專利名稱:用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物及試劑盒。
背景技術(shù):
鴨痕病毒(Duck Enteritis Virus)是引起鴨痕(Duck Plague)的病原,屬于一種皰疹病毒,能感染48種以上的雁形目的家禽和野生禽類。鴨瘟,又稱鴨病毒性腸炎,是一種急性傳染病,其發(fā)病率和病死率可達(dá)100%,鴨瘟的病變包括血管損傷,胃腸道粘膜的進(jìn)行性變化,淋巴器官病變和實(shí)質(zhì)性器官的退行性變化。接種鴨瘟弱毒疫苗是控制該病的有效方法。鴨瘟病毒能在三叉神經(jīng)節(jié)形成持續(xù)性感染。鴨瘟病毒的診斷方法有病毒中和試驗(yàn)(NT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和PCR試驗(yàn)等。NT、ELISA和普通的PCR方法只能診斷是否是鴨瘟病毒,但無法鑒別鴨瘟病毒是強(qiáng)毒株還是弱毒株。公開的發(fā)明專利“一種鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗毒的PCR檢測(cè)方法”(申請(qǐng)?zhí)?201210116719.2),通過UL2基因差異區(qū)分鴨瘟病毒強(qiáng)、弱毒株,但此方法僅能鑒別鴨瘟病毒是強(qiáng)毒還是弱毒,而無法鑒別鴨瘟病毒是歐洲源的強(qiáng)毒,還是中國源的強(qiáng)毒,也無法鑒別是中國的疫苗毒(弱毒)的VAC株或是Clone-03株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物,特異性強(qiáng),能夠鑒別樣品是否感染鴨瘟病毒;如果樣品感染鴨瘟病毒,究竟是歐洲強(qiáng)毒株、中國強(qiáng)毒株、中國疫苗株(弱毒株)VAC株還是中國疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本發(fā)明的另一目的是提供用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒,能夠鑒別樣品是否感染鴨瘟病毒;如果樣品感染鴨瘟病毒,究竟是歐洲強(qiáng)毒株、中國強(qiáng)毒株、中國疫苗株(弱毒株)VAC株還是中國疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本發(fā)明的再一目的是提供上述引物組合物的應(yīng)用。用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物,由上游引物和下游引物組成,所述上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。所述上游和下游引物的濃度為0.01mol/mlo用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒,包括所述引物組合物、PCR緩沖液、dNTPs和ExTaq酶。所述dNTPs 為 dATP、dTTP, dGTP 和 dCTP 的等濃度混合物,所述 dATP、dTTP, dGTP或dCTP的濃度均為2.5Mm。所述弓I物組合物在制備用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒中的應(yīng)用。一種應(yīng)用所述引物組合物鑒別鴨瘟病毒的方法:
(1)提取待檢樣品的DNA;
(2)以步驟(I)中所述DNA為模板,用權(quán)利要求1或2所述引物組合物為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),獲得PCR產(chǎn)物;(3 )將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,判斷所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為4430-4460bp時(shí),待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3260-3290bp時(shí),待檢樣品感染歐洲來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為920_950bp,待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒VAC株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為2510-2540bp,待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒Clone-03。所述中國來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株為鴨瘟病毒LH2011株和CHv株中的一種或兩種;所述歐洲來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株為鴨瘟病毒Jansen、Holland、Dll-JW-016和v2085株中的一種或兩種以上。步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30sec,52°C退火40sec,72°C延伸 3min40sec,循環(huán) 40 次;最后 72°C延伸 IOmin0本發(fā)明提供的引物組合物或試劑盒,能夠鑒別樣品是否感染了鴨瘟病毒;如果感染鴨瘟病毒,究竟是歐洲強(qiáng)毒株、中國強(qiáng)毒株、中國疫苗株(弱毒株)VAC株還是中國疫苗株(弱毒株)Clone-03株。采用本發(fā)明的引物組合物或試劑盒鑒別鴨瘟病毒,快速、簡(jiǎn)便,特異性和敏感性強(qiáng),而且成本低廉。適用于臨床診斷,科學(xué)研究,疫苗生產(chǎn)和出入境檢測(cè)等,應(yīng)用前景廣闊。
