專利名稱：：一種利用體細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備高表達(dá)人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因山羊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域，特別涉及一種乳腺特異性表達(dá)融合基因，含該基因的載體和細(xì)胞，乳汁可高效表達(dá)rhLF的轉(zhuǎn)基因山羊，以及一種制備乳腺生物反應(yīng)器的方法。
背景技術(shù)：
：人乳鐵蛋白(HumanLactoFerrin,hLF)是一種鐵離子結(jié)合糖蛋白，在人體內(nèi)分布很廣，于人乳的初乳中含量最豐富，濃度可達(dá)6g/L，在哺乳期乳汁中濃度為12g/L，它還存在于淚液、汗液、唾液、腸粘液、鼻和生殖器等分泌物中，以及成熟的中性粒細(xì)胞顆粒中。人乳鐵蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)，具有廣譜抗菌作用，能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的平衡，調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的生成，促進(jìn)細(xì)胞的生長，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，因此人乳鐵蛋白在治療、營養(yǎng)補(bǔ)充、食品及化妝品和藥品的防腐等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。人們?cè)?jīng)嘗試用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵等傳統(tǒng)方法表達(dá)重組人乳鐵蛋白(rhLF)，但均因蛋白表達(dá)量低或生產(chǎn)成本高或純化過程復(fù)雜等缺點(diǎn)，未能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。目前，rhLF在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物中得到了成功表達(dá)。其中，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器(MammaryGlandBioreactor)具有產(chǎn)量高、成本低、純化簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，倍受重視。利用乳腺特異性表達(dá)載體來獲得乳腺特異表達(dá)的蛋白己有諸多研究，如Simmons，J.P.etal.(1987)Nature328:530-532報(bào)道了利用顯微注射的方法制備含山羊(3-乳球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠；含od-抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因綿羊(Simmons，J.P.,etal.(1989)Bio/Technology6:179-183);含大鼠P-酪蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠等(Lee,eta1.(1988)Nucl.AcidsRes.l6:1027-1041.)。另外，一些與乳腺特異性表達(dá)外源蛋白有關(guān)的專利也相繼出版，如PCTNo.WO88/00239描述了乳清蛋白特異性啟動(dòng)子調(diào)控凝血因子IX的表達(dá)等。PCTNo.6140552詳細(xì)全面的闡述了采用不同乳蛋白調(diào)控區(qū)調(diào)控外源蛋白的組合表達(dá)情況。該專利中，采用16kb的牛as15調(diào)控區(qū)及8kb的牛as13調(diào)控區(qū)及人乳鐵蛋白cDNA的組合，獲得了rhLF最高表達(dá)量為0.2mg/ml的轉(zhuǎn)基因小鼠；采用同樣的調(diào)控區(qū)來調(diào)控人乳鐵蛋白基因組DNA，獲得了rhLF最高表達(dá)量為8.7mg/ml的轉(zhuǎn)基因小鼠，采用8kb的牛BLG5調(diào)控區(qū)來調(diào)控人乳鐵蛋白基因組DNA的表達(dá)，獲得了rhLF最高表達(dá)量為27mg/ml的轉(zhuǎn)基因小鼠。從該專利可知人乳鐵蛋白基因組DNA相比乳鐵蛋白cDNA，更有可能獲得較高的表達(dá)量。迄今為止，可利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)有生物活性的重組人乳鐵蛋白已有共識(shí)。在利用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行調(diào)控框架研究的基礎(chǔ)上，荷蘭的Pharming公司首次獲得了人乳鐵蛋白表達(dá)量為lg/L的轉(zhuǎn)基因牛。2005年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授利用含人乳鐵蛋白基因組的BAC獲得表達(dá)rhLF的轉(zhuǎn)基因牛，最高達(dá)3.4g/L。然而，利用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)rhLF尚存在一些缺陷,如繁殖速度慢(初配年齡在1.52歲，孕期達(dá)280天)和存在潛在的安全性問題(如可能攜帶有感染人的瘋牛病病毒，能夠引起兒童過敏反應(yīng))等。反之，山羊作為載體的優(yōu)點(diǎn)有(1)繁殖速度快(57月齡即可性成熟，孕期150天)；(2)產(chǎn)乳量大(單只年產(chǎn)奶量達(dá)750L);(3)圈養(yǎng)方便和安全性高等。至今尚無山羊瘙癢病毒傳染人的報(bào)道,且轉(zhuǎn)基4因山羊乳汁中表達(dá)的蛋白己有被批準(zhǔn)為人用藥物的先例。因此，目前還有必要進(jìn)一步研究利用山羊乳腺生物反應(yīng)器高表達(dá)rhLF的方法，以及制備乳腺高表達(dá)乳鐵蛋白的動(dòng)物，以期進(jìn)一步提高乳鐵蛋白的產(chǎn)量，降低乳鐵蛋白生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供-種乳腺特異性表達(dá)融合基因，含該基因的載體和細(xì)胞，乳汁可高效表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊，以及制備乳腺生物反應(yīng)器的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種乳腺特異性表達(dá)融合基因，該融合基因從5至3依次包含以下操作性相連的元件山羊e-酪蛋白基因(e-casein)5調(diào)控序列，人乳鐵蛋白(hLF)基因序列，牛生長激素多聚A(BghPA)序列，山羊(3-酪蛋白基因3序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的人乳鐵蛋白基因序列(也稱為小基因序列)包含人乳鐵蛋白cDNA序列，人乳鐵蛋白內(nèi)含子15序列。在另一優(yōu)選例中，所述的人乳鐵蛋白小基因序列具有(a)SEQIDNO:l中第3824-7125所示的基因序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的DNA序列雜交且編碼人乳鐵蛋白的基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的人乳鐵蛋白具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的山羊P-酪蛋白基因5調(diào)控序列(3.8kb)從5至3依次包含山羊P-酪蛋白基因5側(cè)冀序列，和外顯子l、外顯子2非編碼序列；或所述的山羊e-酪蛋白基因3序列(3.2kb)包含山羊P-酪蛋白外顯子6-9序列。在另一優(yōu)選例中，所述的山羊e-酪蛋白基因5側(cè)冀序列包含山羊P-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-3817-l(kb)位。在另一優(yōu)選例中，所述的山羊P-酪蛋白基因5調(diào)控序列具有(i)SEQIDNO:l中第1-3817位所示的基因序列；或(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的DNA序列雜交且具有與(i)的序列相同調(diào)控作用的基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的5調(diào)控序列如下制備以SEQIDNO:4，和SEQIDNO:5為引物，以山羊基因組為模板PCR擴(kuò)增克隆至pGEM-TEASY載體上，HindIII，Xhol雙酶切回收約3.8kb產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的山羊e-酪蛋白基因3序列具有(l)SEQIDNO:l中第8598-11819位所示的基因序列；或(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且具有與(l)的序列相同調(diào)控作用的基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的山羊e-酪蛋白基因3序列包含山羊e-酪蛋白基因1003813259(kb)位。在另一優(yōu)選例中，所述的3序列如下制備以SEQIDNO:6，和SEQIDNO:7為引物，以山羊基因組為模板PCR擴(kuò)增，收集約3.2kb產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的牛生長激素多聚A具有(A)SEQIDNO:1中第7134-7365位所示的基因序列；或(B)在嚴(yán)格條件下與(A)限定的DNA序列雜交且具有與(A)的序列相同調(diào)控作用的基因序列。在另一優(yōu)選例中，在牛生長激素多聚A序列和山羊(3-酪蛋白基因3序列之間還包含一抗性標(biāo)記基因。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性標(biāo)記基因是新霉素(Neo)抗性基因。