專利名稱：一種可同步實(shí)現(xiàn)吸吮加載與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微管吸吮力學(xué)加載和顯微熒光觀測(cè)相結(jié)合的細(xì)胞力學(xué)裝置。
背景技術(shù)：
人體始終處于力學(xué)環(huán)境之中，其生物學(xué)過程受到不同力學(xué)環(huán)境的調(diào)控，表現(xiàn)為多因素、非線性、交互作用等基本特征，需要在微觀層次定量認(rèn)識(shí)其耦合規(guī)律。細(xì)胞不僅處在復(fù)雜的生物化學(xué)環(huán)境中，也處在不同的生物力學(xué)環(huán)境中；細(xì)胞力學(xué)可闡明細(xì)胞如何感受、修飾、并對(duì)細(xì)胞環(huán)境的物理特性做出響應(yīng)；細(xì)胞之間通過化學(xué)和物理信號(hào)實(shí)現(xiàn)信息交換，從而參與胚胎發(fā)生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列的生物過程；細(xì)胞對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和許多疾病中至關(guān)重要。細(xì)胞力學(xué)-生物學(xué)耦合研究不僅可定量認(rèn)識(shí)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-表面相互作用的基本規(guī)律，同時(shí)還是組織工程、再生醫(yī)學(xué)、介入治療等的重要科學(xué)基礎(chǔ)。因此，在生物大分子相互作用、亞細(xì)胞動(dòng)力學(xué)過程、細(xì)胞整體生命活動(dòng)及其調(diào)控規(guī)律等方面開展定量化和模型化研究，可為認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象、保障人類健康提供新概念和新方法。目前，分子-細(xì)胞生物力學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展瓶頸在于有關(guān)力學(xué)信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架和胞內(nèi)信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)變化、以及蛋白質(zhì)相互作用與組裝過程的動(dòng)力學(xué)行為等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)十分缺乏，因而難以對(duì)力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞動(dòng)態(tài)響應(yīng)、生物大分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及力學(xué)-化學(xué)耦合等規(guī)律進(jìn)行統(tǒng)一描述。目前分子-細(xì)胞層面力學(xué)-化學(xué)、力學(xué)-生物學(xué)耦合研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要分為兩方大類:力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)(力譜)技術(shù)和熒光檢測(cè)(熒光譜)技術(shù)。力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)技術(shù):對(duì)細(xì)胞或分子施加力學(xué)作用是針對(duì)細(xì)胞或分子所處的生理力學(xué)環(huán)境進(jìn)行模擬，無法實(shí)現(xiàn)力學(xué)刺激下活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)行為(遷移、增殖、分化等)和活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架、離子和分子活動(dòng)和變化的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，并且由于細(xì)胞培養(yǎng)、探針標(biāo)記和力學(xué)加載不能原位進(jìn)行，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果難以定量、時(shí)-空耦合難以實(shí)現(xiàn)?；诜肿庸鈱W(xué)標(biāo)記的熒光檢測(cè)分析成像技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)分子或細(xì)胞的力學(xué)加載、也難以觀測(cè)分子-細(xì)胞的力學(xué)-化學(xué)、力學(xué)生物學(xué)耦合過程。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)微管吸吮加載與熒光觀測(cè)相結(jié)合的可同步實(shí)現(xiàn)吸吮加載與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的拉/壓力學(xué)加載以及熒光觀測(cè)之間的同步化。本發(fā)明的一種可同步實(shí)現(xiàn)吸吮加載與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置包括:微管吸吮模塊，用于對(duì)樣品池內(nèi)細(xì)胞的捕獲、吸吮和微操控；倒置熒光相差顯微鏡，用于對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)；信號(hào)采集模塊，用于對(duì)微弱熒光信號(hào)的采集；控制模塊，用于對(duì)微管吸吮和熒光采集的同步觸發(fā)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

