專利名稱：一種抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物及其制劑領域，更具體地說，是涉及一種抗雞傳染性支氣 管炎病毒轉移因子的制備方法。
背景4支術
雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的一種急性、高度接觸性
傳染病。本病冬春多發(fā)，臨床主要表現(xiàn)呼吸障礙，雛雞最易感，死亡率較高； 成雞感染可使產(chǎn)蛋率顯著下降，造成重大經(jīng)濟損失。生產(chǎn)中須采取綜合性措施 防治才行。
本病各種日齡的雞均可發(fā)病，但以雛雞發(fā)病最為嚴重，發(fā)病率較高，死亡 率通常為20. 0% ~25. 0%。其中，呼吸道病變型以6周齡以下雞發(fā)病最嚴重， 腎病變型多發(fā)于3 6周齡，腺胃病變型多發(fā)于5 11周齡。飼養(yǎng)管理不善、飲 水不足、祠料營養(yǎng)配比不當、過量使用磺胺類藥物等，均會使雞感病性增強， 發(fā)病率增大。病雞主要通過呼吸道分泌物排出病毒，經(jīng)空氣傳播；被病毒污染 的蛋、飼料、飲水、用具等也會傳染。本病除經(jīng)水平傳播外，還可經(jīng)卵垂直傳 播，雞場一旦發(fā)生本病，很容易造成連年發(fā)生。
本病的潛伏期短，自然感染2 4天即可發(fā)病。臨床主要有3種病變型，呼 吸道病變型主要表現(xiàn)呼吸障礙、病雞咳嗽、打噴-定、呼吸出現(xiàn)鑼音；腎病變型， 病雞全身皮膚發(fā)紺，驟然嚴重下痢，排出的稀糞中帶有大量白色尿酸鹽；腺胃 病變型，主要特征是生長停滯，迅速消瘦，頻頻下痢。
盡管目前已經(jīng)有一些抗雞傳染性支氣管炎病毒的藥品或制劑但是由于現(xiàn) 有藥品制劑的針對性不強，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應用 的，不能起預防作用。對于雞傳染性支氣管炎病的易感雞群，每年定期對雞接種雞傳染性支氣管炎疫苗是預防雞傳染性支氣管炎的有效方法。其次應增強營 養(yǎng)或藥物干預，提高自身免疲力。通過藥物提高機體抵杭力或調節(jié)免疫力也是 一種預防雞傳染性支氣管炎的有效方法，轉移因子可起到此作用。
轉移因子(TF, Transfer Factor)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信 息的低分子量多肽-核苷酸復合物，它能將供體的某種特定的細胞免疫功能特 異地轉移給受體正常的淋巴細胞，參與機體的免疫反應，^提高受體才幾體的細胞 免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細菌性感染；同時促進B:^巴細胞的抗體分泌作 用，能夠誘導細胞釋放干擾素和白介素，從而增強受體的免疫功能。
目前已報道的轉移因子的提取方法大多是關于非特異性轉移因子的制備 方法。例如，中國發(fā)明專利申請"制備轉移因子的工藝方法一一全濾法"(專利 申請?zhí)?00310118439. 6)則公開了采用壓濾、超濾、納濾幾種方法連續(xù)過濾的 制備工藝。另一份中國發(fā)明專利申請"制備轉移因子的工藝方法一一加熱 法，，(專利申請?zhí)?00410039444. 2)是由同 一申請人在前一份申請的基礎上加 上加熱處理的步驟，仍然是連續(xù)釆用多種過濾法的制備工藝。上述專利申請的 內(nèi)容是對破碎后的組織經(jīng)冷凍離心后直接進行過濾提取，同樣存在細胞破碎不 完全的缺陷，而且其工藝煩瑣，時間較長，對產(chǎn)物的活性損失也較大，因此得 率很難提高。
豬脾臟和胸腺是免疫活性細胞聚集的場所，而且材料來源非常廣泛，因此 從這類細胞中提取特異性轉移因子，有重要的理論意義和現(xiàn)實意義，但目前尚 未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種天 然高效純生物活性物質抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法。
本發(fā)明抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法，'按照以下步驟進行 (l)制備病毒抗原將雞傳染性支氣管炎病毒接種于10天齡雞胚尿嚢液，33°C 下48 - 72小時，取雞胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打石爭，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；
(2) 提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗 原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15。/。、 30%、 45°/。及60%的蔗糖制備的 不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉/分3小時，根據(jù)雞傳染性支氣 管炎病毒的分子量確定雞傳染性支氣管炎病毒所在離心管位置，吸出備用；
(3) 用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原， 用上述提取病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全 佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內(nèi)或 皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔 一周，最后一次免疫7-IO天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢 測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾 臟和胸腺于冰上，轉移至-2(TC保存，備用；
(4) 從免疫豬中提取抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子
① 原材料的制備及預處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結組織，用 冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；
② 破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條 件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；
③ 凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴30。C中融化，交替凍融4-6 次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；
