中國武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO =AB 209306。在利用Tn5轉(zhuǎn)座子構(gòu)建含有約12000個(gè)突變株的溶藻弧菌突變體文庫中Oliyao Wang et al. Isolation, sequencing and characterization of cluster genes involved in the biosynthesis and transportation of the siderophore ofmarine fish pathogen Vibrio alginolyticus. Arch Microbiol. 2007,188 :433-439)，用 CAS平板檢測限鐵環(huán)境下鐵載體產(chǎn)量變化時(shí)篩選到一株鐵載體產(chǎn)量明顯下降的插入失活菌株，經(jīng)過測序及比對鑒定插入部位為sRNA分子伴侶蛋白Hfq，其編碼基因即hfq基因大小為^4bp。sRNA是一類長度在40-400個(gè)核苷酸，廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物等不同生物體內(nèi)，執(zhí)行多種生物學(xué)功能的非編碼RNA分子。同真核生物一樣，原核生物中的sRNA絕大多數(shù)也是通過與靶標(biāo)mRNA 配對來影響其穩(wěn)定性或翻譯，進(jìn)而對細(xì)胞的各種生理功能進(jìn)行調(diào)控。Hfq蛋白作為sRNA的伴侶分子，通過改變sRNA分子和/或靶標(biāo)mRNA分子的構(gòu)象折疊而促進(jìn)兩者之間的配對。 Hfq廣泛存在于真核生物和原核生物體內(nèi)，具有較高的保守性，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子， 協(xié)同sRNA分子通過堿基配對的方式與多種靶標(biāo)mRNA進(jìn)行結(jié)合，影響其穩(wěn)定性或翻譯，對于生物的多種生理功能具有重要的調(diào)控作用(Fantappie—L. et al. The RNA chaperone Hfqis involved in stress response and virulence in Neisseria meningitidis and is a pleiotropic regulator of protein expression. Infect Immun,2009,77 :1842—1853 ; Sittka et al. The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol,2007,63 :193-217.2007)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株、相關(guān)制劑及應(yīng)用，該減毒突變株或相關(guān)制劑消除了傳統(tǒng)減毒活疫苗普遍存在的潛在環(huán)境和產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)，是針對養(yǎng)殖魚類的溶藻弧菌病的一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的疫苗。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株，其特點(diǎn)是，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侶蛋白基因hfq。因此，減毒突變株不攜帶任何抗生素抗性標(biāo)記和其它標(biāo)記，無任何外源性基因片段。所述溶藻弧菌毒株可以是任何合適的溶藻弧菌毒株。較佳地，所述溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC NO =AB 209306。在本發(fā)明中，減毒疫苗株培養(yǎng)的培養(yǎng)基可選用LB培養(yǎng)基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨，胰蛋白胨或大豆蛋白胨，補(bǔ)加NaCl至3%，本發(fā)明的具體實(shí)施例選用了胰蛋白胨。在本發(fā)明的第二方面，還提供了一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑，其特點(diǎn)是，包括上述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株和在藥理上可接受的配體。所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的菌體細(xì)胞濃度可以任意。較佳地，所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的菌體細(xì)胞濃度為IO6 109CFU/ml。所述配體可以是任何合適的配套。較佳地，所述配體是無菌生理鹽水。其配方可以是NaC19g/L，pH 為 7. 2。在本發(fā)明的第三方面，還提供了上述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或上述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑在防治養(yǎng)殖魚類的溶藻弧菌病中的應(yīng)用。所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或所述制劑可以采用任何合適的方式及合適的劑量給藥。較佳地，所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或所述制劑通過注射方式給藥，其中菌體細(xì)胞濃度為IO4 106CFU/ml。