優(yōu)選地，所述微管吸吮模塊包括:
微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔，用于保持生物樣品的活性，便于顯微操控器對(duì)生物樣品(細(xì)胞)的捕獲；顯微操控單元，用于對(duì)微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔中的樣品進(jìn)行精確的捕獲和移動(dòng)；壓力控制單元，用于給予顯微操控單元夾持的微吸吮管一定的負(fù)壓，將生物樣品以負(fù)壓吸附的方式固定在微吸吮管頂端。優(yōu)選地，所述倒置熒光相差顯微鏡包括:倒置相差顯微鏡體、顯微鏡聚光器支柱、激發(fā)光源和濾鏡光學(xué)組件。優(yōu)選地，所述顯微操控單元安裝于所述顯微鏡聚光器支柱上，所述顯微操控單元包括:粗調(diào)顯微操作器、細(xì)調(diào)顯微操作器、吸吮表征有目標(biāo)分子的細(xì)胞或小球的微管、控制微管運(yùn)動(dòng)的壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器(用于施加一定的電場使壓電介質(zhì)發(fā)生形變而帶動(dòng)微管運(yùn)動(dòng))。優(yōu)選地，所述壓力控制單元包括:調(diào)控所述微管管口與貯水瓶間水位差的運(yùn)動(dòng)部件、量化水位差的數(shù)碼顯示器。優(yōu)選地，所述信息采集模塊為EMCXD (電子倍增電荷耦合器件)。優(yōu)選地，所述控制模塊包括:控制計(jì)算機(jī)，用于安裝用戶編寫的控制軟件，通過觸發(fā)器對(duì)壓電陶瓷控制器、EMCXD、濾鏡光學(xué)組件的運(yùn)動(dòng)和開關(guān)進(jìn)行控制；觸發(fā)器，用于接受控制計(jì)算機(jī)發(fā)出的數(shù)字控制信號(hào)，將其轉(zhuǎn)為模擬電平信號(hào)，用于對(duì)壓電陶瓷控制器、EMCXD、濾鏡光學(xué)組件的運(yùn)動(dòng)和開關(guān)的同步觸發(fā)；
`
圖像重建和數(shù)據(jù)分析單元，用于對(duì)EMC⑶獲得的圖像行數(shù)據(jù)分析和處理，獲得圖像各部分的量化信息(比如:熒光強(qiáng)度、面積等)和圖像的時(shí)間序列重建和三維重建信息。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):I)本發(fā)明突破現(xiàn)有細(xì)胞-分子生物力學(xué)研究中力學(xué)加載與光學(xué)檢測(cè)方法之時(shí)間-空間分離的局限，建立微管吸吮力學(xué)加載-熒光觀測(cè)耦合的分子-細(xì)胞動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)原位觀測(cè)系統(tǒng)，完善活細(xì)胞與分子力學(xué)行為的研究平臺(tái)，為深入理解分子-細(xì)胞層面力學(xué)-化學(xué)、力學(xué)-生物學(xué)耦合規(guī)律服務(wù)；2)本發(fā)明在倒置熒光相差顯微鏡上，通過選取特殊的濾片組合對(duì)位于樣品平面的細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)，通過微管吸吮模塊對(duì)細(xì)胞施加吸吮/擠壓加載，通過控制模塊使力學(xué)刺激和熒光激發(fā)同步進(jìn)行，采用EMCCD對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采樣，采用圖像重建和數(shù)據(jù)分析單元對(duì)圖像進(jìn)行重建和數(shù)據(jù)分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的微管吸吮力學(xué)加載和熒光觀測(cè)相結(jié)合。


圖1為本發(fā)明的原理框圖；圖2為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3a為微管吸吮模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3b為微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔模式圖；圖3c為微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔內(nèi)細(xì)胞被捕獲的示意圖。圖4為觸發(fā)器運(yùn)控示意圖。