④ ^是取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于水凍離心機于5。C以4000r/min離 心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
(D超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；
⑥ 除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0. 22 u m的濾膜加壓過濾除菌；
⑦ 分裝4。C密封保存，即得所述的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子4是 取液。
本發(fā)明 一種抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法，具有以下憂點
(1) 原材料來源容易，無污染，價廉。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料。
(2) 破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在30。C下溶解，不使小 分子物質活性喪失，并能夠使雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子得以充分地提 取。
(3) 工藝采用了比較先進的中空纖維超濾膜超過濾法，從而縮短了制備時 間，保證物質分離過程中活性不被破壞。
(4) 提取物經(jīng)生化測定和若干成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復合 物，是一種不含蛋自質、可溶的小分子物質，分子量在60.00道爾頓以下。經(jīng)體 內(nèi)外生物活性試驗以及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、免疫活性強、起 效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應等特點，其療效確切，安全可靠， 既可治療又可增強抗病能力。該提取物可做成口服液等劑型，便于應用。
本發(fā)明的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子可以全面或部分抑制雞傳染 性支氣管炎病毒，能保護正常機體細胞免受病毒感染。因此使用本發(fā)明的轉移 因子可以起到預防雞傳染性支氣管炎病毒感染、能夠保護正常機體細胞免受雞 傳染性支氣管炎病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時對于遭到雞傳染性支 氣管炎病毒感染的雞使用轉移因子進行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治 愈率、降低死亡率。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。 實施例l:
抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備
1. 制備病毒抗原將雞傳染性支氣管炎病毒接種于10天齡雞胚尿嚢液，33 X:下48 - 72小時，取雞胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心 20分鐘，棄去沉渣留上清；
2. 取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化4是取病^^抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15%、 30%、 45°/。及60%的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度 離心管，超速離心，165000轉/分3小時，根據(jù)不同病毒的分子量確定該病毒 所在離心管位置，吸出備用；
3.用上述提取的病毒抗原免疫豬用上述提取病毒抗原皮下多點注射免疫 豬，共免疫4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以 高速組織勻漿機打勻，在動物皮內(nèi)或皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動 物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-IO天后取動物靜脈 血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒 特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉移至-2(TC保存，備 用；
4.從免疫豬中提取抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子 (1 )原材料的制備及預處理將病毒免疫豬的脾及淋巴結組織，用冷三蒸 水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；
(2) 破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的 條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
(3) 凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴30。C中融化，交替凍融4-6 次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿賴、晬；
(4 )提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5 。C以4000r/min 離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，.取濾液；
(5 )超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6 0 0 0道爾頓的轉移因子；
(6) 除菌將超濾得到的濾液用孔徑為O. 22 u m的濾膜加壓過濾除菌；
(7) 包裝:按口服液的要求，加15%的糖漿，加標準防腐劑(笨曱酸鈉O. 25%) 后分裝，10ml/瓶；
(8) 分裝，4。C密封保存，即得所述的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子提 取液。實施例2:
抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備
(1) 原材料的制備:選健康無病史的6月齡豬10頭，用雞傳染性支氣管炎病毒 疫苗皮下注射免疫，15天后，再免疫一次，方法劑同上。二次免疫后15-20天 宰殺，取脾臟和胸腺于水上，轉移置-2(TC保存，備用；
