本發(fā)明涉及生物大分子的制備，特別涉及蛋白質(zhì)及其功能組裝材料的制備方法及其在表界面改性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

使用生物大分子進(jìn)行表面/界面改性是十分重要的方向，因為這樣可以有效地提高其生物相容性，甚至可以賦予其生物響應(yīng)性和生物功能性。其中，蛋白質(zhì)由于具有精確可控的結(jié)構(gòu)與豐富多樣的功能備受矚目。

層層組裝技術(shù)是一種簡單可靠的表/界面改性技術(shù)，它可以精確控制材料的組成與結(jié)構(gòu)。近年來，這一技術(shù)已經(jīng)在眾多領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，包括高分子、無機(jī)粒子、金屬等都可以進(jìn)行有效的組裝，并且賦予材料特殊的功能。但在生物方面，尤其是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域內(nèi)，由于蛋白質(zhì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而且單位蛋白質(zhì)上可以有效進(jìn)行反應(yīng)的位點較少，因此導(dǎo)致其很難有效地組裝。同時，由于蛋白的折疊結(jié)構(gòu)和功能對于化學(xué)修飾和環(huán)境都很敏感，如何確保組裝后的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)與功能仍然是一個重要的問題。

目前，基于全蛋白質(zhì)層層組裝功能材料的報道極少，其中一個例子就是利用基因編碼技術(shù)制備得到帶有大量相反電荷的彈性蛋白類似物對(elp)，然后利用其相互之間的靜電相互作用進(jìn)行層層組裝，制備出了空心微膠囊(kolbe,a.,etal.macromol.rapid.commun.2011,32,186-90.)。截止到目前，尚未有報道提出制備出具有生物活性的和生物響應(yīng)性的基于共價作用的全蛋白質(zhì)層層組裝材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了制備蛋白質(zhì)層層組裝薄膜以運用于材料的表界面修飾，本發(fā)明提供了一種利用重組蛋白質(zhì)正交化學(xué)反應(yīng)的方法。

要實現(xiàn)蛋白質(zhì)界面層層組裝，需要滿足以下幾個條件：(1)需要建立在無機(jī)或者金屬界面與蛋白質(zhì)連接的橋梁。(2)在每一次交替組裝過程結(jié)束后，材料表面應(yīng)該仍然具有足夠多的活性反應(yīng)位點。對于第一個條件，許多特異性的化學(xué)反應(yīng)如金與巰基間、硅烷偶聯(lián)劑與硅材料之間，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，甚至已經(jīng)發(fā)展出了一系列與無機(jī)材料相互作用的特定多肽序列等等。針對第二個問題，已經(jīng)有人利用基因編碼的工具設(shè)計并制備出來了具有多重相反電荷的類似彈性蛋白的聚多肽(elp)，這種聚多肽可以在碳酸鈣上層層組裝制備核殼結(jié)構(gòu)的生物膠囊。但是針對于材料如何保持生物活性的問題仍未解決。近年來，已經(jīng)發(fā)展出來了一系列生物化學(xué)反應(yīng)對，比如諜捕手(spycatcher)和諜標(biāo)簽(spytag)(zakeri,b.,etal.proc.natl.acad.sci.usa2012,109,e690-e697.)，探捕手(snoopcatcher)和探標(biāo)簽(snooptag)(veggiani,g.etal.m.,proc.natl.acad.sci.usa2016,113,1202-1207.)等等。這些反應(yīng)對都來源于化膿性鏈球菌的蛋白質(zhì)工具對，一般標(biāo)簽部分為只有十幾個氨基酸的短肽，而捕手部分則是一段較長的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。它們具有較好的生物相容性，并能在生理條件下發(fā)生高效的反應(yīng)。除此之外，前期工作已經(jīng)證明這兩種反應(yīng)對之間完全正交。如果能夠合理地設(shè)計兩種正交蛋白質(zhì)反應(yīng)對在融合蛋白中的位置與數(shù)量，那么將可以完美地實現(xiàn)在層層組裝中活性位點的再生。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，通過將這兩種正交蛋白質(zhì)反應(yīng)對融合成新的構(gòu)筑單元，可以有效地實現(xiàn)層層組裝，同時還可以引入新的功能化結(jié)構(gòu)域，賦予材料相應(yīng)的功能。