本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株缺失了 sRNA分子伴侶蛋白基因hfq，相對于其野生毒株EPGS020401具有明顯的低毒性，可有效地保護(hù)魚類免受溶藻弧菌病致病株溶藻弧菌的侵害，免疫效果顯著，具有非常好的水產(chǎn)養(yǎng)殖中溶藻弧菌病的防治效果；2、本發(fā)明的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株不攜帶任何抗生素抗性標(biāo)記和其它標(biāo)記，對環(huán)境不存在傳播抗生素抗性的潛在危險(xiǎn)；無任何外源性基因片段， 毒力相關(guān)基因大片段缺失，毒力不可回復(fù)，極大消除向環(huán)境傳播大量毒性病原體的可能性， 具有技術(shù)上的環(huán)境和產(chǎn)品安全性，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值；3、本發(fā)明的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的突變的遺傳背景清楚，減毒機(jī)理明確，易于區(qū)分疫苗株與野生株，便于對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，提高疫苗的環(huán)境安全性和可控性；4、本發(fā)明的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株為無標(biāo)記基因缺失減毒活疫苗的商業(yè)化進(jìn)程提供了現(xiàn)實(shí)的開發(fā)和應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明采用Overlap PCR方法擴(kuò)增獲得hfq基因缺失片段F1F2的流程圖。圖2是本發(fā)明利用圖1所示方法獲得的hfq基因缺失片段F1F2構(gòu)建自殺質(zhì)粒pDM4 并篩選獲得hfq基因缺失菌株流程圖。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。實(shí)施例1無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的構(gòu)建(一)hfq基因缺失菌株的構(gòu)建1)PCR擴(kuò)增獲得所需基因片段
如圖1所示，以溶藻弧菌毒株EPGS020401 (保藏號為CCTCC NO =AB 209306)的基因組為模版，利用下列擴(kuò)增引物Pl(TTAGTCGACCCGACAGATGTGGGAGTATTTAGAT)，P2 (TGTGGACGCTCGTCTTGTAGAGATTGCCCCTTAGCC)，P3 (CTCTACAAGACGAGCGTCCACAAGAGAAATCTGAAG)，P4 (GCTACTAGTGATATCGAGAATAAGACCAGTGCGG)，首先分別用Pl和P2、P3和P4擴(kuò)增獲得Overlap PCR所需的上下片段F1，F(xiàn)2?；厥崭髌魏?，利用Overlap PCR技術(shù)采用Pl和P4獲得hfq缺失片段F1F2。2)回收各片段從所要研究的對象上回收目標(biāo)基因片段，采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝入Eppendorf管并稱取重量，加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；將得到的溶液加入吸附柱中離心(12，OOOrpm離心30sec)， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μ1漂洗液PW， 12，OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，再用500 μ 1漂洗液PW12, OOOrpm離心30sec，倒掉廢液。 將離心吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm離心2min，盡量出去漂洗液，再將吸附柱置于室溫或50°C溫箱數(shù)分鐘，徹底地晾干后，將其放到一個(gè)干凈地離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加不少于30 μ 1的洗脫緩沖液EB buffer,室溫放置2min，12，OOOrpm離心Imin收集含目的片段的DNA溶液，電泳檢測回收DNA濃度。3)構(gòu)建自殺工具質(zhì)粒將 pDM4 載體(Wang et al. A ToxR homo log from Vibrio angui llarum serotype 01 regulates its own production, bile resistance, and biofflm formation.J Bacteriol，2002，184 :1630-1639)多克隆位點(diǎn)的Sail位點(diǎn)和SpeI位點(diǎn)切開后，將目的片段F1F2與切割后的質(zhì)粒用T4DNA連接酶16°C連接過夜。CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化SM10，得到質(zhì)粒載體 pDM4hfq。4)接合將攜帶有pDM4hfq質(zhì)粒的SMlO按體積比3比1的比率與野生菌株EPGS020401混合離心，去除上清液，用50微升新鮮含NaCl的LB培養(yǎng)基重懸沉淀。將0. 22微米滅菌后的水性濾膜平整鋪放在新鮮半固體含1 % NaCl的LB培養(yǎng)基上，取出全部菌懸液點(diǎn)置于水性膜中央。30攝氏度培養(yǎng)12小時(shí)后，用0. 2M的MgCl2將水性膜上的菌落洗脫下，涂布于氯霉素，氨芐青霉素雙重抗性平板。5)正向篩選hfq基因插入失活克隆如圖2所示，自殺質(zhì)粒pDM4hfq插入到基因組上hfq基因中。利用氯霉素，氨芐青霉素雙重抗性平板篩選，及以P1/P4為引物的PCR擴(kuò)增可獲得hfq基因插入失活的克隆。6)篩選hfq基因缺失菌株如圖2所示，在20%蔗糖LB半固體培養(yǎng)基平板上，利用pDM4上McB基因可反向篩選獲得發(fā)生第二次同源重組的菌株。以引物Pl，P4通過PCR驗(yàn)證可獲得缺失突變菌株， 命名為hfq缺失突變株。( 二)減毒活疫苗制備
