本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種基于octs技術(shù)的胰腺癌、惡性間皮瘤car-t治療載體。此外，本發(fā)明還涉及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞(高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為機(jī)體中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)的突變的腫瘤細(xì)胞可被免疫系統(tǒng)所識(shí)別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。隨后，各種腫瘤免疫療法包括細(xì)胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應(yīng)用于臨床。2013年一種更先進(jìn)的腫瘤免疫療法---car-t療法成功用于臨床，并表現(xiàn)了前所未有的臨床療效。car-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療法。該療法是通過轉(zhuǎn)基因的手段，將啟動(dòng)子、抗原識(shí)別區(qū)、共刺激因子、效應(yīng)區(qū)等共同組成的嵌合分子，導(dǎo)入t細(xì)胞基因組內(nèi)，從而使t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、殺傷等功能融為一體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t療法在臨床上最領(lǐng)先的有諾華的clt019，采用clt019治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者，六個(gè)月的腫瘤無進(jìn)展生存率達(dá)到67％，其中最長(zhǎng)的應(yīng)答時(shí)間達(dá)到兩年多?？偛课挥谥袊虾５纳虾?yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司與醫(yī)院合作，截止到2017年2月，共治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達(dá)到66.6％。這是抗癌研究的顛覆性突破。car-t細(xì)胞療法可能是最有可能治愈癌癥的手段之一，并被《science》雜志評(píng)為2013年度十大科技突破之首。car-t目前在治療b-淋巴細(xì)胞白血病等幾種類型的血液腫瘤方面療效顯著，但是也存在一些局限性，目前一個(gè)嵌合抗原受體只能識(shí)別一種抗原靶標(biāo)，腫瘤細(xì)胞是個(gè)復(fù)雜的群體，含有相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞被清除以后，不含相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞會(huì)迅速增殖，一段時(shí)間后導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。那么要使car-t識(shí)別能同時(shí)識(shí)別兩種抗原，就有兩個(gè)方案可選：一是將兩組嵌合抗原受體構(gòu)建進(jìn)入一個(gè)慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，一次性將兩組嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞；二是用兩個(gè)慢病毒轉(zhuǎn)基因載體分兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，將兩組嵌合抗原受體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞。方案一的缺點(diǎn)在于占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，不利于裝載其它功能元件；轉(zhuǎn)基因載體包裝效率低；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率非常低，很難轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞內(nèi)。方案二的缺點(diǎn)在于需要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)的綜合效率較低，轉(zhuǎn)導(dǎo)周期時(shí)間長(zhǎng)，原代細(xì)胞容易衰老，導(dǎo)致增殖能力衰退，殺傷功能下降，影響腫瘤清除療效。mesothelin是一種腫瘤相關(guān)抗原，在大多數(shù)的惡性胸膜間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及某些肺癌中有表達(dá)，并且正常組織中表達(dá)范圍窄、表達(dá)量低。因而可以作為惡性胸膜間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌的免疫治療靶點(diǎn)(gregoryl.beatty,carlh.juneetal.mesothelin-specificchimericantigenreceptormrna-engineeredtcellsinduceantitumoractivityinsolidmalignancies.cancerimmunolres2014；2:112-120.)。pd-l1在多數(shù)癌癥組織中過量表達(dá)，包括nsclc、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病及各種泌尿系腫瘤、消化道腫瘤、生殖系腫瘤等[intlekoferam,thompsoncb.atthebench:preclinicalrationaleforctla-4andpd-1blockadeascancerimmunotherapy[j].jleukocbiol,2013,94(1):25-39.].parsa在鼠和人的腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)t細(xì)胞異常分泌的ifn-γ，ifn-γ可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的pd-l1高表達(dá)[dingh,wux,wuj,etal.deliveringpd-1inhibitorysignalconcomitantwithblockingicosco-stimulationsuppresseslupus-likesyndromeinautoimmunebxsbmice[j].clinimmunol,2006,118(2/3):258-267.]。pd-l1高表達(dá)，可以通過抑制ras及pi3k/akt信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致t細(xì)胞增殖的抑制[11]。dong等體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型還發(fā)現(xiàn)，pd-1/pd-l1信號(hào)通路的激活可以誘導(dǎo)特異性ctl調(diào)亡，使ctl的細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)敏感性下降，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[dongh,stromese,salomaodr,etal.tumor-associatedb7-h1promotest-cellapoptosis:apotentialmechanismofimmuneevasion[j].natmed,2002,8(8):793-800.]