具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種蛋白質(zhì)層層組裝功能材料的制備方法，包括以下步驟：

1)設(shè)計蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元，所述構(gòu)筑單元為包含正交的蛋白質(zhì)反應(yīng)對，以及功能蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中同一蛋白質(zhì)反應(yīng)對的兩個蛋白質(zhì)分別位于不同的構(gòu)筑單元內(nèi)；

2)構(gòu)建蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元所對應(yīng)的基因并引入表達(dá)載體中，然后在細(xì)胞中表達(dá)所構(gòu)建基因?qū)?yīng)的蛋白；

3)對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到高純度蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元；

4)利用正交的蛋白質(zhì)反應(yīng)對對蛋白質(zhì)進(jìn)行層層組裝，得到所需功能材料。

上述步驟1)中所述的正交的蛋白質(zhì)反應(yīng)對優(yōu)先選用諜捕手和諜標(biāo)簽反應(yīng)對，以及探捕手和探標(biāo)簽反應(yīng)對。

典型的諜標(biāo)簽(簡稱a)和諜捕手(簡稱b)的氨基酸序列如序列表中seqidno：1和seqidno：2所示，其對應(yīng)的基因序列可以是序列表中seqidno：3和seqidno：4，也可以是基于密碼子的簡并性編碼同樣氨基酸序列的其它基因序列。

典型的探標(biāo)簽(簡稱c)和探捕手(簡稱b)的氨基酸序列如序列表中seqidno：5和seqidno：6所示，其對應(yīng)的基因序列可以是序列表中seqidno：7和seqidno：8，而基于密碼子的簡并性，也可以是其它編碼同樣氨基酸序列的基因序列。

當(dāng)然，其他的相互正交的蛋白質(zhì)反應(yīng)對亦可以應(yīng)用在這里。

除了正交蛋白質(zhì)反應(yīng)對以外，蛋白質(zhì)構(gòu)筑單元中還可以包括一個或者多個相同或不同的功能蛋白結(jié)構(gòu)域，這些功能蛋白結(jié)構(gòu)域位于正交蛋白質(zhì)反應(yīng)對之間。所述功能蛋白可以是彈性蛋白類似物(elp)、納米抗體(nanobody)、親和體(affibody)、超級鈾結(jié)合蛋白(sup)、二氫葉酸還原酶(dhfr)等，以及醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、科研領(lǐng)域涉及的其他功能蛋白。

下面通過一些具體例子來說明蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元的結(jié)構(gòu)：

(a)探標(biāo)簽-諜捕手-探標(biāo)簽(cbc)：從n端到c端分別為探標(biāo)簽、諜捕手、探標(biāo)簽，其中每段探標(biāo)簽與諜捕手之間都插入一個彈性蛋白類似物(elp)，其對應(yīng)的基因序列可以是序列表中seqidno：9，即cbc，其中第6-11位氨基酸殘基為6×his，第16-28位氨基酸殘基為探標(biāo)簽，第30-108位氨基酸殘基為elp，第123-249位氨基酸殘基為諜捕手，第251-329位氨基酸殘基為elp，第344-356位氨基酸殘基為探標(biāo)簽。

(b)探捕手-諜標(biāo)簽-探捕手(dad)：從n端到c端分別為探捕手、諜標(biāo)簽、探捕手，其中每段探捕手與諜標(biāo)簽之間都插入一個彈性蛋白類似物(elp)，其對應(yīng)的基因序列可以是序列表中seqidno：10，即dad，其中第6-11位氨基酸殘基為6×his，第16-128位氨基酸殘基為探捕手，第134-210位氨基酸殘基為elp，第213-225位氨基酸殘基為諜標(biāo)簽，第227-305位氨基酸殘基為elp，第320-432位氨基酸殘基為探捕手。

除此之外，cbc還可以將其中第一個elp結(jié)構(gòu)置換成超級鈾結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)(sup)或二氫葉酸還原酶(dhfr)，其對應(yīng)的基因序列可以是序列表中seqidno：11，seqidno：12即cbc-sup，cbc-dhfr。在seqidno：11中，第6-11位氨基酸殘基為6×his，第16-28位氨基酸殘基為探標(biāo)簽，第31-110位氨基酸殘基為sup，第112-238位氨基酸殘基為諜捕手，第252-318位氨基酸殘基為elp，第333-345位氨基酸殘基為探標(biāo)簽。在seqidno：12中，第6-11位氨基酸殘基為6×his，第16-28位氨基酸殘基為探標(biāo)簽，第31-189位氨基酸殘基為dhfr，第192-318位氨基酸殘基為諜捕手，第321-395位氨基酸殘基為elp，第413-425位氨基酸殘基為探標(biāo)簽。