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性標(biāo)記基因具有SEQIDNO:1中第7769-8550位所示的基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的融合基因基本上由山羊P-酪蛋白基因5調(diào)控序列，人乳鐵蛋白小基因序列，牛生長激素多聚A序列，抗性標(biāo)記基因，山羊(3-酪蛋白基因3序列構(gòu)成。各元件之間可以存在用于連接的序列，如酶切位點(diǎn)的序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種表達(dá)載體，該載體含有所述的融合基因。在本發(fā)明的第三方面，提供一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體，或其基因組中整合有所述的融合基因。在本發(fā)明的第四方面，提供一種制備高產(chǎn)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，它包括步驟(a)將所述的融合基因轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；(b)將(a)獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得可高產(chǎn)rhLF的動(dòng)物。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，所述的體細(xì)胞為動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物為山羊、綿羊、牛、豬、兔。更佳的，所述的動(dòng)物為山羊。在本發(fā)明的第五方面，提供一種生產(chǎn)rhLF的方法，它包括步驟-培養(yǎng)所述方法制得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從動(dòng)物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達(dá)的rhLF。另一方面，還提供一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁，它含有濃度5-100mg/ml的rhLF，更特別的含有濃度為10-50mg/ml的rhLF。圖l是載體pBSK-BC的構(gòu)建流程圖。圖2是人乳鐵蛋白小基因(hLFmini)的構(gòu)建流程圖。圖3是人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pBSK-BC-hLF-Neo的構(gòu)建流程圖。圖4是人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體的主要結(jié)構(gòu)圖。圖5是轉(zhuǎn)染后篩選弁123號(hào)細(xì)胞克隆的PCR分析圖。泳道l、2、3為LF123細(xì)胞克隆分別用引物F8152和R9552、F6806和R8260、F6082和R7269擴(kuò)增出1.4kb，1.4kb，1.2kb的條帶；泳道4、5、6是正常羊以同樣引物擴(kuò)增結(jié)果，為陰性對(duì)照；泳道7,8，9是載體pBSK-BC-hLF-Neo以同樣引物擴(kuò)增結(jié)果，為陽性對(duì)照。圖6是轉(zhuǎn)染后篩選弁123號(hào)細(xì)胞克隆的Southern雜交圖。箭頭所指為#123細(xì)胞基因組經(jīng)Xhol酶切后，用hLF小基因進(jìn)行雜交，結(jié)果出現(xiàn)3.3kb的條帶，另一條帶為質(zhì)粒經(jīng)XhoI酶切后雜交所得陽性對(duì)照。圖7是LF123克隆羊初乳的SDS-PAGE電泳圖。其中，l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，2為正常羊乳，3為5ug的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，4-10分別為產(chǎn)后每隔2天的羊乳經(jīng)20倍稀釋后上樣，每孔上樣2ul。圖8是LF123克隆羊及正常羊乳的SDS-PAGE電泳圖。其中，l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，2為正常羊乳，3為5"g的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，4-10分別為產(chǎn)后第5天起，每3天收集一次的羊乳，經(jīng)20倍稀釋后上樣，每孔上樣2ul。圖9是LF123克隆羊羊乳的Western-blot檢測(cè)圖。其中，l-4為原奶稀釋400倍后取4nL、3pL、2nL和l^L上樣；5-8為400ng、300ng、200ng和100ng的hLF標(biāo)準(zhǔn)品上樣。圖10為LF123克隆羊羊乳ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖ll為離子交換柱純化重組人乳鐵蛋白時(shí)的梯度洗脫圖。其中，A為鹽濃度梯度洗脫時(shí)的峰形圖，l為鹽濃度變化圖，2為光吸收值；B為所收集的各樣品SDS-PAGE結(jié)果，樣品1為乳清，2為峰1處收集液，3為峰2處收集液；C示nhLF與B中樣品3的Western-blot結(jié)果。圖12為質(zhì)譜法測(cè)rhLF分子量。圖13為等電聚焦法測(cè)rhLF的等電點(diǎn)。圖14為rhLF去糖基處理后分子量變化。其中，泳道1和3是糖苷酶處理前，rhLF和nhLF的分子量；泳道2和4是糖苷酶處理后，rhLF和nhLF的分子量。圖15為nhLF及rhLF的鐵結(jié)合特性。圖16為nhLF及rhLF的鐵釋放特性。圖17為rhLF的鐵釋放可逆性。圖18為鐵結(jié)合釋放后乳鐵蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果及WESTERN-BLOT檢測(cè)結(jié)果。A為SDS-PAGE結(jié)果，25依次為rhLF、鐵結(jié)合rhLF、鐵釋放rhLF和天然hLF。B為Western-blotting結(jié)果，樣品依次為天然hLF、鐵釋放rhLF、鐵結(jié)合rhLF和rhLF。圖19為rhLF對(duì)四種臨床分離菌株的抑制率圖。圖20為乳腺特異性表達(dá)載體pBCl-hLF主要結(jié)構(gòu)圖。圖21為乳腺特異性表達(dá)載體pBLG-hLF主要結(jié)構(gòu)圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將依次包含山羊e-酪蛋白基因5調(diào)控序列、人乳鐵蛋白小基因序列、牛生長激素多聚A(BghPA)序列、山羊(3-酪蛋白基因3序列的融合基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，將該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可獲得乳汁中高表達(dá)rhLF(達(dá)到或高于20mg/ml)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。并且，表達(dá)的rhLF與天然人乳鐵蛋白大小一致，具有相同或相似的免疫學(xué)及生物學(xué)活性。如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如山羊e-酪蛋白基因5調(diào)控序列和3序列被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得目的基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)受到該區(qū)域的調(diào)控。如本文所用，所述的"高表達(dá)rhLF"是指轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中rhLF的含量高于一般的動(dòng)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的"高表達(dá)rhLF"是指乳汁中rhLF的含量高于5mg/ml;較佳的高于10mg/ml;更佳的高于20mg/ml。如本文所用，術(shù)語"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由構(gòu)成"、"基本上由構(gòu)成"、和"由構(gòu)成"。7由于乳鐵蛋白基因組長度約28kb左右，再加上調(diào)控區(qū)的序列，使得整個(gè)基因構(gòu)件操作起來較為困難。為了獲得乳汁中高表達(dá)rhLF的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，本發(fā)明人反復(fù)比較了各種預(yù)計(jì)可用于調(diào)節(jié)hLF表達(dá)的功能性元件，最終找到了較佳的元件組合。該元件組合為以山羊e-酪蛋白基因5調(diào)控序列為乳腺特異表達(dá)的調(diào)控序列，以人乳鐵蛋白小基因序列為編碼基因，以牛生長激素多聚A序列為加尾信號(hào)，這些元件被可操作性地相連接。較佳地，在牛生長激素多聚A序列和山羊(3-酪蛋白基因3序列之間還包含一抗性標(biāo)記基因，用于抗性篩選。更佳地，所述的抗性標(biāo)記基因是新霉素抗性基因。在目的基因的選擇方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子對(duì)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有重要作用，其可能會(huì)含有增強(qiáng)子元件或其它順式調(diào)控序列，能夠同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而有效提高轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，或者其可能存在轉(zhuǎn)錄后依賴剪接的增強(qiáng)表達(dá)機(jī)制。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在人乳鐵蛋白的cDNA中插入乳鐵蛋白的內(nèi)含子15，可有效起到提高乳鐵蛋白表達(dá)量的效果。本發(fā)明提供了利用山羊P-酪蛋白相似的調(diào)控區(qū)調(diào)控乳鐵蛋白小基因及cDNA的對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在相似的調(diào)控區(qū)作用下，利用人乳鐵蛋白cDNA的表達(dá)量遠(yuǎn)低于發(fā)明所構(gòu)建的小基因的表達(dá)量。