專(zhuān)利名稱(chēng)：生物大分子濃縮除鹽方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn) 行濃縮除鹽的方法以及采用該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
膀胱癌是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤，占全球癌癥發(fā)病率的2. 3%。 在我國(guó)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，膀胱癌發(fā)病率和死亡率均占首位，復(fù)發(fā)率高達(dá)50 % -70 %，遠(yuǎn) 端轉(zhuǎn)移占10% -20%。這種高死亡率在很大程度上是由于膀胱癌的檢測(cè)技術(shù)不夠靈敏所 致。目前，膀胱癌的診斷主要依靠膀胱鏡檢查，一般是在患者出現(xiàn)血尿后才引起注意；但是 在這種癥狀下，膀胱癌已發(fā)展至中晚期，伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，很難找到有效的治療手段，而 且也無(wú)法避免高復(fù)發(fā)率。因此，膀胱癌的早期診斷具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠極大 地提高膀胱癌的早期診斷水平和明顯地改善膀胱癌患者的生活質(zhì)量。類(lèi)似膀胱癌這種疾病的診斷是通過(guò)尿液的致癌標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)。尿液或其它體液具 有樣本體積很大、蛋白質(zhì)濃度比較低的特點(diǎn)，如何富集蛋白質(zhì)已成為尿液等體液的相關(guān)研 究和臨床中必須面臨與要解決的問(wèn)題?，F(xiàn)在用于蛋白質(zhì)制備，樣品濃縮、除鹽的方法有超濾法、透析法、丙酮沉淀等方法。 相對(duì)來(lái)說(shuō)，超濾法成本較高，且濾膜上會(huì)吸附部分蛋白質(zhì)會(huì)造成蛋白損失，特別對(duì)于低分子 量和低豐度蛋白來(lái)說(shuō)特別明顯，超濾管一般用了 1次就不建議重復(fù)使用；透析法時(shí)間特別 長(zhǎng)，雖然能除鹽，但是不能富集蛋白；丙酮沉淀制備蛋白的方法具有使蛋白質(zhì)變性的副作 用，并且不利于處理大體積的樣本，回收率也不高。如何找到一種成本低，濃縮、除鹽效率 高，使樣品保持活性，化學(xué)試劑污染小，能回收的方法或試劑處理大體積液體樣本將會(huì)給相 關(guān)研究與臨床帶來(lái)新的突破口。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合用于大體積液體樣本、濃縮 或除鹽效率高且不會(huì)造成生物大分子變性的對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮或除鹽 的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種適合用于大體積液體樣本、濃縮和除鹽效率高且 不會(huì)造成生物大分子變性的對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮或除鹽的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮或除鹽的方法，所述方法 包括a、根據(jù)待濃縮或除鹽的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝膠，b、將凝固后的聚丙烯酰胺凝膠烘干；C、將烘干后的聚丙烯酰胺凝膠放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹；d、收集留在凝膠外部的生物大分子。
優(yōu)選的，步驟b中，聚丙烯酰胺凝膠的烘干溫度為50 70°C。所述生物大分子為蛋白質(zhì)或者核酸。優(yōu)選的，所述液體樣本為尿液，所述生物大分 子為尿液蛋白。所述步驟a中配置聚丙烯酰胺凝膠的濃度優(yōu)選為10 15%，更優(yōu)選13%。步驟c中，液體樣本體積不超過(guò)烘干前聚丙烯酰胺凝膠體積的60%。且優(yōu)選將步 驟c置于4°C _15°C更優(yōu)選于4°C下進(jìn)行。在本發(fā)明具體 的實(shí)施方式中，步驟d中，所述收集留在凝膠外部的生物大分子的 具體過(guò)程包括，用水或緩沖液沖洗凝膠外部，使留在凝膠外部的生物大分子溶解，然后將凝 膠轉(zhuǎn)入提前置于收集管中的網(wǎng)狀疏水性提籃，將提籃上提一定高度保證提籃中的凝膠高于 收集管內(nèi)的液面，并與收集管固定后，于50 150g離心2 5min，收集沖洗及離心后的液 體，得到濃縮除鹽后的生物大分子。