對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法。步驟如下：首先對(duì)受體菌進(jìn)行培養(yǎng)，使其在37攝氏度的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；然后制備感受態(tài)細(xì)胞，棄上清，懸浮細(xì)胞放置冰箱中保存?zhèn)溆?；將搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其后在35攝氏度的環(huán)境下正面朝上的放置半小時(shí)，倒置培養(yǎng)12-13小時(shí)；最后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，先小提后大提，其中大提的時(shí)候，只需要離心一次，且應(yīng)去除壁上的所有乙醇；所述大提過程中，加入的乙醇為75%-85%；轉(zhuǎn)化的時(shí)候，需要加入36攝氏度預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果是，與預(yù)期的結(jié)果一致，經(jīng)抗性篩選后可以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，而且為將來建立轉(zhuǎn)基因的核供體提供了良好的體細(xì)胞。
【專利說明】對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)方法，具體來說，對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)染(transfection)指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染)兩大類。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體(印isome)存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶(ΑΡΗ;新霉素抗性基因)，潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服上述技術(shù)問題，我們提出了以下技術(shù)方案: 對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法，步驟如下:首先對(duì)受體菌進(jìn)行培養(yǎng)，使其在37攝氏度的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；然后制備感受態(tài)細(xì)胞，棄上清，懸浮細(xì)胞放置冰箱中保存?zhèn)溆茫粚u勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其后在35攝氏度的環(huán)境下正面朝上的放置半小時(shí)，倒置培養(yǎng)12-13小時(shí)；最后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，先小提后大提，其中大提的時(shí)候，只需要離心一次，且應(yīng)去除壁上的所有乙醇。
[0004]本發(fā)明中，所述大提過程中，加入的乙醇為75%_85%。
[0005]本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化的時(shí)候，需要加入36攝氏度預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明的有益效果是，與預(yù)期的結(jié)果一致，經(jīng)抗性篩選后可以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，而且為將來建立轉(zhuǎn)基因的核供體提供了良好的體細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0007]對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法，步驟如下:首先對(duì)受體菌進(jìn)行培養(yǎng)，使其在37攝氏度的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)2小時(shí)；然后制備感受態(tài)細(xì)胞，棄上清，懸浮細(xì)胞放置冰箱中保存?zhèn)溆?；將搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其后在35攝氏度的環(huán)境下正面朝上的放置半小時(shí)，倒置培養(yǎng)12小時(shí)；最后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，先小提后大提，其中大提的時(shí)候，只需要離心一次，且應(yīng)去除壁上的所有乙醇。所述大提過程中，加入的乙醇為75%。轉(zhuǎn)化的時(shí)候，需要加入36攝氏度預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基。[0008] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改 變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法，其特征在于，步驟如下:首先對(duì)受體菌進(jìn)行培養(yǎng)，使其在37攝氏度的環(huán)境下振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；然后制備感受態(tài)細(xì)胞，棄上清，懸浮細(xì)胞放置冰箱中保存?zhèn)溆?；將搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其后在35攝氏度的環(huán)境下正面朝上的放置半小時(shí)，倒置培養(yǎng)12-13小時(shí)；最后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，先小提后大提，其中大提的時(shí)候，只需要離心一次，且應(yīng)去除壁上的所有乙醇。
2.如權(quán)利要求1所述的對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法，其特征在于，所述大提過程中，加入的乙醇為75%-85%。
3.如權(quán)利要求1所述的對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行制備的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的時(shí)候，需要加入36攝氏度預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12N15/79GK103602702SQ201310525136
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】徐麗 申請(qǐng)人:徐麗