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圖1為不同毒株鴨瘟病毒的LORFll等位基因序列的比較。圖中Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株是歐洲鴨瘟強(qiáng)毒株,LH2011和CHv株是中國鴨瘟強(qiáng)毒株,VAC株和Clone-03株是中國疫苗株。該圖中,具有相同填充的條帶表示相同序列或者僅有個(gè)別堿基發(fā)生同義或非同義替代的序列;線條引出標(biāo)注了各段條帶的序列長(zhǎng)度。圖2為應(yīng)用本發(fā)明 試劑盒鑒別鴨瘟病毒毒株的電泳圖。圖中M:DNA Marker ;Lane1:以鴨瘟病毒v2085株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 2:以鴨瘟病毒LH2011株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 3:以鴨瘟病毒VAC株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 4:以鴨瘟病毒Clone-03株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 5為以雞胚成纖維細(xì)胞為模板的PCR產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明試劑盒特異性試驗(yàn)的電泳圖。圖中M:DNA Marker ; Lane 1:以鴨瘟病毒V2085株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 2:以鴨瘟病毒LH2011株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane3:以鴨瘟病毒VAC株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 4:以鴨瘟病毒Clone-03株為模板的PCR產(chǎn)物;Lane5-14:分別以鴨病毒性肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、禽流感病毒、鴨沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏菌、傳染性法氏囊病病毒、雞新城疫病毒和鴨坦布蘇病毒為模板的PCR產(chǎn)物。圖4本發(fā)明試劑盒對(duì)鴨瘟病毒LH2011株LD5tl敏感性試驗(yàn)的電泳圖;其中M-Marker,泳道1-9均為PCR產(chǎn)物,其DNA模板分別提取于:稀釋10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的組織提取物。圖5為本發(fā)明試劑盒對(duì)鴨瘟病毒VAC株TCID5tl敏感性試驗(yàn)的電泳圖;其中M-Marker,泳道1-9均為PCR產(chǎn)物,其DNA模板分別提取于:稀釋10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的組織提取物。圖6為本發(fā)明試劑盒對(duì)鴨瘟病毒Clone-03株TCID5tl敏感性試驗(yàn)的電泳圖;其中M-Marker,泳道1-9均為PCR產(chǎn)物,其DNA模板分別提取于:稀釋10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的組織提取物。圖7為本發(fā)明試劑盒對(duì)鴨瘟病毒V2085株LD5tl敏感性試驗(yàn)的電泳圖;其中M-Marker,泳道1-9均為PCR產(chǎn)物,其DNA模板分別提取于:稀釋10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的組織提取物。圖8本發(fā)明試劑盒檢測(cè)鴨組織樣本得到的電泳圖。圖中M:DNA Marker ;Lane I為以鴨瘟病毒v2085株感染鴨的肝臟樣品為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 2為以鴨瘟病毒LH2011株感染鴨的肝臟樣品為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 3為以鴨瘟病毒VAC株接種鴨的肝臟樣品為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 4為以鴨瘟病毒Clone-03株接種鴨的肝臟樣品為模板的PCR產(chǎn)物;Lane 5為以健康鴨肝臟樣品為模板的PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
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實(shí)施例1用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒的組成 本發(fā)明用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒,包括如下試劑:
(I)引物組合物,由上游引物Primer F和下游引物Primer R組成,其序列如下:
上游引物 Primer F (SEQ ID NO:1): 5,-CATCTCGTGTCAGTTAAAGG-3,,
