專利名稱：一種抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物及其制劑領(lǐng)域，更具體地說，是涉及一種抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子 的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的一種傳染病，并多發(fā)于20日齡之后的鴨。主要癥 狀為體溫升高、呼吸困難、流淚、拉綠色稀糞、病鴨頭和頸部腫脹，故有"大 頭瘋"之稱。鴨痙發(fā)病率和致死率都很高
盡管目前已經(jīng)有一些抗鴨痕的藥品或制劑但是由于現(xiàn)有藥品制劑的針對(duì) 性不強(qiáng)，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應(yīng)用的，不能起預(yù)防作 用。對(duì)于鴨瘟病的易感鴨群，每年定期對(duì)鴨接種鴨瘟疫苗是預(yù)防鴨瘟的有效方 法。其次應(yīng)增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)或藥物干預(yù)，提高自身免疲力。通過藥物提高機(jī)體抵杭力 或調(diào)節(jié)免疫力也是一種預(yù)防鴨瘟的有效方法，轉(zhuǎn)移因子可起到此作用。
轉(zhuǎn)移因子(TF, Transfer Factor)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信 息的低分子量多肽_核苷酸復(fù)合物，它能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特 異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高受體機(jī)體的細(xì)胞 免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細(xì)菌性感染；同時(shí)促進(jìn)B淋.巴細(xì)胞的抗體分泌作 用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強(qiáng)受體的免疫功能。
目前已報(bào)道的轉(zhuǎn)移因子的提取方法大多是關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備 方法。已經(jīng)報(bào)道的專利申請(qǐng)的內(nèi)容是對(duì)破碎后的組織經(jīng)冷凍離心后直接進(jìn)行過 濾提取，同樣存在細(xì)胞破碎不完全的缺陷，而且其工藝煩瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn) 物的活性損失也較大，因此得率很難提高。
豬脾臟和胸腺是免疫活性細(xì)胞聚集的場(chǎng)所，而且材^f來源非常廣泛，因此從這類細(xì)胞中提取特異性轉(zhuǎn)移因子，有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義，但目前尚 未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天 然高效純生物活性物質(zhì)抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
本發(fā)明抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行
(1) 制備病毒抗原將鴨瘟接種于10天齡鴨胚尿嚢液，33'C下48 - 96小時(shí)， 取鴨胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣 留上清；
(2) 提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗 原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15%、 30%、 45%及60%的蔗糖制備的 不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，才艮據(jù)鴨瘟的分子量 確定鴨瘟所在離心管位置，吸出備用；
(3) 用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原， 用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全 佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或 皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng)物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔 一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢 測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后,宰殺動(dòng)物，取脾 臟和胸腺于水上，轉(zhuǎn)移至-20'C保存，備用；
(4) 從免疫豬中提取抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子
① 原材料的制備及預(yù)處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用 冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；
② 破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在水凍的條 件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
③ 凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴30。C中融化，交替凍融4 - 6次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；
提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于水凍離心機(jī)于5。C以4000r/min離 心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
⑤超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6 0 0 0道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0. 22 u m的濾膜加壓過濾除菌； ⑦分裝4匸密封保存，即得所述的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子^是取液。 本發(fā)明 一種抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具有以下憂點(diǎn)
(1) 原材料來源容易，無污染，價(jià)廉。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料。
(2) 破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在3(TC下溶解，不使小 分子物質(zhì)活性喪失，并能夠使鴨瘟轉(zhuǎn)移因子得以充分地提取。
(3) 工藝采用了比較先進(jìn)的中空纖維超濾膜超過濾法，從而縮短了制備時(shí) 間，保證物質(zhì)分離過程中活性不被破壞。
(4) 提取物經(jīng)生化測(cè)定和若干成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復(fù)合 物，是一種不含蛋自質(zhì)、可溶的小分子物質(zhì)，分子量在6000道爾頓以下。經(jīng)體 內(nèi)外生物活性試驗(yàn)以及藥理、毒性試驗(yàn)等證明，具有純度高、免疫活性強(qiáng)、起 效快而維持時(shí)間長(zhǎng)、易吸收、無任何不良反應(yīng)等特點(diǎn)，其療效確切，安全可靠， 既可治療又可增強(qiáng)抗病能力。該提取物可做成口服液等劑型，便于應(yīng)用。
本發(fā)明的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子可以全面或部分抑制鴨疸，能保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞 免受病毒感染。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防鴨瘟感染、能夠保護(hù) 正常機(jī)體細(xì)胞免受鴨瘟侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時(shí)對(duì)于遭到鴨瘋感染 的鴨使用轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡 率。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。 實(shí)施例l:抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備
1. 制備病毒抗原將鴨瘟接種于10天齡鴨胚尿嚢液，33。C下48 - 96小時(shí)， 取鴨胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，500Orpm離心20分鐘，棄去沉渣 留上清；
2. 取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化^是取病毒抗原；將病毒抗原 離心后，取上清液裝入以15%、 30%、 45%及60%的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度 離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)不同病毒的分子量確定該病毒 所在離心管位置，吸出備用；
