本發(fā)明涉及dna重組技術(shù)，具體涉及一種aqp1過表達(dá)質(zhì)粒及其在影響乳腺癌細(xì)胞耐藥性上的用途。

背景技術(shù)：

水通道蛋白（aquaporins,aqps）是一類小分子跨膜蛋白，廣泛分布于原核生物和真核生物的細(xì)胞膜中，能夠介導(dǎo)水和其他溶質(zhì)小分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。水通道蛋白家族共有13個(gè)成員，即aqp0-aqp12，可以被劃分為3大類：（1）傳統(tǒng)水通道蛋白，包括aqp0，aqp1，aqp2，aqp4，aqp5，aqp6和aqp8，這類水通道蛋白只對(duì)水有滲透性；（2）甘油水通道蛋白，包括aqp3，aqp7，aqp9和aqp10，這類蛋白不止對(duì)水分子有通透作用，還對(duì)甘油，尿素和一些單羧酸鹽有通透作用；（3）超水通道蛋白，包括aqp11和aqp12，該類蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)中，可能參與細(xì)胞內(nèi)的水轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器體積和內(nèi)囊體水平衡的調(diào)節(jié)。水通道蛋白廣泛分布于泌尿系統(tǒng)，消化系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)尿液濃縮和稀釋，腺體分泌，脂肪代謝，腦脊液形成，神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等，aqps功能失常與多種疾病相關(guān)，比如腎性尿崩癥，腦水腫，脂肪肝等。并且隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)水通道蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也具有密不可分的關(guān)系。

aqp1是最早被發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白，aqp1基因位于人染色體7p14，分子大小為28kd。aqp1在細(xì)胞膜上主要以四聚體形式存在，每個(gè)單體是1條含269個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，每個(gè)單體均有獨(dú)立的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能。aqp1單體包含6個(gè)跨膜螺旋（ⅰ-ⅵ）和5個(gè)連接螺旋的環(huán)（a-e），其中a環(huán)，c環(huán)和e環(huán)定位于胞質(zhì)外側(cè)，b環(huán)和d環(huán)及肽鏈的n末端和c末端均位于胞質(zhì)內(nèi)側(cè)。胞內(nèi)側(cè)的b環(huán)與胞外側(cè)的e環(huán)分別含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（npa）序列，各自折疊成短的α螺旋嵌入細(xì)胞膜內(nèi)且相對(duì)形成180°，構(gòu)成運(yùn)水通道的核心部位，并與靠近四聚體中心的4個(gè)α螺旋構(gòu)成完整通道，形成“沙漏模型”結(jié)構(gòu)。aqp1能選擇性地通過大量的水，而不允許其它離子或分子通過。

在泌尿系統(tǒng)中，aqp1分布于腎臟近曲小管的頂質(zhì)膜和基底膜，主要參與近曲小管的液體重吸收過程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，aqp1在脈絡(luò)上皮細(xì)胞表達(dá)，參與腦脊液的形成與流動(dòng)，在脊髓背角淺層神經(jīng)元中，aqp1參與神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)。在消化系統(tǒng)中，aqp1在肝細(xì)胞，胰細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，參與脂肪代謝，腺體分泌等過程。

近年來有研究表明，aqp1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括膽管癌、膀胱癌、腦瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、鼻咽癌、前列腺癌等，并參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程。aqp1在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程中起重要作用，還可以調(diào)節(jié)腫瘤的血管生成。

由于水通道蛋白本身對(duì)于液體的分泌與吸收的作用，加上其在腫瘤進(jìn)展過程中有著不可替代的作用，所以水通道蛋白成為腫瘤新的藥物治療靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所提出的一種aqp1過表達(dá)質(zhì)粒及其在影響乳腺癌細(xì)胞耐藥性上的用途，目的在于提供一種新的乳腺癌細(xì)胞表阿霉素敏感性的影響因素，為下一步研制抗癌藥物，尤其是乳腺癌，奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種aqp1過表達(dá)質(zhì)粒，在pcdh-cmv-mcs-ef1-puro質(zhì)粒上整合3×flag核苷酸序列及aqp1核苷酸序列。

所述3×flag核苷酸序列前端設(shè)置有atg起始密碼子。

所述aqp1過表達(dá)質(zhì)粒在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)。

一種上述aqp1過表達(dá)質(zhì)粒在影響乳腺癌細(xì)胞耐藥性上的用途。

aqp1過表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性。

本發(fā)明獲得了如下有益效果：

本發(fā)明為研究aqp1影響腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)本發(fā)明提供了一種新的影響乳腺癌細(xì)胞表阿霉素敏感性的因素，也為下一步研制抗癌藥物，尤其是乳腺癌，奠定理論基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明pcdh-p-3×flag-aqp1重組質(zhì)粒圖譜；

圖2是本發(fā)明westernbloting檢測(cè)pcdh-p-3×flag-aqp1重組質(zhì)粒表達(dá)情況圖；

圖3是本發(fā)明pcdh-p-3×flag-aqp1慢病毒質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞表阿霉素敏感性的影響圖。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案及其所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果，下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。

1.pcdh-p-3×flag-aqp1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

原始質(zhì)粒：pcdh-cmv-mcs-ef1-puro（購自sbi公司）

（1）合成帶有3×flag序列的核苷酸序列，正向反向各一：

上游序列：

5’-ctagaatggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaagg-3’