上述步驟2)通過重組dna技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元所對應(yīng)的基因，并引入到合適的載體質(zhì)粒中。原核表達(dá)系統(tǒng)適用的載體例如pqe以及pet系列質(zhì)粒。為后續(xù)的純化方便，在蛋白質(zhì)層層組裝的構(gòu)筑單元上n端加上6×his標(biāo)簽。通常是將構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌等工程菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元，表達(dá)溫度一般在20℃左右，表達(dá)時間一般大于12個小時。

上述步驟3)中，常用的純化方法是對于添加了his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元進(jìn)行鎳親和層析純化。

上述步驟4)中，實施界面層層組裝的前提需要一個連接界面與蛋白質(zhì)間的橋梁作用位點。以金表面為例，通過含有多個半胱氨酸殘基的構(gòu)筑單元前驅(qū)體蛋白進(jìn)行第一層組裝。本發(fā)明設(shè)計了一種諜標(biāo)簽-彈性蛋白類似物-諜標(biāo)簽-彈性蛋白類似物-諜標(biāo)簽-4×半胱氨酸(aaa-4cys)的前驅(qū)體蛋白，其氨基酸序列可以是序列表中seqidno：13，其中：第6-11位氨基酸殘基為6×his；第14-26位氨基酸殘基為諜標(biāo)簽；第31-108位氨基酸殘基為elp；第111-123位氨基酸殘基為諜標(biāo)簽，第125-203位氨基酸殘基為elp；第208-220位氨基酸殘基為諜標(biāo)簽；第223-227位氨基酸殘基為4×半胱氨酸。處于還原態(tài)下的半胱氨酸會與金表面發(fā)生有效的特異性反應(yīng)，而諜標(biāo)簽可以作為下一層的反應(yīng)位點與探標(biāo)簽-諜捕手-探標(biāo)簽(cbc)蛋白中的諜捕手進(jìn)行反應(yīng)，由于諜化學(xué)反應(yīng)與探化學(xué)反應(yīng)之間完全的正交性，cbc中剩余的探標(biāo)簽可以繼續(xù)作為活性反應(yīng)位點與下一層探捕手-諜標(biāo)簽-探捕手(dad)中的探捕手進(jìn)行反應(yīng)。這樣一來材料表面剩余的活性反應(yīng)基團(tuán)又變成了諜標(biāo)簽，如此循環(huán)往復(fù)進(jìn)行探標(biāo)簽-諜捕手-探標(biāo)簽(cbc)與探捕手-諜標(biāo)簽-探捕手(dad)的交替作用，可以制備具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的層層組裝的蛋白質(zhì)薄膜。

除了金表面以外，本發(fā)明的方法還適用于硅基材料表面，可以利用氨基硅烷偶聯(lián)劑預(yù)先對硅材料表面進(jìn)行氨基改性，改性后再利用3-馬來酰亞胺丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯，使其表面富含馬來酰亞胺基團(tuán)，這樣通過上述的諜標(biāo)簽-彈性蛋白類似物-諜標(biāo)簽-彈性蛋白類似物-諜標(biāo)簽-4×半胱氨酸(aaa-4cys)的前驅(qū)體蛋白作用也可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)層層組裝。該方法亦可適用于云母、玻璃等表面。

值得一提的是，上述制備方法不僅適用于二維平面基底而且還可以應(yīng)用于三維立體材料。

組裝好的蛋白質(zhì)材料可以進(jìn)行功能測試，在本發(fā)明的一些實施例中，選用cbc-sup進(jìn)行鈾酰陽離子的富集與釋放實驗，以及cbc-dhfr對二氫葉酸的還原實驗。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元制備方法的技術(shù)優(yōu)勢主要在于：可以利用基因編碼的形式，獲得純度較高且功能穩(wěn)定的活性蛋白質(zhì)；而層層組裝制備出的薄膜具有層間共價交聯(lián)特性，并且在修飾過程中和之后薄膜可以保持其中功能蛋白質(zhì)的生物活性與響應(yīng)性；除此之外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)層層組裝方法適用于多種有機(jī)、無機(jī)材料界面，如金屬、硅材料等。