。目前，尚未有克服上述缺點(diǎn)針對(duì)mesothelin、pdl1兩種抗原的car-t治療的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種基于octs技術(shù)的胰腺癌、惡性間皮瘤car-t治療載體。首先，其僅需要一次轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，不影響car-t治療的療效；其次，其不占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，利于裝載其它功能元件。第三，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細(xì)胞免疫治療的療效。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該載體的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的一方面，提供一種基于octs技術(shù)的胰腺癌、惡性間皮瘤car-t治療載體，包括慢病毒骨架質(zhì)粒、人ef1α啟動(dòng)子、octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域和pdl1單鏈抗體；所述慢病毒骨架質(zhì)粒包括：用于目的菌株大量擴(kuò)增的含氨芐青霉素抗性基因ampr序列，如seqidno.1所示；用于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pucori序列，如seqidno.2所示；用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子sv40ori序列，如seqidno.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；zsgreen1綠色熒光蛋白，如seqidno.11所示；ires核糖體結(jié)合序列，如seqidno.12所示；用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率的ewpre增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如seqidno.13所示；所述人ef1α啟動(dòng)子的序列如seqidno.14所示；所述octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域包括：如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受體信號(hào)肽、如seqidno.16所示的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.17所示的pdl1單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.18所示的mesothelin單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的mesothelin單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.20所示的抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker、如seqidno.21所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker、如seqidno.22所示的cd8hinge嵌合受體鉸鏈、如seqidno.23所示的cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如seqidno.26所示的tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域以及嵌合受體共刺激因子區(qū)域；所述嵌合受體共刺激因子區(qū)域選自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134等腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的任意一種或多種的組合。所述慢病毒包裝順式元件可以采用第二代慢病毒載體，也可以采用第三代慢病毒載體。所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件。所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件，以及如seqidno.4所示的rsv啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選采用第三代慢病毒載體。優(yōu)選的，所述如seqidno.16所示的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.17所示的pdl1單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.18所示的mesothelin單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的mesothelin單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.20所示的抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker、如seqidno.21所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker采用串聯(lián)連接方式或者轉(zhuǎn)角連接方式；所述串聯(lián)連接方式具體為：pdl1單鏈抗體輕鏈vl與mesothelin單鏈抗體輕鏈vl采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，pdl1單鏈抗體輕鏈vl與pdl1單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，mesothelin單鏈抗體輕鏈vl與mesothelin單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，即pocts-pms(見圖4a、圖4c)；所述轉(zhuǎn)角連接方式具體為：mesothelin單鏈抗體輕鏈vl與mesothelin單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，pdl1單鏈抗體輕鏈vl與mesothelin單鏈抗體重鏈vh采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，pdl1單鏈抗體重鏈vh與mesothelin單鏈抗體輕鏈vl采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts-pmt(見圖4b、圖4c)。優(yōu)選的，所述pdl1單鏈抗體的序列如seqidno.27所示。優(yōu)選的，所述ewpre增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變，具體為：g.396g>a、g.397c>t、g.398t>c、g.399g>a、g.400a>t、g.411a>t。