較佳的，所述的人乳鐵蛋白小基因序列具有SEQIDNO:l中第3824-7125位所示的核苷酸序列，編碼具有SEQIDNO:3所示序列的蛋白。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l的變異體，其編碼SEQIDNO:3的蛋白或該蛋白的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白的功能。在乳腺特異性表達(dá)調(diào)控區(qū)的選擇方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)山羊l3-酪蛋白基因有很強(qiáng)的表達(dá)活性，因此選擇其調(diào)控區(qū)來調(diào)控hLF表達(dá)。較佳的，所述的山羊P-酪蛋白基因5調(diào)控序列從5至3依次包含山羊P-酪蛋白基因5側(cè)冀序列，和外顯子l、外顯子2非編碼序列。其中，所述的山羊p-酪蛋白基因5側(cè)冀序列包含山羊e-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-3817-lkb的序列。本發(fā)明中采用上述約3.8kb的5調(diào)控序列是獲得高表達(dá)一個(gè)較為重要的因素。所述的山羊p-酪蛋白基因3序列包含山羊P-酪蛋白外顯子6-9序列，即山羊卜酪蛋白基因第1003813259位序列。本發(fā)明人還采用了牛生長激素PolyA來提高轉(zhuǎn)錄后乳鐵蛋白分子的的穩(wěn)定性。牛生長激素多聚A具有保護(hù)mRNA的穩(wěn)定性，增強(qiáng)翻譯活性的作用。一般乳腺特異性表達(dá)載體中功能基因的PolyA常來自于功能基因本身的PolyA或乳蛋白調(diào)控區(qū)的3側(cè)翼序列。而本發(fā)明中，選擇將牛生長激素PolyA加在人乳鐵蛋白功能基因之后，從而起到增強(qiáng)人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄后mRNA的穩(wěn)定性的作用，增強(qiáng)翻譯功能，為高表達(dá)提供了又一可能因素。本發(fā)明還涉及與上述的人乳鐵蛋白編碼序列(或山羊e-酪蛋白基因5調(diào)控序列、或牛生長激素多聚A序列、或山羊p-酪蛋白基因3序歹!])雜交且兩個(gè)序列之間具有至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與所述各多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(l)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，6(TC;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50。/。(vA0甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性8至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。'本發(fā)明還提供了含有前面所述的融合基因的重組表達(dá)載體。用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的原始載體沒有特別的限制，例如是pBluescriptIISK載體。本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的重組表達(dá)載體，或其基因組中整合有所述的融合基因。優(yōu)選的，所述的細(xì)胞是動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種制備高產(chǎn)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括(a)將所述的融合基因轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；(b)將(a)獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得可高產(chǎn)人乳鐵蛋白的動(dòng)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞為動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞。所述的動(dòng)物可以為山羊、綿羊、牛、豬、兔；較佳的是山羊。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述方法包括(l)構(gòu)建含有上述融合基因的乳腺特異性表達(dá)載體；(2)將表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)進(jìn)動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞；(3)抗性篩選獲得整合陽性細(xì)胞克??；(4)確證陽性細(xì)胞中整合外源基因的完整性；(5)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物；(6)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物自然泌乳，獲得乳汁中高表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)方法方面，最常用的是將獲得的合適的外源調(diào)控組合元件通過顯微注射受精卵的方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。但顯微注射的整合率極低，而且由于整合位點(diǎn)的不明確，可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)入基因不表達(dá)或極低水平表達(dá)。本發(fā)明通過將外源基因調(diào)控組合轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞中加入抗性基因篩選。只有抗性基因正常表達(dá)的細(xì)胞克隆才能生長，而抗性基因的表達(dá)至少可以說明含包含抗性基因的基因構(gòu)件整合于常染色質(zhì)區(qū)，能被正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，是功能基因得到表達(dá)的前提。同時(shí)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行整合檢測(cè)，確保外源基因完整的整合到細(xì)胞基因組中。最后將經(jīng)過抗性篩選，整合檢測(cè)無誤的細(xì)胞用于核移植，得到的克隆動(dòng)物外源基因的整合率為100%，大大提高了轉(zhuǎn)基因效率。同時(shí)，本方法還可以控制原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的性別，選擇雌性胎兒來制備動(dòng)物細(xì)胞，得到的含外源基因的克隆動(dòng)物即為母羊，可盡早進(jìn)行催乳以了解轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的表達(dá)情況，縮短高表達(dá)動(dòng)物的擴(kuò)群周期。更具體地，本發(fā)明人首先構(gòu)建了hLF的乳腺特異性表達(dá)構(gòu)件pBSK-BC-hLF-Neo。該構(gòu)件包含山羊e酪蛋白基因的5'調(diào)控序列、含內(nèi)含子15的乳鐵蛋白小基因序列和牛生長激素的polyA加尾信號(hào)序歹U，Neo抗性基因和e酪蛋白基因的3序歹ij。為了獲得整合有hLF的細(xì)胞，用限制性內(nèi)切l(wèi)lNotl將pBSK-BC-hLF-Neo中的人乳鐵蛋白的乳腺特異表達(dá)框架切出，電穿孔方法轉(zhuǎn)染雌性山羊胎兒成纖維細(xì)胞，G418篩選出抗性單克隆細(xì)胞株，再通過PCR和基因組Southern-blot的雙重鑒定，獲得含人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。再用含hLF的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為供核，山羊的卵母細(xì)胞作為供質(zhì)，進(jìn)行體細(xì)胞克隆。獲得了l頭成活克隆羊，經(jīng)PCR和Southern-blot分析，表明該羊?yàn)槿巳殍F蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊，該羊命名為LF123。對(duì)LF123轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)羔后所產(chǎn)羊奶收集后進(jìn)行分析，獲得的乳汁經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析表明人乳鐵蛋白在這頭山羊的乳汁獲得了高效表達(dá)，分子量與天然人乳鐵蛋白的分子量相當(dāng)，約78kD。定量分析表明，LF123乳汁中人乳鐵蛋白的表達(dá)量大于20mg/ml。對(duì)LF123與正常奶山羊配種所獲6只后代進(jìn)行檢測(cè)，其中有兩只整合有外源基因，整合率為33%，符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明轉(zhuǎn)入外源基因可經(jīng)生殖系穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明人采用山羊(3-casein5調(diào)控序列調(diào)控人乳鐵蛋白小基因的表達(dá)，獲得了穩(wěn)定表達(dá)量大于20mg/ml的轉(zhuǎn)基因山羊。而采用相似P-casein調(diào)控序列來調(diào)控人乳鐵蛋白cDNA的表達(dá)，獲得表達(dá)量為0.576mg/ml與0.311mg/ml的轉(zhuǎn)基因山羊，遠(yuǎn)低于采用基因組DNA及小基因DNA為功能基因時(shí)的表達(dá)量。本發(fā)明人的研究結(jié)果顯示利用含乳鐵蛋白第15內(nèi)含子的乳鐵蛋白小基因?yàn)楣δ芑蚩色@得與乳鐵蛋白基因組DNA相似的效果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于cDNA作為功能基因時(shí)的表達(dá)量。