培養(yǎng)基與生理鹽水組成1)LB 斜面培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/ L，瓊脂 15g/L，ρΗ7· 5 ；2)種子培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L, NaCl 30g/ L,苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，對羥基苯甲酸20mg/L，對氨基苯甲酸 20mg/L, pH7.5 ；3)發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L, NaCl 30g/ L,苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，對羥基苯甲酸20mg/L，對氨基苯甲酸 20mg/L, pH6. 8 ；4)生理鹽水=NaCl 9g/L，ρΗ7· 2，121°C滅菌 20 分鐘。疫苗制備取一接種環(huán)保存于LB斜面培養(yǎng)基上的減毒疫苗株種子，接種于裝有 IOOml液體LB種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶，在30°C下振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘)。12小時(shí)后，取5ml生長旺盛的菌液(0. D = 4. 0左右)接種于IOOml新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng) 9小時(shí)。用無菌生理鹽水洗滌3次，離心收獲菌體(2000 X g，15分鐘，15°C )，無菌生理鹽水稀釋成一定濃度懸液(106-109CFU/ml)，保藏于15°C備用。實(shí)施例2 以斑馬魚(Danio rerio)為試驗(yàn)動物的半致死量LD5tl測定試驗(yàn)用魚先置于SPF(Specific Pathogen Free)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)養(yǎng)殖1周，以剔出不正常個(gè)體。在感染試驗(yàn)前，再將SPF試驗(yàn)用魚放養(yǎng)于感染實(shí)驗(yàn)室(Challenge Lab)中0. 5L 感染試驗(yàn)水槽，繼續(xù)喂養(yǎng)1周，每槽放養(yǎng)10條(平均體長2.5-3cm，體重0.2g)。試驗(yàn)水槽每天使用無菌陳水替換1/2體積養(yǎng)殖水，水溫，上下波動2V。將試驗(yàn)用魚隨機(jī)分組，每組2個(gè)水槽平行試驗(yàn)。在感染試驗(yàn)中，每組試驗(yàn)魚用一定梯度劑量(IO2-IO7CFU/尾)的溶藻弧菌野生毒株和減毒疫苗株通過尾部肌肉注射進(jìn)行人工感染。記錄10天內(nèi)，每組每個(gè)感染劑量下每天的死亡尾數(shù)，并計(jì)算累計(jì)死亡率，測定LD5tl 值，取三組試驗(yàn)的平均值(見表1)。表1溶藻弧菌毒株EPGS020401和減毒株對斑馬魚的LD5tl
權(quán)利要求
1.一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株，其特征在于，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的SRNA分子伴侶蛋白基因hfq。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株，其特征在于，所述溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC NO =AB 209306。
3.一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1 2任一所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株和在藥理上可接受的配體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑，其特征在于，所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的菌體細(xì)胞濃度為IO6 109CFU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑，其特征在于，所述配體是無菌生理鹽水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 2任一所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑在防治養(yǎng)殖魚類的溶藻弧菌病中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或所述制劑通過注射方式給藥，其中菌體細(xì)胞濃度為IO4 106CFU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侶蛋白基因hfq，溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC NOAB 209306，還提供了上述溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑，及相關(guān)的在防治養(yǎng)殖魚類的溶藻弧菌病中應(yīng)用，本發(fā)明的溶藻弧菌野生毒株的無標(biāo)記基因缺失減毒突變株或相關(guān)制劑消除了傳統(tǒng)減毒活疫苗普遍存在的潛在環(huán)境和產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)，是針對養(yǎng)殖魚類的溶藻弧菌病的一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的疫苗。
文檔編號A61K39/106GK102296044SQ20111026645
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者劉歡, 劉琴, 張?jiān)d, 王啟要 申請人:華東理工大學(xué)