優(yōu)選的，由所述人ef1α啟動(dòng)子啟動(dòng)整個(gè)octs結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，所述cd8leader嵌合受體信號(hào)肽位于octs編碼序列的n端，用于引導(dǎo)octs蛋白定位于細(xì)胞膜；所述pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、mesothelin單鏈抗體輕鏈vl、mesothelin單鏈抗體重鏈vh這兩組單鏈抗體組合成雙抗原識(shí)別區(qū)，用于識(shí)別相應(yīng)靶抗原；所述cd8hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細(xì)胞膜外側(cè)；所述cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)用于將整個(gè)嵌合受體固定于細(xì)胞膜上；所述cd28嵌合受體共刺激因子用于刺激t淋巴細(xì)胞體外激活和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷作用；所述cd134嵌合受體共刺激因子用于促進(jìn)t淋巴細(xì)胞增殖和因子分泌，增強(qiáng)腫瘤免疫，有利于記憶t細(xì)胞的長(zhǎng)期存活；所述tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域用于激活下游信號(hào)通路的表達(dá)；所述pdl1單鏈抗體，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細(xì)胞免疫治療的療效；當(dāng)抗原識(shí)別區(qū)域與靶抗原結(jié)合時(shí)，信號(hào)通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生t細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞一系列生物學(xué)效應(yīng)。優(yōu)選的，所述嵌合受體共刺激因子區(qū)域采用如seqidno.24所示的cd28嵌合受體共刺激因子以及如seqidno.25所示的cd134嵌合受體共刺激因子組合。優(yōu)選的，所述的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、mesothelin單鏈抗體輕鏈vl、mesothelin單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造。在本發(fā)明的第二方面，提供一種上述基于octs技術(shù)的胰腺癌、惡性間皮瘤car-t治療載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將如seqidno.1所示的含氨芐青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核復(fù)制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒復(fù)制子sv40ori序列、用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1綠色熒光蛋白、如seqidno.12所示的ires核糖體結(jié)合序列、如seqidno.13所示的ewpre增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件存儲(chǔ)于慢病毒骨架質(zhì)粒上；(2)將如seqidno.14所示的人ef1α啟動(dòng)子、所述octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域以及如seqidno.27所示的pdl1單鏈抗體組合成octs嵌合受體設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒中，得到第三代octs設(shè)計(jì)的重組慢病毒質(zhì)粒；(3)將得到的重組慢病毒質(zhì)粒分別與慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g共同轉(zhuǎn)染hek293t/17細(xì)胞，在hek293t/17細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，包裝成功重組慢病毒載體會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；(4)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的柱純化方式進(jìn)行純化，分別得到重組慢病毒載體。優(yōu)選的，步驟(4)中，所述抽濾步驟要控制上清體積在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5mpa～-0.9mpa，防止由于堵孔帶來的載體損失；所述吸附步驟要控制溶液的ph值在6～8，防止ph的變化導(dǎo)致載體失活；所述洗脫步驟要控制洗脫液的離子強(qiáng)度在0.5m～1.0m，防止離子強(qiáng)度的變化導(dǎo)致洗脫不完全或者載體失活。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的載體在制備治療胰腺癌和惡性間皮瘤的藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明所采用的octs-car-t技術(shù)，是在目前傳統(tǒng)car-t細(xì)胞治療的基礎(chǔ)上，通過對(duì)嵌合抗原受體(car)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造，使得嵌合抗原受體能夠識(shí)別兩種抗原，大大拓展了car-t細(xì)胞的識(shí)別范圍，針對(duì)腫瘤群體的清除更徹底，療效更持久；避免分批培養(yǎng)car-t細(xì)胞，大大節(jié)約成本；避免患者多次回輸不同靶向car-t細(xì)胞，節(jié)約了患者的經(jīng)濟(jì)支出，降低復(fù)發(fā)的幾率，間接提高患者生存質(zhì)量。僅需要一次轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，不影響car-t治療的療效；不占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，利于裝載其它功能元件，轉(zhuǎn)基因載體包裝效率高，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。octs的全稱是onecarwithtwoscfvs，通過串聯(lián)octs(seriesocts)或者轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的連接方式，將兩段scfv與整合成一個(gè)嵌合分子(如圖1所示)，賦予t淋巴細(xì)胞hla非依賴的方式識(shí)別兩種腫瘤抗原的能力，相對(duì)于傳統(tǒng)的car-t細(xì)胞能夠識(shí)別更廣泛的目標(biāo)，進(jìn)一步擴(kuò)大了腫瘤細(xì)胞的清除范圍。octs的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括兩個(gè)腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigen，taa)結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scfv段)，一個(gè)胞外鉸鏈區(qū)，一個(gè)跨膜區(qū)，兩個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)和一個(gè)效應(yīng)元件區(qū)。scfv區(qū)域?qū)τ趏cts的特異性、有效性以及基因改造t細(xì)胞自身的安全性來說是關(guān)鍵的決定因素。隨著octs-car-t的即將進(jìn)入臨床研究階段標(biāo)志著car-t細(xì)胞治療即將進(jìn)入2.0時(shí)代。