3. 用上述提取的病毒抗原免疫豬用上述提^l病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫 豬，共免疫4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以 高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng) 物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-IO天后取動(dòng)物靜脈 血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒 特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-2(TC保存，備 用；
4. 從免疫豬中提取抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子
(1) 原材料的制備及預(yù)處理將病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸 水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；
(2) 破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在水凍的 條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
(3) 凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴3(TC中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；
(4 )提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于水凍離心機(jī)于5。C以4000r/min 離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
(5 )超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超 濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
(6)除菌將超濾得到的濾液用孔徑為O. 22 u m的濾膜加壓過濾除菌；
6(7 )包裝:按口服液的要求，力口15%的糖漿，加標(biāo)準(zhǔn)防腐劑(笨曱酸鈉O. 25% ) 后分裝，10ml/瓶；
(8)分裝，獷C密封保存，即得所述的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子提取液。
實(shí)施例2:
抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備
(l)原材料的制備選健康無病史的6月齡豬10頭，用鴨瘟疫苗皮下注射免 疫，15天后，再免疫一次，方法劑同上。二次免疫后15-20天宰殺，取脾臟和 胸腺于水上，轉(zhuǎn)移置-2(TC保存，備用；
U)預(yù)處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪 組織，再用冷三蒸水洗滌干凈；
(3) 破碎將以上洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍 的條件下用高速組織搗碎機(jī)(1000r/min)搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
(4) 凍融將勻漿液(用器皿裝)至于超低溫冰箱(-8(TC)里快速冷凍，水浴 3 (TC中融化，交替凍融10次；
(5) 提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于水凍離心機(jī)離心 30min(4000r/min， 5°C),取上層液體(血紅色)，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
(6) 超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
(7) 除菌分別用無菌濾器(濾膜孔徑為O. 22um)加壓過濾；
(8) 包裝:按注射劑液的要求，加標(biāo)準(zhǔn)防腐劑(苯曱酸鈉O. 25%)后分裝，2ml/
瓶；
(9) 保存4。C密封貯存。 實(shí)施例3:
對(duì)本發(fā)明所述工藝制備的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的檢測(cè)
對(duì)實(shí)施例l所述工藝制備的抗鴨痘轉(zhuǎn)移因子(下稱"本品")進(jìn)行以下檢測(cè)(1) 紫外線分光光度測(cè)定本品在250. 0 - 252. Onm處有一高吸收峰，且 ABS260/ABS280>2. 0。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)液為淡黃色,pH值在6. 0-6. 5之間。
(3) 20%磺基水楊酸檢測(cè)本品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白反應(yīng)均為陰性， 其不含大分子蛋白質(zhì)。
(4) 多肽含量測(cè)定本品經(jīng)雙縮脲法測(cè)定多肽含量為l. 130mg/ml。
(5) 核酸含量測(cè)定本品經(jīng)地衣酚法測(cè)定核酸含量為602. 78 u g/ml。
(6) 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)本品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
(7) E -玫瑰花結(jié)形成率比較鴨外周血淋巴細(xì)胞表面者鼠紅細(xì)胞受體，并能 與之結(jié)合形成E -玫瑰花結(jié)。而轉(zhuǎn)移因子對(duì)淋巴細(xì)胞和大鼠紅細(xì)胞的結(jié)合有一 定的促進(jìn)作用。本品的E -玫瑰花結(jié)形成率平均為31. 9%,比對(duì)照組的增加 25. 9%(P< 0. 01)。
(8) 取健康小白鼠5只，口服本品濃縮液，相當(dāng)于正?？诜簞┝康?0倍， 觀察小白鼠的生存能力變化，結(jié)果無任何毒性反應(yīng)，也無死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，說 明本品是安全的，無任何毒性和副作用。
(9) 用PPD做家兔皮試實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)本品具有轉(zhuǎn)移免疫活性的功能。
(10) 用鴨痘抗原做皮試檢測(cè)，有微弱的陽性反應(yīng)，說明本品具有良好的轉(zhuǎn)移 活性和特異性。
除上迷糖漿劑型外，本發(fā)明所述的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子還可制成其他口服液。 此外，通過常規(guī)凍干工藝進(jìn)一步可得到抗鴨瘋轉(zhuǎn)移因子的粉末，結(jié)合常規(guī)
權(quán)利要求
1.一種抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行(1)制備病毒抗原將鴨瘟接種于10天齡鴨胚尿囊液，33℃下48-96小時(shí)，取鴨胚尿囊液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；(2)提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)鴨瘟的分子量確定鴨瘟所在離心管位置，吸出備用；(3)用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng)物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-20℃保存，備用；(4)從免疫豬中提取抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子①原材料的制備及預(yù)處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；②破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；③凍融將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；④提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機(jī)于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；⑤超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；⑥除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0.22um的濾膜加壓過濾除菌；⑦分裝4℃密封保存，即得所述的抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子提取液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然高效純生物活性物質(zhì)抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明按照以下步驟進(jìn)行將鴨瘟接種于10天齡雞胚尿囊液制備病毒抗原；提取病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫豬；從免疫豬中提取抗鴨瘟轉(zhuǎn)移因子。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防鴨瘟、能夠保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受鴨瘟病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101293915SQ20081005354
公開日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請(qǐng)人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司