優(yōu)選的，所述方法在步驟d后進(jìn)一步包括，將聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈后回 收使用，所述聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈的方法包括純水充分浸泡或超聲洗滌。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種用于對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮除鹽的試劑 盒，所述生物大分子為蛋白質(zhì)或者核酸，所述試劑盒含有能夠配置得到聚丙烯酰胺凝膠的 配方成分，或者所述試劑盒含有于50 70°C進(jìn)行烘干的聚丙烯酰胺干凝膠。優(yōu)選的，所述液體樣本為尿液，所述生物大分子為尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯 酰胺凝膠的濃度為10 15%，優(yōu)選13%，或者所述聚丙烯酰胺干凝膠在烘干前的濃度為 10 15%，優(yōu)選 13%。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供的聚丙烯酰胺凝膠濃縮除鹽方法和試劑盒能有效地處理液體樣本，操 作流程簡(jiǎn)易，并使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子不變性、損失小，不僅濃縮和除鹽效率高，所用 聚丙烯酰胺凝膠還能回收、反復(fù)利用，化學(xué)試劑殘余幾乎為0，方便后期實(shí)驗(yàn)的處理，是現(xiàn)有 的液體蛋白質(zhì)、核酸樣品制備、樣本濃縮和除鹽方法的很好的替代品。特別低，本發(fā)明采用 溫和烘干的方式(于50 70°C優(yōu)選65°C充分烘干使脫水完全)制備干凝膠，不會(huì)改變凝 膠分子的親水性及交聯(lián)度，屬自然無(wú)變性過(guò)程，烘干后吸脹速度快；避免了利用醇類(lèi)或酮類(lèi) 物質(zhì)進(jìn)行脫水會(huì)造成凝膠分子親水性和交聯(lián)度的改變，使凝膠孔徑變大，蛋白質(zhì)等大分子 物質(zhì)容易進(jìn)入膠內(nèi)而造成損失，且吸脹速度慢的缺點(diǎn)。本發(fā)明制備干凝膠的方法操作簡(jiǎn)單 且無(wú)其他化學(xué)物質(zhì)(如醇類(lèi)和酮類(lèi))的殘留，避免對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的污染或變性和修飾等 不良影響。膠濃縮效率高，成本低(濃度為13%的聚丙烯酰胺凝膠即可濃縮得到分子量大 于IOKD的蛋白質(zhì))。


圖1為本發(fā)明一種聚丙烯酰胺凝膠法制備濃縮、除鹽樣品的操作流程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例5的4個(gè)尿液樣本用不同方法處理后跑SDS膠的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種適合用于大體積液體樣本、濃縮和除鹽效率高且不會(huì)造成生物 大分子變性的對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮除鹽的方法和試劑盒。下面的實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明是采用將一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠用溫和烘干(50-70°C優(yōu)選65°C )等 方式脫水完全至變硬后加入適當(dāng)體積的液體樣品，置于4°C -15°C優(yōu)選4°C待凝膠自然吸脹 完全后，水分和一些鹽類(lèi)等小分子會(huì)被吸進(jìn)膠內(nèi)，而大分子的蛋白質(zhì)、核酸則被截留在膠表 面，再用適當(dāng)體積的溶劑將蛋白或核酸沖洗并溶解，快速轉(zhuǎn)入新管。這樣便得到濃縮和除鹽 后的樣品。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下操作流程來(lái)實(shí)現(xiàn)1)按下表所列的對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)提取或濃縮或除鹽生物大分子的最低分子量選擇 配置合適的聚丙烯酰胺凝膠的濃度。表1截留分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系