附圖說明

圖1顯示了實施例2中融合蛋白cbc、dad和cbc-sup的純化以及它們之間的反應(yīng)情況。

圖2顯示了實施例2中融合蛋白cbc、dad和aaa-4cys的純化以及dad和aaa-4cys分別與cbc的反應(yīng)情況。

圖3顯示了實施例3中融合蛋白cbc-dhfr與cbc-affibody的純化，以及它們與dad、aaa-4cys之間的反應(yīng)情況。

圖4顯示了cbc、dad以及cbc-sup的圓二色譜數(shù)據(jù)。

圖5顯示了cbc、dad以及cbc-sup的體積排阻色譜數(shù)據(jù)。

圖6顯示了cbc(a)，dad(b)，cbc-sup(c)的飛行時間質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及cbc-dhfr(d)以及aaa-4cys(e)的高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖7顯示了實施例4中在石英微晶天平檢測下的cbc/dad(aaa-4cys)(a)以及cbc-sup/dad(aaa-4cys)(b)的層層組裝數(shù)據(jù)。

圖8顯示了實施例5中cbc-sup/dad層層組裝材料在鈾酰陽離子的富集與釋放實驗照片：其中，sg為未改性的硅膠；sg-nh2為表面氨基化改性的硅膠(硅烷偶聯(lián)劑)；sg-mal為表面馬來酰亞胺化改性的硅膠(3-馬來酰亞胺丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯)；sg-sup為表面組裝了cbc-sup多層蛋白膜的硅膠(a)及檢測數(shù)據(jù)(b)。

圖9顯示了實施例6中含有蛋白質(zhì)硅膠的條件下nadph吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)，以及cbc-dhfr/dad層層組裝材料在dhf還原實驗的動力學(xué)數(shù)據(jù)(b)。

具體實施方式

下面通過實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

制備蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元的具體步驟為：通過重組基因工程技術(shù)構(gòu)建含有his6標(biāo)簽(用于蛋白質(zhì)純化)、探標(biāo)簽(c)、彈性蛋白類似物(e)(或者是sup、dhfr和affibody等其他蛋白)、諜捕手(b)、彈性蛋白類似物(e)、探標(biāo)簽(c)的融合蛋白，即c(e)b(e)c的基因序列并插入表達(dá)載體中；和構(gòu)建探捕手(d)、彈性蛋白類似物(e)、諜標(biāo)簽(a)、彈性蛋白類似物(e)、探捕手(d)的融合蛋白，即d(e)a(e)d的基因序列并插入表達(dá)載體中；然后通過分子克隆方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，再通過親和層析等蛋白提純方法獲得純化的目標(biāo)融合蛋白。所述目標(biāo)融合蛋白例如：cbc、dad、cbc-sup、cbc-dhfr、aaa-4cys等。

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)、尺寸排阻色譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜等手段表征了蛋白質(zhì)構(gòu)筑單元的分子量、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性質(zhì)；并且利用石英微晶天平與耗散儀器對薄膜的組裝進(jìn)行了原位測試；利用分析方法對蛋白質(zhì)薄膜材料的功能做出評估。

實施例1：蛋白質(zhì)構(gòu)筑單元目的基因的轉(zhuǎn)化與表達(dá)

以上蛋白序列是構(gòu)建在pqe-80l表達(dá)載體中，隨后在大腸桿菌bl21(de3)中表達(dá)。在大規(guī)模表達(dá)之前，先將轉(zhuǎn)化得到的單克隆菌接種在5ml2xyt培養(yǎng)基中(含濃度為100μg/ml氨芐青霉素)，在37℃，250rpm條件下震蕩培養(yǎng)過夜，第二天將其轉(zhuǎn)入1l新鮮的2×yt培養(yǎng)基中(置于3l的三角瓶中，含濃度為100μg/ml氨芐青霉素)，在37℃，250rpm條件下進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，待其od600長到0.6-1.0之間，加入終濃度為0.1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)，然后培養(yǎng)溫度設(shè)為22℃，220rpm，培養(yǎng)20h后收集菌體。