具體實(shí)施例方式如圖1、2、3所示，本發(fā)明一種可實(shí)現(xiàn)吸吮與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置由倒置熒光相差顯微鏡100、微管吸吮模塊101、信號(hào)采集模塊102和控制模塊103組成。倒置熒光相差顯微鏡100包括顯微鏡體1、激發(fā)濾鏡2、激發(fā)光源3、發(fā)射濾鏡4、物鏡5和載物臺(tái)6。本實(shí)施例中顯微鏡體I采用Olympus 1X71倒置顯微鏡，工作鏡頭為100倍的油鏡(NA1.30)。本實(shí)施例中樣品細(xì)胞采用CFP (Cyan Fluorescence Protein,青色突光蛋白)(433/475nm激發(fā)/發(fā)射)進(jìn)行標(biāo)記；激發(fā)光源3采用汞燈(100W)，在汞燈前方放置帶通的激發(fā)濾鏡4(420/20nm)，允許波長在410-430nm范圍的光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)光經(jīng)過顯微鏡的外熒光通路耦合進(jìn)顯微鏡，通過物鏡5照射到載物臺(tái)上的平行平板流動(dòng)腔7 (圖1，圖2)。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞所標(biāo)記的CFP被激發(fā)，發(fā)射的熒光通過物鏡收集，經(jīng)過顯微鏡光路傳輸，經(jīng)發(fā)射濾鏡5 (475/40nm)濾波，被信號(hào)采集模塊102 (EMCCD)接收。本實(shí)施例中采用EMCXD前方放置帶通濾光片4 (475/40nm),只允許波長在455_495nm的激發(fā)光進(jìn)入EMCXD，提高了系統(tǒng)的性噪比。微管吸吮模塊101包括微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔7、顯微操控單元104和壓力控制單元105。本實(shí)施例中顯微操控單元104包括顯微操作器12、微管14和壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器，顯微操作器12采用機(jī)械調(diào)節(jié)的粗調(diào)顯微操作器(MMN-1, Narishige, Japan)和油壓驅(qū)動(dòng)的細(xì)調(diào)顯微操作器(MM0-20, Narishige, Japan)組成左、右顯微操作手安裝于顯微鏡聚光器支柱上，在油壓細(xì)調(diào)顯微操作器上配有夾針器連著一個(gè)壓電陶瓷傳感器12 (PI，Germany),由計(jì)算機(jī)11精確控制壓電陶瓷控制器使得壓電晶體帶動(dòng)連在上面的微管14運(yùn)動(dòng)。本實(shí)施例中的微吸吮管為外徑1mm、內(nèi)徑0.7mm的硼酸鹽玻璃管，通過拉針器和微鑄造儀(Narishige，Japan)制備而成。通過調(diào)節(jié)拉針器和微鑄造儀的參數(shù)，可以得到不同內(nèi)徑(2 6μπι)、不同管口形狀(開口與閉口 ；端部垂直與管軸、無尖刺)的微吸吮管12，以用來吸吮、或施壓于不同大小的細(xì)胞。壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)采用合適強(qiáng)度的橡膠管將微管14和貯水瓶16連通起來，通過精確調(diào)節(jié)控制貯水瓶16高度的數(shù)碼高度尺15來改變微管吸吮細(xì)胞的壓力。微管吸吮系統(tǒng)不僅可以通過控制貯水瓶16高度來給被吸吮細(xì)胞施加一定的壓力，而且還可在負(fù)壓捕獲的情況下，通過顯微操作器操控細(xì)胞與樣品池底面接觸，從而給細(xì)胞施加一定的壓力。微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔( 圖3b)由兩塊干凈的蓋玻片和一個(gè)中間開口的不銹鋼架子組成。將兩片蓋玻片對(duì)齊后，一上一下分別貼于不銹鋼架子的開口處，從而形成一個(gè)腔室。微管14可以從腔體的兩側(cè)開口處進(jìn)入，并進(jìn)行顯微操作和實(shí)時(shí)圖像采集。本實(shí)施例中，將采用青色熒光蛋白CFP標(biāo)記的細(xì)胞(如HL-60細(xì)胞)加入微管實(shí)驗(yàn)腔。實(shí)驗(yàn)腔中的工作緩沖液由雙蒸水和含Ca2+、Mg2+的Hanks平衡鹽溶液等比例組成，并加入了 1%的牛血清白蛋白，滲透壓約為150m0sm/kg。利用壓力系統(tǒng)調(diào)節(jié)微管零壓后，給予微管一定的負(fù)壓(0.1 15_ H20)用于吸住HL-60細(xì)胞，通過顯微操作器精確聚焦后，由計(jì)算機(jī)11給觸發(fā)器10觸發(fā)信號(hào)，壓電晶體13帶動(dòng)微管14運(yùn)動(dòng)使被吸吮的細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)腔底面擠壓而給細(xì)胞施加一定的壓力(圖3c)。同時(shí)，觸發(fā)信號(hào)同時(shí)觸發(fā)顯微鏡的激發(fā)光源3、啟動(dòng)精密注射泵8、顯微鏡的激發(fā)光源3、濾鏡組(包括發(fā)射濾鏡2和激發(fā)濾鏡4)和信號(hào)采集模塊101在不同或相同的時(shí)序工作，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的吸吮力學(xué)加載與熒光觀測(cè)同步進(jìn)行，有利于觀測(cè)到細(xì)胞在被吸吮和擠壓過程的同步熒光信號(hào)的變化。實(shí)驗(yàn)圖像由信號(hào)采集模塊101采集，存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)11內(nèi)，采用圖像重建和數(shù)據(jù)分析單元進(jìn)行在線和離線的數(shù)據(jù)分析。