分子量范圍/Pa I 凝膠濃度/(%)— 蛋白質(zhì)
_>5k__20_
>10k__\3_
>20k__8_
>30k__5_>50k3
核酸
_>lk__20_
_>5k__12_
>10k__8_
>20k__5_
>50k__2_在本發(fā)明中，配置聚丙烯酰胺凝膠的配方采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的配方，通 常包括單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)、交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(N， N-methylene-bisacylamide,簡(jiǎn)稱(chēng) Bis)、加速劑 N，N, N, N-四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱(chēng) TEMED)和 催化劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱(chēng)APS)或核黃素。2)待配置好的聚丙烯酰胺凝膠凝固后，將凝固后的凝膠于50 70°C優(yōu)選65°C充 分烘干使脫水完全。65°C為常用烘干溫度，波動(dòng)范圍50°C -70°C為宜，溫度過(guò)低所需烘干時(shí) 間長(zhǎng)，溫度過(guò)高容易破壞分子結(jié)構(gòu)，包括聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)。3)將上述烘干脫水完全的干凝膠放置于液體樣品內(nèi)，于4°C -15°C (常用溫度為 4°C，為冰箱常用溫度之一)條件下使凝膠充分吸脹。溫度在上述范圍內(nèi)變化對(duì)濃縮結(jié)果影 響不大，但溫度過(guò)高樣品容易降解，溫度過(guò)低不利于凝膠吸收樣品液體。 在本發(fā)明的方法中，烘干脫水完全后的聚丙烯酰胺凝膠能吸脹的最大體積配置 聚丙烯酰胺凝膠的液體總體積=0.6 1，即脫水完全后的聚丙烯酰胺凝膠完全吸脹后最 多能吸收相當(dāng)于配置聚丙烯酰胺凝膠液體總體積60%的液體。因此，為保證濃縮和除鹽效果，在該步驟中，應(yīng)使液體樣本體積烘干前聚丙烯酰胺凝膠體積(即配置聚丙烯酰胺凝 膠的液體總體積)<0.6 1。同時(shí)為便于操作，也可在上述步驟1)中根據(jù)待濃縮的液體 樣本體積，直接換算并配制合適體積的聚丙烯酰胺凝膠。在本發(fā)明的方法中，聚丙烯酰胺凝 膠過(guò)量使用對(duì)樣品的濃縮除鹽效果無(wú)不良影響，但會(huì)造成成本浪費(fèi)。 4)用適量的溶劑，如純水或者適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗凝膠表面，溶解截留于吸脹后凝 膠外部的蛋白質(zhì)或核酸，轉(zhuǎn)移入提前置于收集管中的網(wǎng)狀疏水性提籃，將提籃上提一定高 度，保證提籃中的凝膠高于收集管中液面，并使提籃與收集管固定后低速離心，比如可于 50 150g離心2 5min，甩出吸附在凝膠表面的樣品，收集沖洗及離心后的液體即為所得 濃縮除鹽后的生物大分子。離心速度過(guò)低則離心時(shí)間長(zhǎng)，影響樣品的收集率和鹽分的有效 去除；速度過(guò)高容易使凝膠破爛。在上述范圍內(nèi)，通?？筛鶕?jù)所使用的聚丙烯酰胺凝膠濃度 不同而選擇不同轉(zhuǎn)速，濃度高的凝膠能承受的轉(zhuǎn)速大，所需離心時(shí)間短。5)凝膠經(jīng)過(guò)回收處理(如純水下超聲3次洗出吸脹的物質(zhì))后脫水烘干，以備下 次使用。本發(fā)明的方法和試劑盒特別適合用于大體積液體樣品中，低含量生物大分子的富 集濃縮和除鹽，比如，特別適合用于尿液中尿蛋白的富集濃縮。本發(fā)明的有益效果在于(1)操作流程簡(jiǎn)易本發(fā)明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒操作簡(jiǎn)易(見(jiàn)圖1)，即使 是沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室背景的人員也能看說(shuō)明直接識(shí)別、操作，并且所用的試劑、儀器比較簡(jiǎn)單、常 見(jiàn)，一般的實(shí)驗(yàn)室都會(huì)配有，很容易普及。(2)成本低、回收率高本發(fā)明所提供的聚丙烯酰胺試劑盒，只需花費(fèi)制備聚丙烯 酰胺凝膠試劑的金額，花費(fèi)小，并且經(jīng)過(guò)處理后重復(fù)使用而不影響效果。