下游序列：

5’-ctagccttgtcatcgtcatccttgtagtcgatgtcatgatctttataatcaccgtcatggtctttgtagtccatt-3’

其中3×flag序列前面加上atg起始密碼子以及xbai酶切位點(diǎn)序列（t︱ctaga），后端加入nhei酶切位點(diǎn)序列（g︱ctagc）。

（2）采用oligo寡核苷酸序列退火后，形成雙鏈dna目的片段，得出兩端帶有xbai（t︱ctaga）和nhei（g︱ctagc）酶切位點(diǎn)的dna序列。

（3）使用限制性內(nèi)切酶xbai-hf和nhei-hf酶切原始質(zhì)粒pcdh-cmv-mcs-ef1-puro，使該載體形成兩個(gè)粘性末端（xbai和nhei）。

（4）使用t4連接酶將載體與退火形成的核苷酸序列連接，并將該質(zhì)粒命名為pcdh-p-3×flag-vector。

（5）使用pcr技術(shù)，將aqp1dna序列（nm_198098.3）兩端擴(kuò)增出帶有nhei（g︱ctagc）和noti（gc︱ggccgc）酶切位點(diǎn)的dna序列。

（6）使用限制性內(nèi)切酶nhei-hf和noti-hf分別雙酶切末端帶有nhei和noti酶切位點(diǎn)的aqp1dna序列和pcdh-p-3×flag-vector載體序列，得到帶有兩種酶粘性末端的aqp1dna片段和pcdh-p-3×flag-vector。

（7）用t4連接酶將兩者連接，得到pcdh-p-3×flag-aqp1重組載體（重組質(zhì)粒圖譜參見圖1）。

2.pcdh-p-3×flag-aqp1重組質(zhì)粒的表達(dá)

2.1慢病毒的構(gòu)建

（1）在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在10cmdish中鋪適量hek-293t細(xì)胞，待次日細(xì)胞匯合度達(dá)到70%；

（2）將包裝質(zhì)粒△r和pvsvg各10μg，pcdh-p-3×flag-aqp1慢病毒質(zhì)粒20μg，2mcacl275μl，適量體積的ddh2o，以及2×hbs600μl加于1.5ml的離心管中充分混勻，使其終體積為1.2ml；

（3）室溫靜置5min后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中；

（4）培養(yǎng)5-6h后，將培養(yǎng)液換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

（5）培養(yǎng)48h后，觀察熒光，并收集病毒，3000g，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至新管。

2.2慢病毒的感染

（1）感染mda-mb-231細(xì)胞前，在6孔板中鋪種細(xì)胞，使感染前細(xì)胞匯合到20-30%，37℃，5%co2孵箱培養(yǎng)過夜；

（2）感染時(shí)，37℃融化病毒儲(chǔ)存液，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1000μl病毒液，1000μl細(xì)胞培養(yǎng)液和2μlpolybrene(10mg/ml)；

（3）將細(xì)胞放入37℃，5%co2孵箱中培養(yǎng)，4-5h后棄去含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2ml新鮮培養(yǎng)液；

（4）次日早上換2ml新鮮的培養(yǎng)液，感染48h后，開始藥篩（2μg/ml的嘌呤霉素）；

（5）藥篩維持一周后western檢測(cè)感染效率。

westernbloting檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明aqp1在mda-mb-231中過表達(dá)（參見圖2）。

3.pcdh-p-3×flag-aqp1慢病毒質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞表阿霉素敏感性的影響

（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)對(duì)照組細(xì)胞vector/mda-mb-231與過表達(dá)組細(xì)胞aqp1/mda-mb-231兩種細(xì)胞，并將兩種細(xì)胞接種到24孔板中，每種細(xì)胞設(shè)2個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（加入培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜）。

（2）待細(xì)胞貼壁后第二天給藥。表阿霉素（0，0.01，0.1，0.4，1，10μg/ml）。

（3）藥物處理48h后，用槍吸干凈當(dāng)天測(cè)量孔的原培養(yǎng)液，將配好的mtt儲(chǔ)存液（5mg/ml）用新鮮培養(yǎng)液1:10稀釋，計(jì)算好總量（要富余出一個(gè)孔的量），每孔均分500ul混合液，中間最好不要換槍頭，5%co2，37℃孵育4小時(shí)。

（4）4小時(shí)后，用槍將孔內(nèi)的液體吸干凈，注意不能破壞孔內(nèi)的紫色結(jié)晶。再向每孔內(nèi)加入500μldmso，從開始加dmso計(jì)時(shí)，前后左右水平晃動(dòng)24孔板5min，使結(jié)晶物充分溶解。5min后，將24孔板內(nèi)待測(cè)孔的液體轉(zhuǎn)移到96孔板中（注意不能觸摸96孔板底部），24孔板的一個(gè)孔對(duì)應(yīng)96孔板的3個(gè)孔，每孔150ul，用酶標(biāo)儀檢測(cè)od570nm各孔的吸光度值。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用表阿霉素（epirubicin）分別處理對(duì)照組細(xì)胞系vector/mda-mb-231及過表達(dá)aqp1的細(xì)胞aqp1/mda-mb-231，mtt檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aqp1過表達(dá)的細(xì)胞對(duì)表阿霉素更敏感（參見圖3）。