經(jīng)鑒定，轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF表現(xiàn)出與nhLF同樣的鐵結(jié)合、鐵釋放特性，表明rhLF不僅在乳腺中進(jìn)行了正確的翻譯后折疊，而且保持完整的N端、C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此外，純化過程也不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)。抑菌試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF具有強(qiáng)抑菌活性，且具有廣譜的抑菌效果。本發(fā)明還提供了由采用前述方法制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁，它含有濃度5-100mg/ml的rhLF，更特別的含有10-50mg/ml的rhLF。人乳鐵蛋白可從所述的乳汁中通過適當(dāng)?shù)牡鞍追蛛x純化方法獲得。所述的分離或純化可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用離子交換、親和層析等技術(shù)。可通過常規(guī)的SDS-PAGE電泳分析純化各步的純化效果。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例l:乳腺特異性表達(dá)載體pBSK-BC的制備基因構(gòu)建過程如圖l所示，所構(gòu)建的為山羊P-酪蛋白調(diào)控的乳腺特異性表達(dá)構(gòu)件。1.各部分元件的來源(1)山羊(3-酪蛋白5調(diào)控區(qū)山羊(3-酪蛋白((3-Casein)5側(cè)翼序列和外顯子1，2非編碼序列部分用常規(guī)方法制備本地薩能奶山羊基因組DNA。設(shè)計(jì)并合成如下引物BC5GTCGACTGCTCCTCATTCAGGGTTAT(SEQIDNO:4)，BC5CTCGAGGGCTCTCGATTCCTGTGAA(SEQIDNO:5)。通過PCR(94°C5min;94。Clmin;60°C45s;72°C4min，30個(gè)循環(huán))擴(kuò)增P-Casein5片段。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGEM-TEASY載體(Invitrogen)上，命名為TA5。(2)山羊P-酪蛋白3調(diào)控區(qū)山羊J3-酪蛋白外顯子6-9序歹iJ。設(shè)計(jì)如下引物BC3s，CTCGAGAGGAACAACAGCAAACAGAGG(SEQIDNO:6)，BC3a，GGTACCTTGCCATATTTCCAGTCGCAG(SEQIDNO:7)，以本地山羊基因組DNA為摸板，用PCR法(94°C，5min;94°C，lmin;60°C45s;72°C3min，30個(gè)循環(huán))擴(kuò)增3.2kb的(3-Casein3區(qū)。將該片段克隆至pGEM-TEASY載體上，命名為TA3。2.pBSK-BC載體構(gòu)建將TA-5用HindIII(擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部)及Xhol酶切，回收3.8kb片段，載體10pBluescript-SK(Invitrogen)用HindIII及SalI雙切，回收載體，片段與載體以l:3混合后連接，篩出重組克隆pBSK-BC5。將TA-3用XhoI及KpnI酶切，回收3.2kb片段，載體pBSK-BC5用XhoI及KpnI酶切，回收載體后連接，篩選出重組克隆pBSK-BC。實(shí)施例2:重組人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pBSK-BC-HLF的構(gòu)建含有人乳鐵蛋白cDNA的載體(pGEM-T(Easy)-hLFcDNA)，其中人乳鐵蛋白的cDNA序列如SEQIDNO:2所示，編碼具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的蛋白。用EcoRV和Ndel酶切該載體，收集hLF片段并插入到pET-30a(+)(獲自Novagen)中，獲得pET-30a(+)-hLF片段。人乳鐵蛋白內(nèi)含子的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物HLFIa:GCCTGCGACATACTGTGGTC(SEQIDNO:8)，HLFIs:AAGGATTTGAAGCTGGCAGAC(SEQIDNO:9);以人基因組DNA為模板，擴(kuò)增1.5kb人乳鐵蛋白基因第15內(nèi)含子及部分外顯子15和16，插入到pGEM-T載體中，獲得pGEM-T-hLF內(nèi)含子。用Bgll和Ndel從pGEM-T-hLF內(nèi)含子中切出hLF內(nèi)含子并插入到pET-30a(+)-hLF片段中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得pET-30a(+)-hLFl載體。用EcoRV和Ndel酶切pET-30a(+)-hLFl載體，并將獲得的hLF外顯子和內(nèi)含子片段插入到pGEM-T-hLFcDNA的EcoRV/Ndel位點(diǎn)中，得載體pGEM-T-hLF(含hLFcDNA及第15內(nèi)含子序列)。實(shí)施流程見圖2。其中的人乳鐵蛋白小基因具有SEQIDNO:1中3824-7125所示的核苷酸序列，編碼具有SEQIDNO:3所示序列的蛋白。牛生長激素PolyA(bghPA)的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物BGHPAs:CTCGAGTGCTAGAGCTCGCTGAT(SEQIDNO:10)，BghPAa:AAGCTTAAGCCATAGAGCCCAC(SEQIDNO:11);以pcDNA3(獲自Invitrogene)為模板，擴(kuò)增0.27kb的牛生長激素PA(bghPA)。將產(chǎn)物克隆至pGEM-TEASY載體上，命名為TA-PA。Neo基因閱讀框的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物NEOs':AAGCTTAAAGTCCCCAGGCTCC(SEQIDNO:12)，NEOa,:GTCGACAGTCCCGCTCAGAAGAA(SEQIDNO:13);以pcDNA3為模板，擴(kuò)增出neo基因閱讀框。將產(chǎn)物克隆至pGEM-TEASY載體上，命名為TA-Neo。將TA-PA用Xhol及HindIII酶切后，回收0.27kb片段，將psp72(購自Promega)經(jīng)Xhol及HindIII酶切后，回收2kb載體，連接，轉(zhuǎn)化后篩選得陽性克隆，命名為psp72-bghPA。將TA-Neo用HindIII及Sail酶切后，回收lkb片段，將psp72-pA經(jīng)HindIII及Sail酶切后，回收2.3kb載體，連接，轉(zhuǎn)化后篩選得陽性克隆，命名為psp72-bghPA-Neo。psp72-bghPA-Neo經(jīng)Xhol及Sail酶切后，回收bghPA-Neo片段，將pBSK-BC經(jīng)Xhol單酶切后，回收載體，連接，轉(zhuǎn)化后篩選，并鑒定正反向，得插入方向正確的陽性克隆，命名為pBSK-BC-PA-Neo。將pGEM-T-hLF經(jīng)Xhol酶切后，回收3.2kb乳鐵蛋白小基因片段，將pBSK-BC-PA-Neo經(jīng)XhoI酶切后，回收載體，連接，轉(zhuǎn)化后篩選，并鑒定正反向，得插入方向正確的陽性克隆，命名為pBSK-BC-hLF-Neo，其中含有SEQIDNO:1所示序列。上述構(gòu)建的實(shí)施流程見圖3。獲得的構(gòu)建物的主要結(jié)構(gòu)如圖4所示。實(shí)施例3:乳腺特特異性表達(dá)載體pBSK-BC-HLF轉(zhuǎn)染山羊胚胎成纖維細(xì)胞1.山羊胚胎成纖維細(xì)胞的制備取懷孕35天的薩能奶山羊，剖腹手術(shù)無菌取出胎兒，將胎兒在超凈臺(tái)中剪成糊狀后，加入含10。/。(v/v)FBS，1XNEAA，10ng/mLbFGF,1000u/mlhLIF的GMEM培養(yǎng)，兩日后凍存部分原代細(xì)胞，部分用于傳代供轉(zhuǎn)染用。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染NotI酶切pBSK-BC-hLF-Neo，回收線性化的載體DNA15wg，轉(zhuǎn)染羊胎兒成纖維細(xì)胞，具體參數(shù)如下細(xì)胞密度為107細(xì)胞/ml;細(xì)胞體積為0.5ml;轉(zhuǎn)染的DNA為NotI線性化的pBSK-BC-hLF-Neo載體；DNA濃度為15ng/3(^l;電轉(zhuǎn)介質(zhì)為BasicGMEM;CuvetteGap為0.4cm;電壓為0.4kV;電容為500)tiF;TC為19.9msec。電擊后，靜置10分鐘，用GEF完全培養(yǎng)液洗出細(xì)胞，均勻接種在10個(gè)100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37'C、5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；次日換液一次。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后更換GEF選擇培養(yǎng)液，此后每隔兩天更換選擇培養(yǎng)液一次，直至形成明顯的細(xì)胞克隆。3.克隆的篩選與挑取克隆形成后，顯微鏡下選擇邊緣界限清晰的克隆做上標(biāo)記；去除培養(yǎng)液，PBS洗兩遍；取滅菌克隆環(huán)，取適量硅膠潤滑油，放到選好的克隆上，將克隆圈起。如此法圈起板中所有選中克??；每個(gè)克隆環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶溶液50nl，消化10-30s;加培養(yǎng)液10(Hil終止消化，吹打均勻后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中；每孔追加100pl培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液一次；接下來，所有的克隆都按照從96孔板到48孔、24孔、12孔和6孔板順序依次傳代，當(dāng)細(xì)胞在6孔板長滿后凍存其中的一半(凍存密度5X105細(xì)胞/0.5ml)，另一半接入60mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用于抽提基因組DNA。