(3)蛋白質(zhì)損失小通過(guò)SDS跑出的圖可看出，本發(fā)明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑 盒能夠提取低分子量的蛋白質(zhì)，并且凝膠表面殘余的蛋白可通過(guò)低速離心甩出。(4)可靈活選用不同濃度和體積的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的濃度不同， 能夠截留的分子量大小就不同，一般來(lái)說(shuō)13%的聚丙烯酰胺凝膠能截留約IOKD的蛋白質(zhì)， 根據(jù)需要制備的蛋白質(zhì)可選用不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠。并且該試劑盒所濃縮的液體樣 品體積不受限制，可靈活選用，非常方便，非常適合于大體積液體的濃縮和除鹽。(5)蛋白質(zhì)能保持活性。本發(fā)明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒沒(méi)有變性劑等物質(zhì)， 蛋白質(zhì)不會(huì)變性。(6)蛋白質(zhì)富集濃度高，除鹽率高。13%聚丙烯酰胺凝膠試劑盒處理50ml尿液樣 本能夠得到1. 069mg的蛋白質(zhì)，并且通過(guò)看SDS圖，除鹽效果好。本發(fā)明的方法和試劑盒適用于對(duì)液體樣本中，將一定分子量大小以上的所有蛋白 質(zhì)進(jìn)行富集濃縮并除鹽，可大概歸結(jié)為1、將濃度較低的蛋白樣品進(jìn)行濃縮。2、將鹽含量較高的蛋白樣品進(jìn)行除鹽。3、從體積較大、蛋白含量較低的液體樣本中富集蛋白并除鹽，例如尿液蛋白的樣 品制備。本發(fā)明不僅適合少量樣品的濃縮和除鹽，還適合大量樣品的濃縮和除鹽，適用范 圍大，從幾微升到幾百毫升甚至更大體積的樣品都適用。
特別地，本發(fā)明采用溫和烘干的方式(于50 70°C優(yōu)選65°C充分烘干使脫水完全)制備干凝膠，不會(huì)改變凝膠分子的親水性及交聯(lián)度，屬自然無(wú)變性過(guò)程，烘干后吸脹速 度快；避免了利用醇類(lèi)或酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行脫水會(huì)造成凝膠分子親水性和交聯(lián)度的改變，使凝 膠孔徑變大，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)容易進(jìn)入膠內(nèi)而造成損失，且吸脹速度慢的缺點(diǎn)。本發(fā)明 制備干凝膠的方法操作簡(jiǎn)單且無(wú)其他化學(xué)物質(zhì)(如醇類(lèi)和酮類(lèi))的殘留，避免對(duì)蛋白質(zhì)等 樣品的污染或變性和修飾等不良影響。膠濃縮效率高，成本低。本發(fā)明創(chuàng)造了凝膠重復(fù)使 用的方法50 70°C優(yōu)選65°C烘干方式和純水浸泡并超聲處理的方法使凝膠的重復(fù)使用 成為可能，因?yàn)檫@些方式對(duì)凝膠都是非化學(xué)、無(wú)變性作用。在本發(fā)明的方法和試劑盒中，可以采用疏水性提籃與收集管配套使用，在低速離 心作用下充分回收樣品，減少了樣品損失，大大提高了樣品回收率。本發(fā)明的方法或者試劑 盒可單用于濃縮或單用于除鹽，適用范圍廣。下面通過(guò)具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1聚丙烯酰胺凝膠的配制按下述配方配制濃度為13%的聚丙烯胺凝膠(13%濃度的聚丙烯酰胺凝膠能截 留IOKD以上的分子，通過(guò)調(diào)節(jié)聚丙烯酰胺凝膠的濃度，可以獲得需要截留的分子)，烘干后 聚丙烯胺凝膠的飽和吸收量為配置聚丙烯酰胺凝膠液體總體積的60%，按濃縮樣品的量配 制相應(yīng)體積的聚丙烯酰胺凝膠。置于適當(dāng)?shù)哪＞咧校毯?，用光滑薄刀片將其切成所?形狀和體積，在65°C熱板或烘箱條件下使凝膠脫水完全至變硬。13%的聚丙烯胺凝膠的配方為(V V)水55.63%30%單體儲(chǔ)液(acr bis = 29 1) 43. 33%10 % APS (過(guò)硫酸銨)1 %TEMED0. 04%如配制IOml 13%的聚丙烯酰胺凝膠的配方如下水5. 56ml30%單體儲(chǔ)液(acr bis = 29 1) 4.34ml10 % APS (過(guò)硫酸銨)0. ImlTEMED0. 004ml實(shí)施例2樣品濃縮與除鹽干凝膠用網(wǎng)狀疏水性提籃套住后，選擇適當(dāng)?shù)碾x心管或容器，將干凝膠置于容器 中，倒入需要濃縮和/或除鹽的樣品(烘干后聚丙烯胺凝膠的飽和吸收量為配置聚丙烯酰 胺凝膠液體總體積的60% )，4°C -15°C (優(yōu)選溫度4°C )條件下充分吸脹，待樣品溶液吸 收完全即可。