一種腸道病毒71的檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及腸道病毒71的檢測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口?。╤and，foot and mouth disease ;HFMD)是由腸道病毒引起的一種急性 傳染病。該病自1957年首次報(bào)道以來，曾多次大范圍流行，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization ;WH0)于2006年曾將本病列為第四位引起死亡的的疾病。美國、澳大利亞、意 大利、法國、荷蘭、西班牙、羅馬尼亞、巴西、加拿大、德國等國家經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、埃 可病毒和腸道病毒71型（EV71)引起的手足口病。1998年，臺(tái)灣地區(qū)暴發(fā)EV71的大流行， 約有12萬以上的人被感染，死亡78人。1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007 年該病在中國發(fā)生了大規(guī)模的疾病暴發(fā)。手足口病是全球性傳染病，近年來手足口病已經(jīng) 成為越來越威脅國內(nèi)外兒童健康的廣泛流行性疾病之一。為指導(dǎo)全國各地做好手足口病的 預(yù)防控制，2008年衛(wèi)生部發(fā)布《手足口病預(yù)防控制指南》；規(guī)定自2008年5月2日起，手足 口病納入丙類傳染病管理。
[0003] 引起手足口病的病原體有20多種，其中以柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A 16 ;CA16)和腸道病毒71型（Human Enterovirus 71 ;EV71)最為常見，均為小RNA病毒 科。有研究顯示不同病毒引起者可有不同的并發(fā)癥與預(yù)后，如CA16引起的HFMD預(yù)后較好， 多為散發(fā)，極少導(dǎo)致HFMD的大規(guī)模暴發(fā)；而EV71感染患兒臨床癥狀常較重，死亡率高。因 此，有關(guān)EV71的病毒生物學(xué)特性、致病機(jī)理、診斷和預(yù)防等的研究日益受到人們的重視。
[0004] EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對(duì) 稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突起，直徑大約24~30nm，核酸為單股正鏈RNA。EV71基因組編碼 四個(gè)多肽VPl ( a )、VP2 ( β )、VP3 ( γ )、VP4 ( δ )，四個(gè)多肽首先構(gòu)成原聚體，再由5個(gè)原聚體 拼裝成具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位，60個(gè)亞單位相互連接形成病毒的外殼。四種結(jié)構(gòu)蛋白 中，VPl、VP2和VP3三個(gè)多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與病毒 核心緊密連接，因而抗原表位基本上位于VPl~VP3上。VPl作為主要的衣殼蛋白，具有最 多的型特異性中和位點(diǎn)，其基因序列與病毒血清型具有較高的相關(guān)性。
[0005] EV71病毒衣殼蛋白VPl是該病毒主要的中和決定因子，它直接決定病毒的抗原 性。VPl基因具有與病毒血清型完全對(duì)應(yīng)的遺傳多樣性，VPl基因序列不僅可作為腸道病毒 屬內(nèi)不同血清型分類的依據(jù)。并可作為小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考，因此VPl基因 成了 EV71基因分型和遺傳進(jìn)化分析的最重要的對(duì)象。目前基于VPl核苷酸序列的差異，可 將EV71分為A、B、C等三個(gè)基因型，A型僅包括原型株BrCr-CA-70 ;B型和C型又可進(jìn)一步 分為Bl、B2、B3、B4以及Cl、C2、C3和C4亞型。Brown等曾對(duì)113株世界各地的EV71分離 株的VPl基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，顯示同一型內(nèi)毒株間序列同源性大于92%， 而不同型間毒株的同源性為78%~83%。自1997-2001年期間在馬來西亞、新加坡、中國 臺(tái)灣和澳大利亞西部等地流行期間分離到2個(gè)新亞型，即B3和M亞型，其中B3亞型為東 南亞地區(qū)的流行株。M亞型曾在新加坡（1997-1998年）和中國臺(tái)灣（1998年）小規(guī)模流 行，但2000年在馬來西亞和新加坡大規(guī)模流行，成為流行株。B基因型主要包括美國、澳大 利亞、哥倫比亞、新加坡、部分中國大陸與中國臺(tái)灣地區(qū)、部分馬來西亞的毒株；而C基因型 主要包括美國、澳大利亞、中國大陸與中國臺(tái)灣、加拿大和部分馬來西亞的毒株。