本實(shí)施例中觸發(fā)波形如圖4，壓電晶體控制器8和壓電晶體13工作后，濾鏡轉(zhuǎn)輪同時(shí)轉(zhuǎn)換到目的發(fā)射濾鏡2和激發(fā)濾鏡4，EMCCD在一個(gè)脈沖后觸發(fā)采集，曝光時(shí)間為I個(gè)脈沖長度，然后濾鏡組回轉(zhuǎn)，EMCCD停止工作，兩個(gè)脈沖后重復(fù)同樣采集過程。可控時(shí)序采集不僅能得到長時(shí)間的力學(xué) 加載下熒光實(shí)時(shí)信息，而且避免了連續(xù)采集數(shù)據(jù)量過大的缺點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種可同步實(shí)現(xiàn)吸吮加載與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置，其特征在于，包括: 微管吸吮模塊，用于對(duì)樣品池內(nèi)細(xì)胞的捕獲、吸吮和微操控； 倒置熒光相差顯微鏡，用于對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)； 信號(hào)采集模塊，用于對(duì)微弱熒光信號(hào)的采集； 控制模塊，用于對(duì)微管吸吮和熒光采集的同步觸發(fā)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述微管吸吮模塊包括: 微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔，用于保持生物樣品的活性，便于顯微操控器對(duì)生物樣品的捕獲； 顯微操控單元，用于對(duì)微管吸吮實(shí)驗(yàn)腔中的樣品進(jìn)行精確的捕獲和移動(dòng)； 壓力控制單元，用于給予顯微操控單元夾持的微吸吮管一定的負(fù)壓，將生物樣品以負(fù)壓吸附的方式固定在微吸吮管頂端。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述倒置熒光相差顯微鏡包括:倒置相差顯微鏡體、顯微鏡聚光器支柱、激發(fā)光源 和濾鏡光學(xué)組件。
4.如權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于，所述顯微操控單元安裝于所述顯微鏡聚光器支柱上，所述顯微操控單元包括:粗調(diào)顯微操作器、細(xì)調(diào)顯微操作器、吸吮表征有目標(biāo)分子的細(xì)胞或小球的微管、控制微管運(yùn)動(dòng)的壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器。
5.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述壓力控制單元包括:調(diào)控所述微管管口與貯水瓶間水位差的運(yùn)動(dòng)部件、量化水位差的數(shù)碼顯示器。
6.如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，所述信息采集模塊為EMCCD。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置其特征在于，所述控制模塊包括: 控制計(jì)算機(jī)，用于安裝用戶編寫的控制軟件，通過觸發(fā)器對(duì)壓電陶瓷控制器、EMCCD、濾鏡光學(xué)組件的運(yùn)動(dòng)和開關(guān)進(jìn)行控制； 觸發(fā)器，用于接受控制計(jì)算機(jī)發(fā)出的數(shù)字控制信號(hào)，將其轉(zhuǎn)為模擬電平信號(hào)，用于對(duì)壓電陶瓷控制器、EMCXD、濾鏡光學(xué)組件的運(yùn)動(dòng)和開關(guān)的同步觸發(fā)； 圖像重建和數(shù)據(jù)分析單元，用于對(duì)EMCCD獲得的圖像行數(shù)據(jù)分析和處理，獲得圖像各部分的量化信息和圖像的時(shí)間序列重建和三維重建信息。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可同步實(shí)現(xiàn)吸吮加載與熒光觀測(cè)的細(xì)胞力學(xué)裝置，包括微管吸吮模塊，用于對(duì)樣品池內(nèi)細(xì)胞的捕獲、吸吮和微操控；倒置熒光相差顯微鏡，用于對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)；信號(hào)采集模塊，用于對(duì)微弱熒光信號(hào)的采集；控制模塊，用于對(duì)微管吸吮和熒光采集的同步觸發(fā)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。本發(fā)明突破現(xiàn)有細(xì)胞-分子生物力學(xué)研究中力學(xué)加載與光學(xué)檢測(cè)方法之時(shí)間-空間分離的局限，建立微管吸吮力學(xué)加載-熒光觀測(cè)耦合的分子-細(xì)胞動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)原位觀測(cè)系統(tǒng)，完善活細(xì)胞與分子力學(xué)行為的研究平臺(tái)，為深入理解分子-細(xì)胞層面力學(xué)-化學(xué)、力學(xué)-生物學(xué)耦合規(guī)律服務(wù)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK103205360SQ20131011709
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者龍勉, 章燕, 高宇欣 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院力學(xué)研究所