樣品中的水、鹽分等小分子物質(zhì)被凝膠完全吸收，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)滯留在 凝膠外。如做尿液濃縮時(shí)，蛋白質(zhì)被滯留在凝膠外。實(shí)施例3樣品的沖洗和轉(zhuǎn)移用一定量的純水(或其它buffer，如PBS、TBS、lysis buffer 等，lysis buffer :8M 尿素+4% CHAPS+40mM Tris-HCl+lmM PMSF+2mM EDTA+IOmM DTT)沖洗吸脹后的凝膠表面， 使蛋白質(zhì)溶于溶劑，之后轉(zhuǎn)移入網(wǎng)狀疏水性提籃并置于收集管中。將提籃向上提Icm(上提 的距離由收集管中液體的高度決定，約比液體高度高一點(diǎn)點(diǎn))，固定提籃后，50-150g離心2-5min,液體樣品被甩出網(wǎng)狀疏水性提籃，收集得到濃縮和除鹽后的樣品。當(dāng)用于沖洗凝膠的純水(或其它合適的buffer)加入過(guò)多時(shí)，此時(shí)可通過(guò)冷凍抽 干的方法對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮(樣品已經(jīng)除鹽，所以冷凍抽干不會(huì)使樣品變質(zhì))。實(shí)施例4凝膠的回收從網(wǎng)狀疏水性提籃中拿出聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)過(guò)處理后可重復(fù)使用。參考的處理方法為(也可用本實(shí)施例以外的方法處理)在超聲槽中加入5倍或 以上膠體積的純水，加入吸脹后的聚丙烯酰胺凝膠，超聲3次，每次換水。當(dāng)超聲后的水沒(méi) 有氣泡，清澈，可將聚丙烯酰胺凝膠置于65°C熱板或烘箱條件下使凝膠脫水完全至變硬。將 脫水后的凝膠回收，干燥環(huán)境下保存，以備再次使用。除上述參考方法外，在本發(fā)明中，吸脹后的聚丙烯酰胺凝膠也可采用其它方法進(jìn) 行回收處理，比如用純水直接浸泡使聚丙烯酰胺凝膠清洗干凈。實(shí)施例5尿液蛋白樣品的制備 將同一批正常人尿液樣本200ml分成4份，每份各50ml，分別標(biāo)注為1、2、3、4號(hào)樣 本。分別從1-4號(hào)樣本中制備尿液蛋白。1號(hào)樣本用常規(guī)的超濾法制備，2、3、4號(hào)樣本分別 用本發(fā)明制備的濃度為15%、13%、10%的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒制備，具體方法參考上述 實(shí)施例1-4。4份樣本濃縮后的尿液蛋白質(zhì)樣品分別跑SDS膠，上樣量都為20 μ g。SDS膠圖如 圖2所示。結(jié)果顯示，2號(hào)、3號(hào)樣品除鹽效果很好，并且蛋白質(zhì)的種類(lèi)、濃度都比1號(hào)、4號(hào) 樣品都高；并且看到2號(hào)、3號(hào)能截留IOKD的蛋白質(zhì)，本發(fā)明試劑盒不會(huì)丟失小分子量的蛋 白質(zhì)。由于鹽分影響，含鹽樣品的泳道往下變寬成梯形狀。在考慮成本的前提下，當(dāng)用于尿液蛋白的制備時(shí)，13%的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒 濃縮和除鹽效果最好。實(shí)施例6 —種用于從尿液中富集尿液蛋白的試劑盒—種試劑盒，含有密封包裝的聚丙烯酰胺干凝膠，該干凝膠在烘干前濃度為13 %， 且是在50 70°C溫度條件下進(jìn)行烘干脫水完全的。該試劑盒用于從尿液中富集尿液蛋白。實(shí)施例7另一種用于從尿液中富集尿液蛋白的試劑盒一種試劑盒，含有可配置得到聚丙烯酰胺凝膠的以下成分30%單體儲(chǔ)液 (acr bis = 29 1)、10% APS(過(guò)硫酸銨)和TEMED。該試劑盒還含有說(shuō)明書(shū)。該試劑 盒可用于從尿液中富集尿液蛋白。實(shí)施例8聚丙烯酰胺凝膠試劑盒濃縮和除鹽樣品的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定利用上述實(shí)施例6的試劑盒，按照實(shí)施例2-4所述的方法，或者利用上述實(shí)施例7 的試劑盒，按照實(shí)施例1-4所述的方法(聚丙烯酰胺凝膠濃度為13% )，在相同條件下分別 對(duì)3組各50ml正常人尿液樣本進(jìn)行濃縮和除鹽。濃縮和除鹽后的蛋白質(zhì)樣品分別用酶標(biāo) 儀測(cè)定蛋白濃度。結(jié)果見(jiàn)下表，可以看出，本發(fā)明試劑盒提取的總蛋白量很高，能滿(mǎn)足蛋白 質(zhì)組等研究的需要。表213%聚丙烯酰胺凝膠試劑盒濃縮尿液后的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