B和C基因 型在系統(tǒng)發(fā)生樹上遺傳距離較遠(yuǎn)。中國臺(tái)灣1998年EV71大爆發(fā)是由2個(gè)基因型，即B和 C2同時(shí)引起的，但Shih等比較了其流行期間從死亡病例中分離的18株毒株。結(jié)果表明， 有17株分離毒株為C2亞型，僅1株為B型。近年來在中國上海、重慶、浙江和深圳等多個(gè) 地區(qū)分離的EV71病毒有較高的同源性，均屬于C4亞型，提示該C4亞型EV71病毒在中國大 陸可能有較廣泛的分布和傳播。EV71病毒衣殼蛋白VP2和VP4是腸道病毒外殼蛋白的主要 組成部分，它們與病毒的抗原性密切相關(guān)，基于VPl與VP4的基因分型具有很高的相關(guān)性。
[0006] 目前，EV71疫苗、特異性治療藥物等防控手段尚不成熟。EV71病原體的快速診斷、 疫苗的抗原含量檢測(cè)、保護(hù)性表位研究，具有廣泛的臨床應(yīng)用和社會(huì)需求。高質(zhì)量的EV71 多克隆抗體可用于研制EV71患者病原體診斷以及EV71疫苗的抗原含量檢測(cè)，因此具有重 要的應(yīng)用價(jià)值。本申請(qǐng)以EV71病毒的C4亞型為基礎(chǔ)，利用重組抗原VPl免疫兔與雞分別 制備多克隆抗體，并運(yùn)用該配對(duì)抗體對(duì)EV71采用酶聯(lián)免疫夾心法進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的EV71檢測(cè)方法耗時(shí)、繁瑣，成本高昂的缺 陷，提供一種快速高效、準(zhǔn)確靈敏、制作成本低的EV71病毒檢測(cè)方法及其試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種腸道病毒71雙抗體夾心ELISA試劑盒，該 試劑盒包括：已包被有抗VPl多克隆抗體的酶標(biāo)板；酶標(biāo)抗VPl多克隆抗體；VPl抗原。
[0009] 進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)板上包被的抗VPl多克隆抗體為兔抗VPl多克隆抗體，所述酶 標(biāo)抗VPl多克隆抗體為酶標(biāo)雞抗VPl多克隆抗體。
[0010] 進(jìn)一步地，還包括：洗滌液、稀釋液、終止液、底物顯示液、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì) 照血清的一種或多種。
[0011] 進(jìn)一步地，所述洗滌液是由吐溫-20與濃度為0. 01mol/L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖 液按照體積比I :1900~2200混合配制而成。
[0012] 進(jìn)一步地，所述終止液為2mol/L的硫酸溶液。
[0013] 進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)抗VPl多克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、 丙酮酸激酶和葡萄糖氧化酶標(biāo)記的一種。
[0014] 進(jìn)一步地，所述VPl抗原為滅活VPl蛋白。
[0015] 腸道病毒71雙抗體夾心ELISA試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0016] (1)包被酶標(biāo)板：采用包被液包被兔抗VPl多克隆抗體，4°C包被過夜，包被濃度為 4. 8~5. 2 μ g/mL，100~120 μ L/孔，所述包被液為50mM碳酸鹽緩沖液；
[0017] ⑵封閉酶標(biāo)板：甩去包被液，于吸水紙上扣干酶標(biāo)板，每孔加入100~250 μ L封 閉液，4°C封閉過夜，甩去封閉液，用洗滌液洗板并扣干；
[0018] (3)酶標(biāo)板包裝：將封閉的酶標(biāo)板用鋁箱袋真空包裝，得到包被有兔抗EV71多克 隆抗體的酶標(biāo)板。
[0019] (4)試劑盒制備：分別將酶標(biāo)雞抗VPl多克隆抗體和VPl抗原封裝后和包裝好的 酶標(biāo)板一起放置到包裝盒中，得到腸道病毒71雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟（2)所述封閉液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~5%的明膠或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~ 5%的牛血清蛋白或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1~0. 5%的脫脂奶。