下游引物 Primer R (SEQ ID NO:2): 5,- AAAACAAGAGTCAAGAGCCG-3,。上游和下游引物的濃度均為0.01mol/mlo制備方法為:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物設(shè)計(jì)過程:發(fā)明人應(yīng)用Invitrogen軟件,參考現(xiàn)公開發(fā)表的全部鴨瘟病毒株的LORFll等位基因序列(GenBank登錄號(hào):Jansen株,JQ430740.1 !Holland株,JQ595417.1 ;D11-JW-016 株,JQ430739.1 ;V2085 株,JF999965.1 ;LH2011 株,JX885588 ;CHv株,JQ647509.1 ;VAC 株,EU082088.2 ;Clone-03 株,EU294364.1),在其開放閱讀框的上游5bp和下游IOlbp的位置分別設(shè)計(jì)了引物Primer F和Primer R0鴨瘟病毒Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株是歐洲強(qiáng)毒株,鴨瘟病毒LH2011和CHv株是中國強(qiáng)毒株,鴨瘟病毒VAC株和Clone-03株是中國疫苗株(弱毒株)。發(fā)明人分析了鴨瘟病毒歐洲強(qiáng)毒株、中國強(qiáng)毒株及中國弱毒株的LORFll等位基因序列,具體見圖1。鴨瘟病毒歐洲強(qiáng)毒株的LORFll等位基因的開放閱讀框(ORF)為3171bp。鴨瘟病毒中國強(qiáng)毒株的LORFll等位基因序列中則發(fā)生了基因片段的插入,使其等位核苷酸序列變?yōu)?342bp,同時(shí)ORF也發(fā)生改變,變?yōu)長(zhǎng)ORFlIA和LORFlIB兩個(gè)0RF。鴨瘟病毒VAC株(中國疫苗株)的LORFll等位基因大小為828bp,鴨瘟病毒Clone-03 (中國疫苗株)的LORFll等位基因大小為2412bp。另外,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述各病毒株LORFll等位基因開放閱讀框的上游50bp和下游150bp序列高度同源,因此在其開放閱讀框的上游5bp和下游IOlbp的位置分別設(shè)計(jì)了引物Primer F和Primer R。采用引物Primer F和Primer R,歐洲強(qiáng)毒株的理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為3277bp,中國強(qiáng)毒株的理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為4448bp,鴨瘟病毒VAC株的理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為934bp,鴨瘟病毒Clone-03株的理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為2518bp。申請(qǐng)人選擇鴨瘟病毒VAC株、Clone-03株,從歐洲來源的強(qiáng)毒株中選擇v2085株,從中國來源的強(qiáng)毒株中選擇LH2011株,來驗(yàn)證本發(fā)明引物組合物及試劑盒的作用、特異性、靈敏度。(2) 10XPCR緩沖液購自大連寶生物工程有限公司。(3) dNTPs,為 dATP、dITP、dGTP 和 dCTP 的等濃度混合物,所述 dATP、d!TP、dGTP 或dCTP的濃度均為2.5mM,購自大連寶生物工程有限公司
(4)ExTaq酶購自大連寶生物工程有限公司,5U/ ii L。
實(shí)施例2應(yīng)用本發(fā)明試劑盒鑒別不同來源的鴨瘟病毒毒株
1、材料
9日齡SPF雞胚,用于制備雞胚成纖維細(xì)胞。鴨瘟病毒LH2011株,是中國強(qiáng)毒株,由本試驗(yàn)室分離鑒定,對(duì)鴨的最小致死劑量為 I (T5 I (TVmL。
鴨瘟病毒V2085株,是歐洲強(qiáng)毒株,由德國柏林自由大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病毒研究所惠贈(zèng),對(duì)鴨的最小致死劑量為 Kr4 lO—VmL。(Wang, J.,D.H5per, et al.( 2011 ) "Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains.〃Virus Res.160(1-2): 316-325.)
鴨痕病毒VAC株:中國疫苗株,是弱毒株,來自南京天邦生物科技有限公司。(Li, Y.,B.Huang, et al.(2009)."Molecular characterization of the genome of duckenteritis virus.Virology 391(2): 151-161。Wang, J., D.Hoper, et al.( 2011 )."Complete genome sequence ofvirulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genomesequences of virulent and attenuated DEV strains.Virus Res.160(1-2):316-325.))
鴨痕病毒Clone-03株:中國疫苗株,是弱毒株,來自南京天邦生物科技有限公司。(Wang, J., D.Hoper, et al.( 2011 )."Complete genome sequence of virulentduck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences ofvirulent and attenuated DEV strains.Virus Res.160(1-2): 316-325.)