本發(fā)明所采用的載體骨架可以應(yīng)用于第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上，也可以應(yīng)用于第二代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上。第二代和第三代慢病毒載體在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別如圖2b所示。本發(fā)明優(yōu)選第三代慢病毒載體(如圖2a所示)，3’sinltr去除了u3區(qū)域，消除了慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率；采用rsv啟動(dòng)子保證了慢病毒載體包裝時(shí)核心rna的持續(xù)高效轉(zhuǎn)錄；采用人自身的ef1α啟動(dòng)子，使car基因能夠在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)。本發(fā)明所述的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、mesothelin單鏈抗體輕鏈vl、mesothelin單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造，能有效減少體內(nèi)人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的產(chǎn)生，延長(zhǎng)scfv的半衰期和作用效果，增加octs-car-t細(xì)胞的存在時(shí)間。本發(fā)明中使用的共刺激因子的一種或若干種組合，能夠增加轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的增殖速率、存活時(shí)間、殺傷效率、免疫記憶等特性。本發(fā)明采用的octs-car-t細(xì)胞由gmp級(jí)別的車間生產(chǎn)后，可用于人體臨床實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的重組慢病毒載體可以實(shí)現(xiàn)在人t淋巴細(xì)胞上表達(dá)pdl1、mesothelin等組合的雙靶向嵌合抗原受體，引導(dǎo)并激活t淋巴細(xì)胞對(duì)pdl1、mesothelin等陽性細(xì)胞的殺傷作用，在臨床上可用于治療胰腺癌、惡性間皮瘤等mesothelin陽性/pdl1陽性/mesothelin、pdl1雙陽性惡性腫瘤的治療。本發(fā)明通過重組慢病毒載體骨架、octs結(jié)構(gòu)域、pd1配體(pd-l1)的singlechainantibody(單鏈抗體)構(gòu)建形成重組慢病毒載體，該方式得到的重組慢病毒載體可以實(shí)現(xiàn)在人t淋巴細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)胞程式死亡配體1(programmedcelldeath1ligand1，pdl1)的單鏈抗體，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細(xì)胞免疫治療的療效。可見，本發(fā)明所述的octs-car-t細(xì)胞將給腫瘤細(xì)胞治療提供可靠的保障。附圖說明圖1是本發(fā)明所述的octs嵌合受體的示意圖，包含了串聯(lián)octs(seriesocts)和轉(zhuǎn)角octs(turnocts)示意圖；圖2本發(fā)明所述的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中圖2a是本發(fā)明采用的第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖2b是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建本發(fā)明所述的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖。其中，(a)圖是慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)圖是2個(gè)octs質(zhì)粒的示意圖；(c)圖是ppac-gp質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(d)圖是ppac-r質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(e)圖是penv-g包裝質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中octs結(jié)構(gòu)的元件順序示意圖，其中，a圖是串聯(lián)octs(seriesocts)的結(jié)構(gòu)示意圖，b圖是轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的結(jié)構(gòu)示意圖，c圖是octs結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒編號(hào)(octssymbol)的列表示意圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pms、pocts-pmt的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中圖5a是pocts-pms的酶切預(yù)測(cè)示意圖，圖5b是pocts-pms的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5c是pocts-pmt的酶切預(yù)測(cè)示意圖，圖5d是pocts-pmt的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5a中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5a中的lane2是pocts-pms的kpni酶切預(yù)測(cè)：條帶從上到下依次為：6254bp、4638bp、1525bp；圖5b中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；圖5b中的lane2是pocts-pms的kpni酶切電泳結(jié)果；圖5c中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5c中的lane2是pocts-pmt的apali酶切預(yù)測(cè)：條帶從上到下依次為：5032bp、4091bp、1731bp、1241bp、492bp；圖5d中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；圖5d中的lane2是pocts-pmt的apali酶切電泳結(jié)果；圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中重組慢病毒載體的滴度檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中所述的octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建的步驟流程圖，包含分離培養(yǎng)、激活、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、octs-car-t細(xì)胞鑒定等階段；圖8是本發(fā)明實(shí)施例2中octs-car-t細(xì)胞的支原體檢測(cè)結(jié)果示意圖，其中，lane1為dl2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對(duì)照；lane3為陰性對(duì)照；lane4為pbs；lane5為裂解液；lane6為octs-pms-car-