(2) 預處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪 組織，再用冷三蒸水洗滌干凈；
(3) 破碎將以上洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍 的條件下用高速組織搗碎才幾(1000r/min)搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；
(4) 凍融將勻漿液(用器皿裝)至于超低溫水箱(-80°C)里快速冷凍，水浴 30 。C中融化，交替凍融10次；
(5) ^是:加入3倍體積的冷生理鹽水，置于;水凍離心才幾離心 30min(4000r/min， 5°C),取上層液體(血紅色)，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
(6) 超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；
C7)除菌分別用無菌濾器(濾膜孔徑為O. 22um)加壓過濾；
(8) 包裝:按注射劑液的要求，加標準防腐劑(苯甲酸鈉O. 25%)后分裝，2ml/
瓶；
(9) 保存4。C密封貯存。 實施例3:
對本發(fā)明所述工藝制備的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的檢測
對實施例l所述工藝制備的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子(下稱"本 品")進行以下檢測
(l)紫外線分光光度測定本品在250. 0 - 252. Onm處有一高吸收峰，且 ABS260/ABS280>2. 0。
U)標準液為淡黃色，pH值在6. G - 6. 5之間。(3) 20°/?；腔畻钏釞z測本品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白反應均為陰性，
其不含大分子蛋白質。
(4) 多肽含量測定本品經(jīng)雙縮脲法測定多肽含量為l. 60mg/ml。
(5) 核酸含量測定本品經(jīng)地衣酚法測定核酸含量為657. 56 u g/ml。
(6) 細菌學檢測本品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
(7) E -玫瑰花結形成率比較雞外周血淋巴細胞表面有鼠紅細胞受體，并能 與之結合形成E -玫瑰花結。而轉移因子對淋巴細胞和大鼠紅細胞的結合有一 定的促進作用。本品的E-玫瑰花結形成率平均為35. 0%,比對照組的增加 26. 7%(P<0. 01)。
(8) 取健康小白鼠5只，口服本品濃縮液，相當于正?？诜簞┝康?0倍， 觀察小白鼠的生存能力變化，結果無任何毒性反應，也無死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，說 明本品是安全的，無任何毒性和副作用。
(9) 用PPD做家兔皮試實驗，發(fā)現(xiàn)本品具有轉移免疫活性的功能。 加)用雞傳染性支氣管炎病毒抗原做皮試檢測，有微弱的陽性反應，說明本
品具有良好的轉移活性和特異性。
除上述糖漿劑型外，本發(fā)明所述的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子還可 制成其他口服液。
此外，通過常規(guī)凍干工藝進一步可得到抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子 的粉末，結合常規(guī)輔料，可制成膠嚢、片劑等劑型。
權利要求
1.一種抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行(1)制備病毒抗原將雞傳染性支氣管炎病毒接種于10天齡雞胚尿囊液，33℃下48-72小時，取雞胚尿囊液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；(2)提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉/分3小時，根據(jù)雞傳染性支氣管炎病毒的分子量確定雞傳染性支氣管炎病毒所在離心管位置，吸出備用；(3)用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內(nèi)或皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉移至-20℃保存，備用；(4)從免疫豬中提取抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子①原材料的制備及預處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結組織，用冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；②破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；③凍融將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；④提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；⑤超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；⑥除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0.22um的濾膜加壓過濾除菌；⑦分裝4℃密封保存，即得所述的抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子提取液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然高效純生物活性物質抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子的制備方法。本發(fā)明按照以下步驟進行將雞傳染性支氣管炎病毒接種于10天齡雞胚尿囊液制備病毒抗原；提取病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫豬；從免疫豬中提取抗雞傳染性支氣管炎病毒轉移因子。因此使用本發(fā)明的轉移因子可以起到預防雞傳染性支氣管炎病毒感染、能夠保護正常機體細胞免受雞傳染性支氣管炎病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。
文檔編號C07K1/34GK101293913SQ20081005354
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權日2008年6月17日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請人:天津生機集團股份有限公司