ExTaq酶和PCR反應(yīng)試劑,購自大連寶生物工程有限公司。2、實(shí)驗(yàn)方法
2.1雞胚成纖維細(xì)胞的制備
參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》2000版附錄所述方法進(jìn)行。2.2鴨瘟病毒的增殖與病毒樣本提取
鴨瘟病毒LH2011株和V2085株分別取10倍最小致死劑量肌肉接種2月齡健康非免鴨,待鴨只發(fā)病后,取鴨只的肝臟等約0.1-0.5g,加入10倍量無菌純水,研磨后,反復(fù)凍融3次,8000rpm離心15min,取上清作為組織提取物備用。鴨瘟病毒VAC株和Clone-03株分別按
0.01的感染復(fù)數(shù)感染雞胚成纖維細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60%-70%時(shí),將上清與細(xì)胞一起反復(fù)凍融3次,8000rpm離心15min,取上清作為組織提取物備用。同時(shí)設(shè)未感染鴨瘟病毒的雞胚成纖維細(xì)胞為對(duì)照,按感染病毒的細(xì)胞相同的方法處理。2.3病毒DNA提取
按照下述方法,分別提取各組織提取物的病毒DNA。病毒DNA的提取:①取組織提取物制備的上清液445 ii L,加入10%SDS50 y L,20mg/mL蛋白酶K2.L,混勻;置56°C水浴lh,99°C水浴lOmin,冷卻至室溫;②加入Tris飽和酹200 u L,混勻,4°C、12000rpm條件下離心5min,取上清。重復(fù)2次;③加入Tris飽和酹100 V- L和氯仿100 V- L,混勻,411CUSOOOrpm條件下離心5min,取上清;④加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉,和1-2倍體積無水乙醇,上下顛倒混勻,置_20°C條件下40min至數(shù)天;⑤4°C、12000rpm條件下離心20min,棄上清,沉淀用70%乙醇洗滌,4°C、12000rpm條件下離心lmin,棄上清,洗滌2次;⑥置超凈臺(tái)中風(fēng)干,加入20-100 u L無菌純水溶解,作為病毒DNA備用。2.4 PCR 反應(yīng)
以各病毒DNA為模板,分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物,由上游引物和下游引物組成,所述上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物,其特征在于:所述上游和下游引物的濃度為0.0lmo I/ml o
3.用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒,包括權(quán)利要求1或2所述引物組合物、PCR緩沖液、dNTPs 和 ExTaq 酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒,其特征在于:所述dNTPs為dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等濃度混合物,所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的濃度均為2.5mM ; 權(quán)利要求1或2所述引物組合物在制備用于鑒別鴨瘟病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述引物組合物鑒別鴨瘟病毒的方法: (1)提取待檢樣品的DNA; (2)以步驟(I沖所述DNA為模板,用權(quán)利要求1或2所述引物組合物為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),獲得PCR產(chǎn)物; (3 )將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,判斷所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為4430-4460bp時(shí),待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3260-3290bp時(shí),待檢樣品感染歐洲來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為920_950bp,待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒VAC株;當(dāng)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為2510-2540bp,待檢樣品感染中國來源的鴨瘟病毒Clone-03。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述鑒別鴨瘟病毒的方法,其特征在于:所述中國來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株為鴨瘟病毒LH2011株和CHv株中的一種或兩種;所述歐洲來源的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株為鴨痕病毒Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株中的一種或兩種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述鑒別鴨瘟病毒的方法,其特征在于步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30sec,52°C退火 40sec,72°C延伸 3min40sec,循環(huán) 40次;最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供了用于鑒別鴨瘟病毒的引物組合物及試劑盒,屬于動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。所述引物組合物,由上游引物和下游引物組成,所述上游引物和下游引物的序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述試劑盒,包括引物組合物、PCR緩沖液、dNTPs和ExTaq酶。采用本發(fā)明引物組合物或試劑盒能夠鑒別樣品是否含有鴨瘟病毒;如果有鴨瘟病毒,究竟是歐洲強(qiáng)毒株、中國強(qiáng)毒株、中國疫苗株(弱毒株)VAC株還是中國疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本發(fā)明檢測(cè)方法具有特異、快速、簡(jiǎn)便、靈敏和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn),適用于科研、生產(chǎn)和臨床及出入境檢測(cè)等,應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/93GK103146848SQ20131011745
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者王繼春, 張傳健, 許夢(mèng)微, 王志勝, 侯繼波 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院