t細(xì)胞；lane7為octs-pmt-car-t細(xì)胞；圖9為本發(fā)明實(shí)施例2中流式檢測(cè)octs-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及免疫分型結(jié)果示意圖；其中，圖9a表示octs-pms-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖9b表示octs-pms-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖9c表示octs-pmt-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖9d表示octs-pmt-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖10為本發(fā)明實(shí)施例3中不同效靶比條件下，octs-pms-car-t細(xì)胞和octs-pmt-car-t細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷結(jié)果比較示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述此發(fā)明。應(yīng)理解的是，在此描述的特定實(shí)施方式通過舉例的方式來表示，并不作為對(duì)本發(fā)明的限制。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。材料1、慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic，慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g，hek293t/17細(xì)胞，同源重組酶，oligoannealingbuffer，支原體檢測(cè)試劑盒，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，pdl1+k562、mesothelin+k562、pdl1+mesothelin+k562、k562細(xì)胞購自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司；慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic的具體制備方法已經(jīng)公開在發(fā)明名稱為“一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的car-t轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01610008360.5的專利申請(qǐng)說明書中；2、人新鮮外周血由健康供者提供；3、octs-pms、octs-pmtdna序列組合由上海優(yōu)卡迪公司設(shè)計(jì)(參見圖4c)，交給上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒形式保存；4、工具酶kpni、apali、clai、ecori、t4dna連接酶均購自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes濾器購自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％臺(tái)盼藍(lán)、篩網(wǎng)、各類型細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)板均購自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000購自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl購自genescript公司；9、ldh檢測(cè)試劑盒購自promega公司；10、ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液購自杰特貝林公司；12、cryopremium凍存液、分選緩沖液來自上海優(yōu)卡迪公司；13、ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21購自peprotech公司；14、cd3單克隆抗體，cd28單克隆抗體，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠購自德國miltenyi公司；15、冷凍離心機(jī)(美國thermoscientific公司；16、facs流式細(xì)胞儀購自thermo公司；17、熒光倒置顯微鏡購自olympus公司；18、cd4-fitc、cd8-apc購自biolegend公司；19、0.9％生理鹽水購自今邁公司；20、proteinlmagneticbeads購自biovision公司；21、primestar、retronectin購自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin購自bdbioscience公司；23、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自mn公司；24、感受態(tài)細(xì)胞top10購自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均購自上海生工；26、dneasy試劑盒購自上海捷瑞公司；27、sa-hrp購自上海翊圣公司；28、引物：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)擴(kuò)增dna片段和靶位點(diǎn)所需的引物，該引物由上海生物公司合成，具體為：ef1α-f：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(seqidno.28)ef1α-r：5’-tcacgacacctgaaatggaaga-3’(seqidno.29)octs-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.30)octs-r：ggggagggagaggggcttagcgcggcggcagcg(seqidno.31)ires-f：gcccctctccctccccc(seqidno.32)ires-r：attatcatcgtgtttttcaaaggaa(seqidno.33)pdl1scab-f：aaaacacgatgataatgccaccatgaactccttctccacaagcg(seqidno.34)pdl1scab-r：aatccagaggttgattgtcgacgaattctcatttgcccgggctcag(seqidno.35)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.36)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.37)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.38)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.39)29、本發(fā)明中，所述seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20，seqidno.21，seqidno.22，seqidno.23，seqidno.24，seqidno.25，seqidno.26，seqidno.27所示dna片段由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)本發(fā)明人提供的序列合成。