實施例2：蛋白質(zhì)構(gòu)筑單元的純化

將1l大腸桿菌培養(yǎng)液收集于離心瓶，以5000g離心力離心收集菌體，去除上層培養(yǎng)液。用25ml變性緩沖溶液a(50mm磷酸氫二鈉，300mm氯化鈉，10mm咪唑，ph＝8.0)重懸菌體，再用超聲儀在4℃條件下破碎細(xì)胞，然后將大腸桿菌破碎產(chǎn)物在4℃，28000g離心力下離心20分鐘。得到的上清液與被變性緩沖溶液a平衡的鎳親和樹脂混合，在4℃下攪拌1h。混合物置于空柱中，進(jìn)行重力流洗脫，洗脫液為變性緩沖溶液b(50mm磷酸氫二鈉，300mm氯化鈉，300mm咪唑，ph＝8.0)。洗脫所得到的蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)測試純度。分析樣品與5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合，98℃加熱10min后，裝載到10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中，垂直電泳80-140v電壓下運行70min(電泳液：25mm三羥基氨基甲烷、250mm甘氨酸、0.1％十二烷基硫酸鈉)。凝膠用考馬斯藍(lán)g-250染色處理后觀察條帶位置。圖1與圖2顯示了在不同溫度下的cbc、dad、cbc-sup以及aaa-4cys蛋白的鎳親和層析純化情況，通過大腸桿菌表達(dá)，鎳親和層析柱純化可獲得較高純度的蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元，同時顯示了cbc/dad之間的正交性和蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)性。

實施例3：蛋白質(zhì)構(gòu)筑單元的表征

500μl的蛋白質(zhì)洗脫液在akta蛋白純化系統(tǒng)(aktaavant，gehealthcare)上經(jīng)過凝膠滲透柱superdex200increase10/300gl進(jìn)行精純。流動相為pbs，流速為0.5ml/min。通過監(jiān)測a280收集目標(biāo)峰，sds-page電泳結(jié)果如圖3所示，隨后蛋白溶液進(jìn)行除鹽處理用來進(jìn)行圓二色譜(cd)分析，結(jié)果如圖4所示。

純化產(chǎn)物的分子量用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof)或高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜來測定，所用儀器為5800maldi-tof/tof分析儀(absciex)。圖5顯示了所制備的蛋白質(zhì)層層組裝構(gòu)筑單元實際分子量與理論分子量基本一致。cbc、dad、cbc-sup、cbc-dhfr以及aaa-4cys的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如圖6所示。

實施例4：蛋白質(zhì)層層組裝薄膜的制備

將上述蛋白置換緩沖溶液成磷酸鹽緩沖液體系(pbs，50mm磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，ph7.4)，aaa-4cys中加入1mmtcep用于保護(hù)巰基。這里以改性好的的硅膠粒子為例，進(jìn)行下述操作：

1)首先加入1ml0.5mg/ml的aaa-4cys到體積為0.5ml的改性硅膠體系內(nèi)，振蕩20min后，5000rpm離心1min。去除上清液后重新加入1mlpbs緩沖液，用于清洗。振蕩1min后再次5000rpm離心1min，去除上清液。

2)然后加入1ml0.5mg/ml的cbc或者是cbc-sup的pbs溶液，重復(fù)上述操作直至清洗操作結(jié)束。

3)之后再加入1ml0.5mg/ml的dad的pbs溶液重復(fù)上述操作直至清洗操作結(jié)束。

這樣一個cbc/dad的雙層組裝已完成，多次按順序重復(fù)2)、3)操作即可獲得多層的蛋白質(zhì)層層組裝結(jié)構(gòu)。

以金表面為例，進(jìn)行下述操作：

1)加入0.5mg/ml的aaa-4cys溶液浸泡20min，然后使用pbs緩沖液浸洗10min。

2)加入0.5mg/ml的cbc溶液浸泡20min，然后使用pbs緩沖液浸洗10min。

3)加入0.5mg/ml的dad溶液浸泡20min，然后使用pbs緩沖液浸洗10min。

這樣一個cbc/dad的雙層組裝已完成，多次按順序重復(fù)2)、3)操作即可獲得多層的蛋白質(zhì)層層組裝薄膜。同樣地，也可以利用石英微晶天平對金表面進(jìn)行原位層層組裝監(jiān)測，具體操作與金表面浸漬法相似，結(jié)果如圖7所示。