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權(quán)利要求
1.一種對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮或除鹽的方法，所述方法包括a、根據(jù)待濃縮或除鹽的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝膠，b、將凝固后的聚丙烯酰胺凝膠烘干；C、將烘干后的聚丙烯酰胺凝膠放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹；d、收集留在凝膠外部的生物大分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中，聚丙烯酰胺凝膠的烘干溫度為 50 70 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物大分子為蛋白質(zhì)或者核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述液體樣本為尿液，所述蛋白為尿液蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟a中配置聚丙烯酰胺凝膠的濃 度為10 15%，優(yōu)選13%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟c中，液體樣本體積不超過(guò)烘干 前聚丙烯酰胺凝膠體積的60%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟d中，所述收集留 在凝膠外部的生物大分子的具體過(guò)程包括，用水或緩沖液沖洗凝膠外部，使留在凝膠外部 的生物大分子溶解，然后將凝膠轉(zhuǎn)入提前置于收集管中的網(wǎng)狀疏水性提籃，使提籃中的凝 膠高于收集管中的液面，并固定于收集管，于50 150g離心2 5min，收集沖洗及離心后 的液體，得到濃縮除鹽后的生物大分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法在步驟d后 進(jìn)一步包括，將聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈后回收使用，所述聚丙烯酰胺凝膠充分清洗 干凈的方法包括純水充分浸泡或超聲洗滌。
9.一種用于對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮或除鹽的試劑盒，所述生物大分子為 蛋白質(zhì)或者核酸，其特征在于所述試劑盒含有能夠配置得到聚丙烯酰胺凝膠的配方成分， 或者所述試劑盒含有于50 70°C進(jìn)行烘干的聚丙烯酰胺干凝膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述液體樣本為尿液，所述生物大分 子為尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯酰胺凝膠的濃度為10 15%，優(yōu)選13%，或者所述聚 丙烯酰胺干凝膠在烘干前的濃度為10 15%，優(yōu)選13%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)液體樣本中的生物大分子進(jìn)行濃縮除鹽的方法和試劑盒，所述生物大分子為蛋白質(zhì)或者核酸，本發(fā)明的方法包括配置聚丙烯酰胺凝膠并烘干，然后放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹，收集留在凝膠外部的生物大分子。本發(fā)明提供的聚丙烯酰胺凝膠濃縮除鹽方法和試劑盒能有效地處理液體樣本，操作流程簡(jiǎn)易，并使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子不變性、損失小，不僅濃縮和除鹽效率高，所用聚丙烯酰胺凝膠還能回收、反復(fù)利用，是現(xiàn)有的液體蛋白質(zhì)、核酸樣品制備，樣本濃縮和除鹽方法的很好的替代品。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102072836SQ201010542498
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者李啟沅, 林志龍, 林梁, 邱雪梅 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司