4.克隆的鑒定(1)PCR鑒定細(xì)胞克隆外源基因整合情況分別在5調(diào)控區(qū)上及乳鐵蛋白基因上設(shè)計(jì)如下引物hLFF60825TACGCTGTTTCCTCATCTTCC3(SEQIDNO:14)hLFR72695GCAGCCACTTCCTCCTCACTT3(SEQIDNO:15)hLFF68065CAGACGAGGCTGAAAGGGACG3(SEQIDNO:16)hLFR82605CAGGCAGTGATGGCAACAAGG3(SEQIDNO:17)hLFF81525TGCCCAGAGTGTCAACAAGAA3(SEQIDNO:18)hLFR95525CCTACTCAGACAATGCGATGC3(SEQIDNO:19)鑒定結(jié)果見圖5，泳道l、2、3為LF123細(xì)胞基因組DNA分別用引物F8152和R9552、F6806和R8260、F6082和R7269擴(kuò)增出1.4kb,1.4kb，1.2kb的條帶；泳道4、5、6為正常羊以同樣引物擴(kuò)增結(jié)果，為陰性對(duì)照；泳道7，8，9為質(zhì)粒以同樣引物擴(kuò)增結(jié)果，為陽性對(duì)照。5.Southern雜交鑒定外源基因整合情況抽提弁123細(xì)胞基因組DNA，以hLF作為探針，按常規(guī)方法來進(jìn)行雜交，結(jié)果見圖6，其中箭頭所指為弁123細(xì)胞(LF123細(xì)胞)基因組經(jīng)XhoI酶切后，用HLF小基因進(jìn)行雜交，結(jié)果出現(xiàn)3.3kb的條帶，另一條帶為質(zhì)粒經(jīng)XhoI酶切后雜交所得陽性對(duì)照。實(shí)施例4:體細(xì)胞核移植1.卵母細(xì)胞制備與受體羊的同步挑選出作為卵母細(xì)胞供體的母羊肌注PGO.lmg/頭，間隔10-14天后注射第二次PG，在第二次注射PG10-13天后開始超排，即首先肌肉注射FSH,分6次，2次/日，用量為三天中，第一天100IU兩次，第二天80IU兩次，第三天80IU兩次。在最后一次注射FSH的同時(shí)，注射一次PG(0.1mg/頭)，間隔24小時(shí)后時(shí)注射LRH，25pg/次，注射LRH后26-28小時(shí)回收卵母細(xì)胞。為與提供卵母細(xì)胞的供體羊同步，受體羊間隔9-ll天分兩次肌肉注射PG，在供體羊超排注射PG后24小時(shí)，受體也同時(shí)注射PG,受體注射LRH的時(shí)間及劑量同供體。手術(shù)暴露輸卵管，用F-10營養(yǎng)液沖卵、體視鏡下檢卵。透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，M16洗4-5次，置M16方杯中培養(yǎng)，備用。2.供核細(xì)胞的饑餓處理把待饑餓的細(xì)胞W23接種于35mm平皿內(nèi)。待細(xì)胞豐度達(dá)70%-75%左右時(shí)，吸去培養(yǎng)液，加入含0.5。/。FCS的DMEM液，饑餓5天后，常規(guī)法消化收集細(xì)胞。然后放于-85'C冰箱內(nèi)保存。在核移植實(shí)驗(yàn)前6天，取出2小管復(fù)蘇并接種于4孔板內(nèi)。再培養(yǎng)2天或3天后饑餓，饑餓方法同前。3.重構(gòu)卵的制備與激活卵母細(xì)胞在M16-Hepes(含Hepes2.8mg/ml，CB7.5嗎/ml)液中洗滌3次，在M16-Hepes(含7.5嗎/mlCB)中處理10min;同時(shí)將培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化、分散成單個(gè)細(xì)胞。將卵母細(xì)胞與供核體細(xì)胞同時(shí)移入置于滅菌玻片上的lmlM16-Hepes(含CB)中，在顯微鏡下去核并吸入供核細(xì)胞，將之從原來的切口注射到卵周隙內(nèi)，使其緊貼于胞質(zhì)膜，采用電刺激的方法進(jìn)行融合，融合基質(zhì)為含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化鈣、0.1mM硫酸鎂、0.5%BSA的溶液，融合條件為DC600-610v/cm，脈沖持續(xù)時(shí)間80ps，連續(xù)刺激3次。融合后的胚胎于M16中培養(yǎng)5小時(shí)后，在含5^iM離子霉素(ionomycin)、7.5pg/mlCB的M16液中處理5min，再在含2mM6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5嗎/mlCB的M16液中處理5小時(shí)后移到M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待包埋或移植。4.重構(gòu)卵的包埋、回收與發(fā)育胚胎的移植用P/。的Agarose包埋重構(gòu)卵，并移植入輸卵管內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)5天后將膠條沖出，將膠條內(nèi)的胚胎剝離出來，選擇發(fā)育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受體羊子宮內(nèi)。移植后的受體在胚胎發(fā)育至1-2月齡時(shí)用B超進(jìn)行妊娠檢查，出現(xiàn)孕囊判定為懷孕，妊娠足月分娩。實(shí)施例5:LF123羊奶中rhLF的檢測(cè)一、材料乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因山羊，正常薩能奶山羊均來自上海轉(zhuǎn)基因研究中心南匯實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)，所有常規(guī)生化試劑均購自Sigma，人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma，人乳鐵蛋白單抗購自Abcam，兔抗人乳鐵蛋白多抗購自DAKO，HRP標(biāo)記的羊抗免購自DAKO。二、實(shí)驗(yàn)方法1.SDS-PAGE電泳13羊奶樣品處理將產(chǎn)奶后兩周內(nèi)樣品及一個(gè)月內(nèi)樣品各稀釋20倍，然后取2nl，加入2ul上樣緩沖液，變性后上樣電泳(120V)，電泳結(jié)果見圖7，圖8。圖7所示l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，2為正常羊乳，3為5ug的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，10-4分別為產(chǎn)后每2天的羊乳，即產(chǎn)后第2，4，6，8,10,12,14天的羊奶經(jīng)20倍稀釋后上樣,每孔上樣2"1.可見LF123羊乳中清晰的分子量為80kDa左右的的rhLF條帶，乳汁中rhLF的含量在產(chǎn)后最初一周內(nèi)呈下降趨勢(shì)，之后保持在一個(gè)較穩(wěn)定的水平。圖8所示l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,2為正常羊乳，3為5ug的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，4-10分別為產(chǎn)后第5天起每5天收集一次的羊乳，即產(chǎn)后第5,10,15，20,25，30,35天的羊奶經(jīng)20倍稀釋后上樣，每孔上樣2ul?？梢奓F123羊的羊乳中清晰的分子量為80kDa左右的rhLF條帶，rhLF的表達(dá)量維持在一個(gè)比較穩(wěn)定的水平。2.Western-Bolt檢測(cè)羊奶中rhLF。將LF123羊乳經(jīng)分別稀釋400倍后分別上樣4nL、3pL、2nL和lpL進(jìn)行電泳(分別對(duì)應(yīng)泳道l-4);泳道5-8分別為400ng、300ng、200ng和100ng的hLF標(biāo)準(zhǔn)品用作對(duì)照。電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉。依次加入l:3000的兔抗人乳鐵蛋白多抗，1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體反應(yīng)后，加入底物液顯色，結(jié)果見圖9。圖9中l(wèi)-4為羊乳稀釋400倍后分別上樣4pL、3pL、2pL和lnL進(jìn)行電泳后與乳鐵蛋白多抗結(jié)合；5-8分別為400ng、300ng、200ng和100ng的hLF標(biāo)準(zhǔn)品用作對(duì)照?？梢娭亟M人乳鐵蛋白可與免抗人乳鐵蛋白多抗特異地結(jié)合。3.雙夾心ELISA定量檢測(cè)羊乳中rhLF含量以lug/ml人乳鐵蛋白單抗包被酶標(biāo)板，封閉后加入倍比稀釋的nhLF(同時(shí)設(shè)兩個(gè)平行遞度)，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。向酶標(biāo)板中加入隨機(jī)抽樣的LF123羊乳(稀釋200萬倍)，并設(shè)正常羊奶，PBS分別為陰性和空白對(duì)照。nhLF及LF123羊乳分別與兔抗人乳鐵蛋白多抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體反應(yīng)后，加入底物液，反應(yīng)終止后讀取OD49o值。結(jié)果見表l(正常羊奶，PBS未顯色)。表]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>取中間6組數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性，將樣品OD值代入其中，分別得到稀釋后的產(chǎn)品溶度及稀釋前的濃度，見表l。圖10為標(biāo)準(zhǔn)人乳鐵蛋白經(jīng)雙夾心ELISA獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將LF123克隆羊羊乳檢測(cè)結(jié)果代入其中，可得出羊乳中rhLF的含量大于20mg/ml。三、結(jié)論1.由LF123羊乳的SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，LF123轉(zhuǎn)基因羊乳中較正常羊乳多出一條80KDa左右的蛋白條帶，其含量大于20mg/ml。2.