實施例5：蛋白質(zhì)層層組裝薄膜的鈾富集與釋放功能測試

按上述操作制備出cbc-sup，并按照實施例4的方法在改性硅膠表面上與dad進(jìn)行層層組裝制備完畢后將0.5mll的蛋白質(zhì)樹脂加入到層析柱內(nèi)，通入200ml的含有10nm鈾酰陽離子的超純水溶液；待通入完畢后(可適當(dāng)加壓)先加入300μl50mm的碳酸銨溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)靜置10min左右后，再讓其自然流出；隨后再分三次，依次加入同樣體積的碳酸銨溶液，收集所有流出的溶液以備檢測；待流出結(jié)束后，加入一定體積的超純水進(jìn)行洗滌。重復(fù)上述操作10次獲得10次待測樣品。

待測樣品試用偶氮胂iii的方法進(jìn)行監(jiān)測，首先制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，繪制完畢后，待測樣品等體積加入含濃度為0.1m的鹽酸的80μm偶氮胂iii溶液。使用酶標(biāo)儀對652nm處的吸光度進(jìn)行測試，得到的數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出鈾酰陽離子的濃度，具體數(shù)據(jù)如圖8所示。

實施例6：蛋白質(zhì)層層組裝薄膜的二氫葉酸還原性測試

與實施例5相同，制備出cbc-dhfr，在改性硅膠表面上與dad進(jìn)行層層組裝后，取1μl樹脂加入到184μl緩沖液中(50mm磷酸鹽，80％k2hpo4，20％kh2po4，1mm巰基乙醇)然后加入5μl20mm還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph,sigma)和10μl5mm二氫葉酸(dhf,sigma)?；靹蚝笫褂妹笜?biāo)儀動力學(xué)模式測量一定時間范圍內(nèi)(>30min)340nm處吸光度變化。在實驗之前，應(yīng)進(jìn)行含有樹脂的不同濃度的nadph在340nm處吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出在單位時間內(nèi)nadph的消耗量除以樹脂的質(zhì)量即可得到樹脂的酶活性，數(shù)據(jù)如圖9所示。

sequencelisting

<110>北京大學(xué)

<120>一種蛋白質(zhì)層層組裝功能材料的制備方法

<130>wx2017-03-112

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alahisilevalmetvalaspalatyrlysprothrlys

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ileprothrthrgluasnleutyrpheglnglyalametvalaspthr

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leuserglyleusersergluglnglyglnserglyaspmetthrile

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lys

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valglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglyval

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glyvalproglygluglyvalproglyvalglyvalproglyvalgly

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valproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglygluglyval

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glyproglnglyiletrpglyglngluleuileprothrthrgluasn

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valglyvalproglyvalglyvalproglygluglyvalproglyval

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glyvalproglyvalglyvalproglyglyleuleuaspglyprogln

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glyiletrpglyglnleugluglylysleuglyaspileglupheile

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tyrproaspiletyrglyalaileaspglnasnglythrtyrglnasn

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valargthrglygluaspglylysleuthrphelysasnleuserasp

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glylystyrargleuphegluasnsergluproalaglytyrlyspro

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glyvalproglygluglyvalproglyvalglyvalproglyvalgly

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valproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglygluglyval

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proglyvalglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyvalpro

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valproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyval

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glyglyleuleuaspglyproglnglyiletrpglyglnleuglumet

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serglyleusersergluglnglyglnserglyaspmetthrileglu

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gluaspseralathrhisilelyspheserlysargaspgluaspgly

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valproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglygluglyval

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glyvalglyvalproglygluglyvalproglyvalglyvalprogly

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valglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyvalproglyglu

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glyvalglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyvalprogly

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gluglyvalproglyvalglyvalproglyvalglygluleualahis

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valglyvalproglyvalglyvalproglygluglyvalproglyval

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valproglygluglyvalproglyvalglyvalproglyvalglyval

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proglyvalglyvalproglyvalglyvalproglygluglyvalpro

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glyvalglyvalproglyvalglyvalproglyglyleuleuaspala

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