[0021] 試劑盒檢測(cè)EV71的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0022] 1)分別加入待測(cè)樣品、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清，100~150 μ L/孔，37°C孵 育 50 ~150min ;
[0023] 2)甩去樣品液，用洗滌液沖洗干凈，加入I :2000稀釋的酶標(biāo)雞抗EV71多克隆抗 體，1〇〇~120以17孔，37°(：孵育3〇11^11;
[0024] 3)加入底物進(jìn)行顯色，100~200 μ L/孔，37°C反應(yīng)15min ;
[0025] 4)加入終止液終止反應(yīng)；
[0026] 5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，根據(jù)Cut-of f值判斷陰性、陽性。
[0027] 本發(fā)明預(yù)先將抗VPl多克隆抗體和酶標(biāo)抗VPl多克隆抗體制備試劑盒，制備方法 簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是采用雞抗VPl多克隆抗體對(duì)EV71各種基因型均 有高結(jié)合效價(jià)，檢測(cè)更加靈敏、高效，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描 述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā) 明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施 例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1.多克隆抗體的制備
[0031] 1.1免疫原的制備
[0032] I. I. 1設(shè)計(jì)EV71VP1基因序列引物
[0033] 根據(jù)GenBank(登錄號(hào)：EU024958. 1)查詢到的EV71衣殼蛋白VPl基因序列，自 行設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物 Primer-F :5' -TTCCATATGGGAGATAGGGTGGCDGATGTGATY GA-3' 和下游引物 Primer-F :5' -CCGCTCGAGGAGDGTGGTGATRGCRGTGCGACT-3'。
[0034] I. L 2 提取 EV71 病毒的 RNA
[0035] 提取EV71病毒（由浙江⑶C惠贈(zèng)）的RNA為模板：
[0036] 使用美國Roche公司的病毒RNA抽提試劑盒，直接從培養(yǎng)的病毒中提取RNA，操作 步驟按試劑盒中的說明書進(jìn)行，方法如下：
[0037] 1)取I. 5mL離心管，做好標(biāo)記后加入409 μ L已經(jīng)混均的工作液；
[0038] 2)用帶濾芯無 RNase的吸頭加入200 μ L需抽提處理的樣本，漩渦混合器上振蕩混 勻，短暫離心后，室溫靜置IOmin ;
[0039] 3)用帶濾芯吸頭加入400 yL無水乙醇，漩渦混合器上振蕩混勻，短暫離心；
[0040] 4)將核酸抽提柱放置在2mL離心管上，取500 μ L步驟3)的液體轉(zhuǎn)移入核酸提取 柱，12000rpm 離心 30s ;
[0041] 5)重復(fù)4)，將步驟3)中的剩余液體移入核酸提取柱，12000rpm離心30s ;
[0042] 6)棄2mL離心管中的廢液，在每個(gè)核酸抽提柱內(nèi)加入500 μ L洗滌液WA，12000rpm 離心30s ;
[0043] 7)棄2mL離心管中的廢液，在每個(gè)核酸抽提柱內(nèi)加入500 μ L洗滌液WB，12000rpm 離心30s ;
[0044] 8)棄2mL離心管中的廢液，以最大轉(zhuǎn)速離心2min ;
[0045] 9)棄2mL離心管，將核酸抽提柱置于一個(gè)無 RNase的I. 5mL離心管，在抽提柱的膜 中央小心地加入30 μ L EB，靜置lmin，12000rpm離心2min ;
[0046] 10)棄純化柱，將離心回收的核酸暫時(shí)儲(chǔ)存于4°C備用。
[0047] I. I. 3RT-PCR 擴(kuò)增目的基因 vpl
[0048] 通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因 vp 1 :
[0049] I) RNA擴(kuò)增的RT-PCR體系如下：
[0050] PCR擴(kuò)增體系：
[0052] 2) RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：
[0053] RT-PCR 反應(yīng)條件：
[0055] 獲得目的基因后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得目的重 組基因工程菌，獲得重組工程菌后誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并收集包涵體。I. 1.