由LF123羊乳的WESTERN-BLOT結(jié)果可以看出，該蛋白條帶可特異的與人乳鐵蛋白單抗結(jié)合，為重組人乳鐵蛋白。3.由LF123羊乳的雙夾心ELISA結(jié)果可以看出，rhLF可特異的與人乳鐵蛋白單抗結(jié)合，rhLF的含量大于20mg/ml。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因羊乳中rhLF的純化1.取新鮮乳汁或剛?cè)诮獾牡蜏卮娣诺娜橹?mL(rhLF濃度約34.0mg/mL)，于4'C條件下10000g離心30min,3層脫脂紗布過濾，除去脂肪和雜質(zhì)成分。濾液用稀釋液(40mmol/LPBS,0.8mol/LNaCl,pH7.5)2倍稀釋后用lmol/LHCl調(diào)至pH4.6，37。C溫育30min后同樣離心30min過濾去除。用lmol/LNaOH調(diào)至pH7.5后再次離心、過濾。所得乳清即可用于蛋白的精細(xì)純化。2.陽離子交換柱梯度洗脫(1)用平衡液將離子交換柱平衡5柱體積，使其光吸收平穩(wěn)于基線處。(2)以2mL/min流速將乳清泵入交換柱，以相同流速用平衡液沖洗柱子，去除未結(jié)合于介質(zhì)以及結(jié)合力較弱的雜蛋白，約3柱體積后吸光度可平穩(wěn)于基線。(3)在平衡液中加入洗脫液形成鹽濃度梯度用于洗脫結(jié)合于介質(zhì)的蛋白，條件流速1.0mL/min，鹽濃度范圍0.41.0mol/LNaCl，200min達(dá)到最大鹽濃度。收集所有洗脫峰。(4)利用7.5n/。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blot檢測(cè)各峰中的蛋白組分。(5)柱的還原與保養(yǎng)待高鹽溶液清洗層析柱之后，用0.2mol/LNaOH清洗柱子，使介質(zhì)上結(jié)合較緊的蛋白被變性洗出，并防止微生物留于柱內(nèi)進(jìn)行繁殖。用無菌去離子水沖洗5柱體積后用20%乙醇封柱，保存于4'C。(6)利用離心超濾管將蛋白的緩沖液替換成0.15mol/LNaCl溶液，于-80'C保存。3.Western-blot檢測(cè)。將以上收集的洗脫溶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，根據(jù)分子量大小初步判斷出hLF，并取其進(jìn)行Western-blot檢驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)品hLF(nhLF)為陽性對(duì)照。(1)轉(zhuǎn)膜利用SEMI-DRYTRANSFERCELL將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，恒流60mA，轉(zhuǎn)印時(shí)間70min。(2)封閉4'C下于水平搖床上用封閉液I封閉2hr。(3)第一抗體的結(jié)合用封閉液I將Rabbitanti-HumanLactoferrin稀釋3000倍至10mL，4t下于水平搖床上結(jié)合2hr。用漂洗液洗滌濾膜3次，每次10min。(4)第二抗體的結(jié)合用封閉液III將Goatanti-RabbitImmunoglobulins/HRP稀釋3000倍至10mL，4'C下于水平搖床上結(jié)合lhr。用漂洗液洗滌濾膜3次，每次10min。(5)顯色反應(yīng)取10nL30。/。過氧化氫加入10mL顯色液中,將濾膜浸沒于其中，待膜上顯示出條帶即可取出并用去離子水漂洗，吸干水分后即可拍照保存。另取未純化的轉(zhuǎn)基因山羊脫脂乳清、正常山羊脫脂乳清、本發(fā)明純化的rhLF和gLF(山羊LF)進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各種LF的免疫反應(yīng)性。結(jié)果梯度洗脫時(shí)，色譜柱中的乳清經(jīng)平衡液沖洗去除后，在0.41.0mol/LNaCl的線性洗脫范圍內(nèi)只出現(xiàn)了單一的光吸收峰。本實(shí)施例中的hLF抗體用于羊乳鐵蛋白(goatLactoFerrin，gLF)的免疫印跡時(shí)未能使其顯色，說明該抗體同gLF之間不具有特異性的抗體抗原反應(yīng)。通過SDS-PAGE(如圖1lB)和Western-blot(如圖11C)可以確定梯度洗脫的光吸收峰處蛋白為rhLF(如圖llA)。實(shí)施例7:rhLF的基本生化特性天然的hLF(nhLF)是一種分子量約80kDa，等電點(diǎn)8.0的糖蛋白。利用轉(zhuǎn)基因牛和小鼠乳腺表達(dá)的rhLF同hLF的分子量、等電點(diǎn)基本相同。糖基化修飾對(duì)LF的分子量影響較大，去除這些糖基會(huì)導(dǎo)致蛋白的分子量明顯減小，可通過SDS-PAGE檢測(cè)出。本實(shí)施例對(duì)rhLF的N端氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)以及糖基化修飾狀況做了進(jìn)一步測(cè)定。1.實(shí)驗(yàn)材料PNGaseF(P0704S，NEB)，蛋白序列測(cè)定系統(tǒng)(ABI491LC，PE)，基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(AutoFlexMALDI-TOF-MS，Bruker)。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1rhLFN端氨基酸序列、分子量與等電點(diǎn)取制得的rhLF樣品，利用Edman降解法測(cè)其N端氨基酸序列(10個(gè)氨基酸殘基)，并通過質(zhì)譜和雙向凝膠電泳分別測(cè)定其分子量和等電點(diǎn)。2.2rhLF糖基化取2mg/mL的rhLF與nhLF樣品各20nL，在4^iLIOX糖蛋白變性緩沖液中IOO'C煮10min使蛋白變性，之后加入10XG7緩沖液和10n/。的NP-40后混勻。取出12nL向其中加入lnLPNGaseF，37。C溫育3hr。用SDS-PAGE(7.5。/o)檢測(cè)蛋白變化。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，該rhLF的N端氨基酸序列為NH2-GlyArgArgArgArgSerValGlnTrpCys-x，同hLF的N端氨基酸序列完全相同。其分子量80187Da，等電點(diǎn)約8.0(圖12，13)，與hLF基本一致。糖苷酶處理后，rhLF同nhLF的分子量同比減小(圖14)，說明山羊乳腺表達(dá)的rhLF與正常人乳汁中的nhLF均發(fā)生了糖基化修飾，且其中的糖基含量相近。本研究中rhLF的N端10個(gè)氨基酸同hLF完全一致，表明利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF具有完整的N末端，轉(zhuǎn)基因構(gòu)件在山羊乳腺中可被正確轉(zhuǎn)錄和修飾，切除前導(dǎo)序列，形成成熟的rhLF。研究中所用的純化方法不會(huì)導(dǎo)致rhLF的水解斷裂。完整的N末端序列，是hLF對(duì)革蘭氏陰性菌致死作用的主要原因，其作用脂多糖(LPS)的陽離子區(qū)正是位于其分子的N末端。rhLF的分子量及等電點(diǎn)也與hLF基本保持一致，也說明蛋白的修飾程度相近。LF的糖基化修飾及其鐵結(jié)合情況是影響其分子量的主要原因之一，所以不同來源的LF以及通過不同純化方法獲得的LF之間均可能表現(xiàn)出差異，如hLF糖組分占5.5。/。時(shí)其分16子量為80.6kD,rhLF糖組分占2.9。/。時(shí)其分子量為78.5kD。按照該rhLF與hLF均為完整蛋白，其糖組分與分子量滿足一次現(xiàn)行方程，則兩者數(shù)量之間滿足y=80.8x+76.2y為rhLF的分子量(kDa)，x為糖組分所占比例根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的rhLF的分子量為80.187kDa，代入公式可得山羊乳腺中表達(dá)的rhLF的糖組分占其分子量的4.9n/。左右，同常規(guī)hLF的糖基化修飾程度相近。hLF—級(jí)結(jié)構(gòu)中有4個(gè)天冬酰氨殘基作為潛在的糖基結(jié)合部位。本研究中所用的PNGaseF酶也是特異性地切割N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和天冬酰氨殘基之間的糖苷鍵。本研究中糖苷酶的有效切割，表明rhLF的糖基化位點(diǎn)與nhLF是相同的。通常，1分子LF中，含有1516個(gè)甘露糖，56個(gè)半乳糖，1011個(gè)乙酰葡萄糖胺和1個(gè)唾液酸，其中，中性糖8.5%，氨基糖2.7%左右。這些多糖的具體作用至今尚無定論，去除這些糖基對(duì)LF的功能與特性并無顯著影響，但是否影響其對(duì)受體的結(jié)合尚存在爭(zhēng)議。實(shí)施例8:rhLF的鐵結(jié)合與鐵釋放特性hLF分子呈單鏈多肽結(jié)構(gòu)，N端和C端各自折疊成1個(gè)環(huán)狀，環(huán)內(nèi)各有4個(gè)氨基酸殘基(2個(gè)酪氨酸殘基、l個(gè)天冬氨酸殘基和l個(gè)組氨酸殘基)可結(jié)合l個(gè)F^+，所以LF分子具有結(jié)合鐵的能力。在低pH環(huán)境中，維持其分子構(gòu)象的力被破壞，結(jié)合的F^+得以釋放，LF表現(xiàn)出鐵釋放特性。1997年JanH.Nuijens等利用轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器，成功表達(dá)了rhLF，并研究發(fā)現(xiàn)鐵結(jié)合型nhLF與鐵結(jié)合型rhLF均在450465nm處具有較強(qiáng)的光吸收。根據(jù)LF這一光譜特性，PatrickHCvanBerkel等2002年研究發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因牛乳腺表達(dá)的rhLF也具有明顯的鐵結(jié)合以及pH介導(dǎo)的鐵釋放特性。1.實(shí)驗(yàn)材料Rabbitanti-HumanLactoferrin(A0186),Goatanti-RabbitImmunoglobulins/HRPP0448均購自DAKO，其余試劑購自Sigma。2.實(shí)驗(yàn)方法U)取nhLF及LF123羊乳中純化rhLF磷酸鹽緩沖液(20mmol/LPBS,0.15mol/LNaCl,pH7.5)中于380750nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度掃描，測(cè)其最大光吸收Ax的波長位置(x納米)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定依據(jù)。