專利名稱：溶藻弧菌hsp70重組dna核酸疫苗的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術，涉及溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的構建方法。
背景技術：
病原體來源的HSP是一種非常重要的保護性抗原，免疫系統(tǒng)對這些高度保守的分子產生免疫應答。因此，細菌HSP70可以直接作為人工免疫用抗原，也可以和其他抗原多肽偶聯或融合構建疫苗。溶藻弧菌是海水養(yǎng)殖動物的常見致病菌。國內尚未見有關溶藻弧菌HSP70 引起免疫反應的研究報道，本發(fā)明運用PCR技術克隆了溶藻弧菌HSP70基因序列，并將其正確插入到真核表達載體pcDNA3. 1中，構建了重組DNA核酸疫苗，為進一步研究該基因的免疫原性及免疫保護性打下了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種構建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法，利用其他弧菌已知序列設計引物，PCR擴增HSP70的ORF部分序列，再進行TA克隆和序列測定，然后進行 pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構建并鑒定了構建的成功；其步驟如下
(1)Primer Premier 5. 0 軟件設計引物
Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'； P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；
PCR擴增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應參數94 °C預變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產物；
(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3:1的體積比連接。連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應30分鐘，需要時放入4°C冰箱保存。連接產物轉化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質粒DNA。PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I IyL;質粒 DNA 8yL。37°C7jC 浴 2小時。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結果。(3)分別用EcoR I和Xhol I雙酶切真核表達載體pcDNA3. 1和TA克隆質粒，均在酶切體系中進行。37°C水浴3小時后凝膠電泳回收。將酶切的質粒用一個柱子回收，如果膠太大無法裝入一個離心管，可以分兩個管化膠，但是離心時一定要將兩管的膠加到一個柱子上?；厥諘r一定要將酒精揮發(fā)干凈，否則影響連接效率。最后用30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量。跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul中有多少ng的產物。 回收后的產物應迅速放入_20°C保存。酶切體系為40ul質粒加入6ul的10 X H Buffer, 4ulEC0Rl，4ulXhol，再加入 6ul 的水。(4) 1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質粒提取試劑盒切膠回收酶切后的pcDNA3. 1片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個20ul的連接體系，體系中包含2ul m T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補齊20ul，15°C 過夜連接。轉化DH5ci大腸埃希菌，挑單個菌落。(5) PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質粒，按照上述方法用EcoR I和 Xhol I酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構建成功。應用實例
以本發(fā)明所構建的溶藻弧菌HSP70重組質粒利用陽性脂質體法將其轉染至CHO細胞 18-48小時后，對抗原蛋白表達情況進行免疫熒光檢測，結果溶藻弧菌HSP70重組質粒在寄主細胞中檢測到靶抗原的表達。本發(fā)明的優(yōu)點該方法為HSP70免疫原性研究及相關融合疫苗的構建提供依據， 相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關HSP70新疫苗的進展， 并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
具體實施例方式
本發(fā)明是一種構建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法，利用其他弧菌已知序列設計引物，PCR擴增HSP70的ORF部分序列，再進行TA克隆和序列測定，然后進行pcDNA3. 1 重組DNA核酸疫苗的構建并鑒定構建的成功；其步驟如下
(1)Primer Premier 5. O 軟件設計引物
Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'； P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；
PCR擴增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應參數94 °C預變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產物；
(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3:1的體積比連接。連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應30分鐘，需要時放入4°C冰箱保存。連接產物轉化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質粒DNA。PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I IyL;質粒 DNA 8yL。37°C7jC 浴 2小時。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結果。(3)分別用EcoR I和Xhol I雙酶切真核表達載體pcDNA3. 1和TA克隆質粒，均在酶切體系中進行。37°C水浴3小時后凝膠電泳回收。將酶切的質粒用一個柱子回收，如果膠太大無法裝入一個離心管，可以分兩個管化膠，但是離心時一定要將兩管的膠加到一個柱子上?；厥諘r一定要將酒精揮發(fā)干凈，否則影響連接效率。最后用30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量。跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul中有多少ng的產物。 回收后的產物應迅速放入_20°C保存。酶切體系為40ul質粒加入6ul的10 X H Buffer, 4ulEC0Rl，4ulXhol，再加入 6ul 的水。CN 102406948 A
說明書
3/3頁(4) 1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質粒提取試劑盒切膠回收酶切后的PCDNA3. 1 片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個20ul的連接體系，體系中包含2ul m T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補齊20ul，15°C 過夜連接。轉化DH5ci大腸埃希菌，挑單個菌落。(5) PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質粒，按照上述方法用EcoR I和 Xhol I酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構建成功。應用實例
以本發(fā)明所構建的溶藻弧菌HSP70重組質粒利用陽性脂質體法將其轉染至CHO細胞 18-48小時后，對抗原蛋白表達情況進行免疫熒光檢測，結果溶藻弧菌HSP70重組質粒在寄主細胞中檢測到靶抗原的表達。本發(fā)明的優(yōu)點該方法為HSP70免疫原性研究及相關融合疫苗的構建提供依據， 相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關HSP70新疫苗的進展， 并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
權利要求
1. 一種溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的構建方法，其特征是利用其他弧菌已知序列設計引物，PCR擴增HSP70的ORF部分序列，再進行TA克隆和序列測定，然后進行 pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構建并鑒定構建的成功；其步驟如下(1)PrimerPremier 5. 0 軟件設計引物Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'；P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；PCR擴增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應參數94 °C預變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產物；(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3 1的體積比連接；連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應30分鐘，需要時放入4 °C冰箱保存；連接產物轉化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質粒DNA ；PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I 1 μ L;質粒 DNA 8 μ L ;37°C7jC浴 2 小時；1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結果；(3)分別用EcoRI和Biol I雙酶切真核表達載體pcDNA3. 1和TA克隆質粒，均在酶切體系中進行；37°C水浴3小時后凝膠電泳回收；將酶切的質粒用一個柱子回收；最后用 30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量；跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul 中有多少ng的產物；回收后的產物應迅速放入_20°C保存；酶切體系為在40ul質粒加入 6ul 的 10 X H Buffer，4ulEC0Rl, 4ulXhol，再加入 6ul 的水；(4)1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質粒提取試劑盒切膠回收酶切后的pcDNA3. 1片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個20ul的連接體系，體系中包含2ul的 T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補齊20ul，15°C過夜連接；轉化DH5 α大腸埃希菌，挑單個菌落；(5)PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質粒，按照上述方法用EcoR I和B10I I 酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構建成功。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種構建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法。利用其他弧菌已知序列設計引物，PCR擴增了溶藻弧菌HSP70ORF部分序列，首先進行TA克隆和序列測定，然后進行pcDNA3.1重組DNA核酸疫苗的構建，通過PCR、酶切及序列分析鑒定構建的成功。本發(fā)明的優(yōu)點:該方法為HSP70免疫原性研究及相關融合疫苗的構建提供依據，相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關HSP70新疫苗的進展，并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
文檔編號A61K39/106GK102406948SQ20111039845
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權日2011年12月5日
發(fā)明者萬文菊, 于愛蓮, 張忠, 楊春貴, 王紀亭, 高紅莉 申請人:泰山醫(yī)學院