(2)鐵結(jié)合特性各取400uLnhLF與rhLF(濃度均為5.0mg/mL)，分別同200uL檸檬酸鐵溶液(5X10—、ol/L)混合均勻(rhLF:Fe3+=1:4)，取400uL于分光光度計(jì)比色杯中測(cè)其45min內(nèi)Ax值的變化。Ax升至平穩(wěn)表明LF達(dá)到鐵飽和狀態(tài)。(3)鐵釋放特性取(D中制備的鐵結(jié)合rhLF與鐵結(jié)合nhLF(濃度均為3.3mg/mL)各70uL,依次加入不同pH值的磷酸鹽緩沖液(pH依次為7.5、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0和2.0)中，37'C下孵育12hr，10000rpm離心10min后測(cè)各溶液的Ax值，并通過SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白的完整性。(4)可逆性將(2)中pH2.0處理后的樣品緩慢調(diào)至pH7.5，觀察其Ax的變化趨勢(shì)。(5)耐酸性取實(shí)驗(yàn)(l)中處理12hr的LF123羊乳中重組人乳鐵蛋白樣品和(2)中pH2.0處理12hr后的重組人乳鐵蛋白樣品，分別做7.5n/。SDS-PAGE和Western-blotting檢測(cè)其蛋白完整性和免疫反應(yīng)性是否發(fā)生改變。173.實(shí)驗(yàn)結(jié)果吸光度掃描結(jié)果顯示，rhLF與nhLF分別在465.2nm和463.8nm處具有最大光吸收，故可以認(rèn)為該rhLF同nhLF具有相類似的光譜特性，在465nm處具有特征性光吸收。rhLF在pH7.5和充足FeS+環(huán)境(LF:Fe3+=1:4)中，其八465變化情況同nhLF保持相同，在45min內(nèi)持續(xù)升高并最終趨于穩(wěn)定(如圖15),表明此時(shí)已形成鐵結(jié)合rhLF/nhLF。當(dāng)溶液pH值降低時(shí)，以上制備的鐵結(jié)合rhLF/nhLF的鐵結(jié)合率會(huì)隨之而下降(A465值降低)。當(dāng)環(huán)境pH值為6.0時(shí)鐵結(jié)合率開始下降，pH值下降至3.02.0時(shí)，八465再次趨于穩(wěn)定，鐵結(jié)合rhLF/nhLF基本上停止釋放鐵離子(如圖16)，推測(cè)此時(shí)鐵結(jié)合rhLF/nhLF結(jié)合的鐵離子已經(jīng)完全釋放。當(dāng)鐵釋放rhLF/nhLF溶液的pH值緩慢升高至7.0時(shí)，其A465會(huì)逐漸升高，釋放于溶液中的鐵離子可重新結(jié)合于rhLF，表明rhLF的pH介導(dǎo)的鐵釋放特性具有可逆性特點(diǎn)(如圖17)。分別取實(shí)驗(yàn)U)、(2)中的鐵結(jié)合rhLF和鐵釋放rhLF進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)過鐵結(jié)合、鐵釋放處理的rhLF未發(fā)生明顯降解，并保持其免疫反應(yīng)性(如圖18)。實(shí)驗(yàn)(4)中所用鐵釋放-rhLF是經(jīng)pH2.0處理12hr后的樣品，其蛋白完整性和免疫反應(yīng)性表明該rhLF具有較強(qiáng)的耐酸性。hLF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定其具有鐵結(jié)合與鐵釋放的特點(diǎn)，此特點(diǎn)賦予了hLF多種重要的生物學(xué)功能，如維持腸內(nèi)菌群平衡、補(bǔ)充人體鐵元素、影響機(jī)體自由基產(chǎn)生等。利用多種系統(tǒng)如轉(zhuǎn)基因牛、小鼠和水稻等表達(dá)的rhLF,都表現(xiàn)出這種特性。本研究中rhLF表現(xiàn)出同樣的鐵結(jié)合、鐵釋放特性，間接表明rhLF不僅在乳腺中進(jìn)行了正確的翻譯后折疊，而且保持完整的N端、C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此外，純化過程也不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)。實(shí)施例9:rhLF的抗菌活性LF具有強(qiáng)的鐵結(jié)合特性，能夠與微生物競(jìng)爭(zhēng)其生長所需鐵離子，實(shí)現(xiàn)抑菌功能。LF結(jié)構(gòu)中有一多肽序列具有更強(qiáng)的殺菌功能。故而LF具有廣譜抗菌活性，對(duì)生理所需鐵的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌、桿菌和單細(xì)胞李斯特菌等革蘭氏陽性菌都表現(xiàn)抑制活性。研究表明，利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF具有完整的分子組成與結(jié)構(gòu)，并具有較強(qiáng)的鐵結(jié)合特性。本試驗(yàn)驗(yàn)證rhLF的鐵結(jié)合能力是否足以達(dá)到抑菌作用。實(shí)驗(yàn)菌株(金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株，表皮葡萄球菌，表皮葡萄球菌耐甲氧西林菌株，肺炎球菌，鏈球菌)獲自中國藥科大學(xué)微生物教研室。實(shí)驗(yàn)方法1.配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基稱取牛肉膏粉和蛋白胨各10g，氯化鈉15g加入1000mL肉浸液中，微溫溶解。弱堿性條件下煮沸后過濾，調(diào)至pH7.2土0.2，分裝后115。C滅菌30min。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在配好的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入1520g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后為pH7.2士0.2，0.11Mpa壓力下滅菌30min。2.平板打孔法測(cè)定抗菌譜(1)待測(cè)液制備取樣品液(5mg/mL)lmL加入lmL無菌去離子水，得到l:2的待測(cè)液，依次倍比稀釋得l:4、1:8待測(cè)液。(2)供試液制備本試驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcusaureus,MRSA)、表皮葡萄球菌(Staph.Epidermidis,SE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillinresistantStaph,epidermidis,MRSE)各15株與肺炎球菌(Pneumococcus)7株、鏈球菌(Streptococcus)6株共73株臨床分離菌株進(jìn)行研究。取菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，過夜活化培養(yǎng)，取菌液3000rpm離心10min，棄上清，加無菌生理鹽水5mL混勻，作為供試液備用。(3)抑菌譜實(shí)驗(yàn)取3mL供試液加入無菌平板，取15mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻，冷凝后用6mm打孔器打孔，加入供試液40pL，將平板在水平臺(tái)靜置30min后，移入35'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1416hr取出觀察結(jié)果。3.抑菌率測(cè)定(1)供試液制備選取上述平板打孔法檢測(cè)出的敏感菌株，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，過夜活化，制備菌懸液，利用麥?zhǔn)媳葷峁艽_定其濃度后做10倍系列稀釋至約106CFU/mL，作為供試液備用。(2)待測(cè)液制備取rhLF樣品分別稀釋至lmg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL作為待測(cè)液。(3)測(cè)定方法取以上制備的供試液0.1mL，分別加入0.9mL各種濃度的待測(cè)液，35。C放置2hr。取上述各管樣品液，0.5mL加入4.5mL無菌生理鹽水，按10倍系列稀釋。取稀釋后的1(T3、10—4管做活菌計(jì)數(shù)。以不加樣品的各菌株空白菌懸液做同樣10倍系列稀釋，計(jì)數(shù)活菌數(shù)，按公式IR-(B-A)/BX100。/。計(jì)算抑菌率(IR)。式中B為空白組活菌數(shù)，A為試驗(yàn)組活菌數(shù)。4.結(jié)果在敏感性試驗(yàn)中，所用的幾種臨床分離菌株都對(duì)rhLF表現(xiàn)出敏感性，而且這種敏感性表現(xiàn)出rhLF的劑量相關(guān)性(如表2)。rhLF對(duì)各敏感菌株的抑菌圈大小不一，直徑在1625mm之間不等。抑菌率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)rhLF濃度為lmg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率可高達(dá)98%,在較低的濃度(0.25mg/mL)時(shí)也高達(dá)83.5。/。，表明轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF具有較強(qiáng)的抑菌活性，這種抑制效應(yīng)表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性(如圖19)。表2臨床分離菌株的rhLF敏感性實(shí)驗(yàn)樣品敏感率(％)1:21:41:8SA60.0040.0026.67MRSA53.3326.676.67SE53.3300MRSE33.3300Pnsumococcus42.8600Streptococcus50.0000LF可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微生物生理所需的鐵離子而實(shí)現(xiàn)抑菌殺菌，所以這種抑菌方式表現(xiàn)出LF劑量依賴關(guān)系，并且鐵缺失型乳鐵蛋白具有更強(qiáng)的抑菌活性，而鐵結(jié)合率越高則其抑菌活性越低。LF的抗菌多肽的殺菌機(jī)制是同菌膜上的脂多糖作用從而破壞細(xì)胞膜。所以，LF抗菌多肽主要是作用于革蘭氏陰性菌。本研究中選用了幾種臨床分離的革蘭氏陽性菌進(jìn)行rhLF的抗菌活性研究，表現(xiàn)出的抑菌活性主要是通過rhLF的鐵結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。據(jù)報(bào)道，LF對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為8mg/mL和lmg/mL。而本研究中，當(dāng)rhLF濃度為lmg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率可高達(dá)98%，在較低的濃度(0.25mg/mL)下亦高達(dá)83.5y。。這表明轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)的rhLF具有強(qiáng)抑菌活性。實(shí)施例10:含人乳鐵蛋白cDNA的轉(zhuǎn)基因山羊的制備1.載體構(gòu)建1)將人乳鐵蛋白cDNA與乳腺特異性表達(dá)載體pBCl(Iiwitrogen)相連，獲得人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pBCl-hLF(cDNA)，相關(guān)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)見圖20。2)將人乳鐵蛋白cDNA與乳腺特異性表達(dá)載體pBLG相連，構(gòu)建了人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pBLG-hLF(ZL00115794.9)，相關(guān)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)見圖21。2.轉(zhuǎn)基因羊的制備及外源基因的整合率pBCl-hLF(cDNA)基因共進(jìn)行了28次試驗(yàn)，投入供體羊115只，總排卵點(diǎn)1457個(gè)，平均排卵12.67枚(1457/115);總獲卵數(shù)1514枚，平均每只供體羊獲卵13.2枚(1514/115);在所獲卵中，原核注謝781枚，其中注射后存活率為64.9%(507/781)，原核顯現(xiàn)率為51.6%(781/1514)。移植受體132只，平均每頭受體移植3.8枚(507/132);經(jīng)B超檢査，受體的早期妊娠率為56.8%(75/132);最終44只受體羊妊娠足月分娩，共產(chǎn)羔62只，其中出生后死亡9只，存活53只。對(duì)存活的53只應(yīng)用PCR及Southem雜交檢測(cè)，最終得到兩只整合羊pBC-LF23及pBC-LF85，外源基因的整合率為3.7%(2/53)。pBLG-hLF基因共進(jìn)行了19次試驗(yàn)，投入供體羊74只，總排卵點(diǎn)數(shù)938個(gè)，平均排卵12.67枚(938/74);總獲卵數(shù)991枚，平均每只供體羊獲卵13.39枚(991/74);在所獲卵中，原核注謝657枚，其中存活率為56.62%(372/657),原核顯現(xiàn)率為66.3%(657/991)。移植受體102只，平均每頭受體移植3.64枚；經(jīng)B超檢查，受體的早期妊娠率為65.69%(67/102);最終44只受體羊妊娠足月分娩，共產(chǎn)羔69只，其中出生后死亡19只，存活40只羔羊。最終得到一只整合樣BLG-LF67，檢測(cè)結(jié)果顯示外源基因的整合率為2%(1/50)。3.轉(zhuǎn)基因羊的繁育及后代乳汁中乳鐵蛋白的表達(dá)量將pBC-LF23、pBC-LF85兩只轉(zhuǎn)基因公羊分別與正常的母羊配種后繁殖獲得的Fl代羊數(shù)分別為24只羊羔(11早，13S)，27只羊羔(9早，18$)。經(jīng)檢測(cè)pBC-LF23的Fl代羔羊中有9只(4早，5"攜帶有hLF基因；pBC-LF85的Fl代羔羊中有H只(4早，7悉)攜帶有hLF基因。在6月齡時(shí)對(duì)F1代轉(zhuǎn)基因母山羊催乳并收集泌乳前7天的乳汁。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)。結(jié)果pBC-hLF(cDNA)顯微注射轉(zhuǎn)基因山羊pBC-LF23和pBC-LF85系后代pBC-LF23-6，pBC-LF85-18在羊奶中表達(dá)人乳鐵蛋白，重組人乳鐵蛋白的平均表達(dá)量分別為0.576mg/ml與0.311mg/ml。將BLG-LF67與正常的母羊配種后繁殖獲得的F1代羊數(shù)分別為41只羊羔(27早1420悉)。BLG-LF67的F1代羔羊中有7只(5早2S)攜帶有hLF基因。但對(duì)整合母羊進(jìn)行催乳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中無外源基因的表達(dá)，羊乳中檢測(cè)不到人乳鐵蛋白。體細(xì)胞核移植及顯微注射制備含人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因羊結(jié)果比較見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上表為體細(xì)胞核移植及顯微注射制備人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因山羊的對(duì)比分析，可以看出，采用體細(xì)胞轉(zhuǎn)染，篩選，再進(jìn)行核移植以獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顯微注射。同時(shí)，轉(zhuǎn)染用細(xì)胞性別選擇可以幫助縮短轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備周期，這對(duì)于生產(chǎn)周期長，繁殖速度慢的大動(dòng)物尤為重要。另外，從上表的對(duì)比中也可以發(fā)現(xiàn)含人第15內(nèi)含子的人乳鐵蛋白小基因可獲得高表達(dá)，在相似調(diào)控區(qū)的作用下，其表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乳鐵蛋白cDNA為功能基因時(shí)的表達(dá)量。實(shí)施例ll:基因變異體采用常規(guī)酶切方法，從pBSK-BC-hLF-Neo載體上切下SEQIDNO:l融合基因序列。然后，采用常規(guī)的定點(diǎn)變異方法，將SEQIDNO:l融合基因序列進(jìn)行變異，構(gòu)建變異體，如下變異體1(M1):SEQIDNO:1序列第8位由T變?yōu)锳,且第11813位由A變異為C，且第7139位由G變異為A。變異體2(M2):SEQIDNO:1序列第3832位由T變?yōu)锳，且第7774位由T變異為A。將前述Ml和M2連接入pBluescriptl1SK載體中，位置與SEQIDNO:l融合基因序列在該載體中的位置相同。獲得pBSK-BC-hLF-Neo-Ml和pBSK-BC-hLF-Neo-M2。采用與實(shí)施例3-4類似的方法分別將表達(dá)載體pBSK-BC-hLF-Neo-Ml和pBSK-BC-hLF-Neo-M2線性化且轉(zhuǎn)染山羊胚胎成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行體細(xì)胞核移植，并將合適的胚胎移植到受體羊子宮內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的后代轉(zhuǎn)基因山羊的羊奶中也具有高含量的rhLF。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<"o〉上海杰隆生物工程股份有限公司，上海轉(zhuǎn)基因研究中心<120>—種利用體細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備高表達(dá)人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因山羊的方法<130>080358〈160>19<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>12497〈22>隱<213〉人工序列<221〉misc—feature<223>融合i因<柳〉1aagcttctttctttagtatattgttaaggatttccttgatcaagattttacctacttttc60tggtccaattggtgagagacagtcataagg朋atgctgtgtttattgcacaatatgtaga120gcatcttcctgagaaaataattgaatgggaaggatatgctttcttttgta180ttccmtctgagaaatcagactttttcacctgtggccttggccaccaaaagctaacaaa240taaaggcatatgaagtagccaaggccttttctagttatatctatgacactgagttcattt300catcatttattttcctgacttcctcctgggtccatatgagcagtcttagaatgaatatta360gctgaataatagtagatgUgatttgggttttctaagcaatccaagactt420gtatgacagtaagatgtattacc3tccaacacacatctcagcatgatataaatgcaagga480atattgtgaaga貼aatttttaattatgtc貼agtgcttactttagaaggtcatctatct540gtcccaaagctgtgaatatatatattgaaggtaatgaatagatgaagcta3ccttgtaaa600gtgaaatacaactacagttatgaacatctgggcaaagaaa660cttgaagattgcUUgcgaatgggctcctattaataaaaagtacttttgaggtctggct720cagactctattgtagtacttagggtaagaccctcctcctgtatgggctttcattttcttt780cttgettccctcatttgcccttccatgaatactagctgataaacattgactataaaagat840acttgagctgtcccattttaataaatctgtata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