實(shí)施例1octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建一、重組慢病毒載體lvocts-pms、lvocts-pmt的構(gòu)建、純化、檢測(cè)方法。參見圖3，本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：1、將人ef1α啟動(dòng)子(seqidno.14)、octs結(jié)構(gòu)【octs-pms、octs-pmt】(cd8leader嵌合受體信號(hào)肽(seqidno.15)、pdl1單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.16)、pdl1單鏈抗體重鏈vh(seqidno.17)、mesothelin單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.18)、mesothelin單鏈抗體重鏈vh(seqidno.19)、抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker(seqidno.20)、單鏈抗體間鉸鏈inter-linker(seqidno.21)、cd8hinge嵌合受體鉸鏈(seqidno.22)、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)(seqidno.23)、cd28嵌合受體共刺激因子(seqidno.24)、cd134嵌合受體共刺激因子(seqidno.25)、tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域(seqidno.26))、pdl1單鏈抗體(seqidno.27)組合成octs嵌合受體設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic中，分別得到重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pms、pocts-pmt，元件順序和編號(hào)如圖4所示。(1)將慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)5823bp的片段v1，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；1、溶膠按200μlnti/100mggel比例加入溶膠液，50℃水浴放置5-10分鐘。2、結(jié)合dna11000g離心30秒，棄去濾液。3、洗膜加入700μlnt3，11000g離心30秒，棄去濾液。4、洗膜重復(fù)第三步一次5、晾干11000g離心1分鐘，換新的收集管，室溫放置1分鐘。6、洗脫dna加入15-30μlne，室溫放置1分鐘，11000g離心1分鐘，收集濾液。表1瓊脂糖凝膠回收步驟(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的人ef1α啟動(dòng)子(seqidno.14)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1208bp的片段a，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；試劑體積(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5表250μlpcr反應(yīng)體系(3)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pms為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2370bp的片段b，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(4)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pmt為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2382bp的片段c，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(5)用引物ires-f和ires-r以合成的ires核糖體結(jié)合序列(seqidno.12)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)575bp的片段d，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(6)用引物pdl1scab-f和pdl1scab-r以合成的pdl1單鏈抗體(seqidno.27)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1557bp的片段e，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；(7)將重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合(見表3)以5μl總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入eppendorf管內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μl，混勻后在42℃孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μltop10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于amplb瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。重組慢病毒質(zhì)粒片段組合pocts-pmsa、b、d、epocts-pmta、c、d、e表3重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合挑取克隆進(jìn)行菌落pcr鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pms、pocts-pmt，對(duì)正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定(見圖5)，并送測(cè)序復(fù)核結(jié)果。2、重組慢病毒載體lvocts-pms、lvocts-pmt的包裝。(1)完全培養(yǎng)基：取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下顛倒混勻即可；(2)1xpbs溶液：稱量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml燒杯中，加入900mlmilli-qgrade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫濕熱滅菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:稱量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml燒杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm過濾除菌，長(zhǎng)期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：稱量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超純水溶解；用milli-qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：稱量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超純水溶解；校準(zhǔn)ph儀后，用2mnaoh溶液將hbs溶液的ph調(diào)到7.05。調(diào)整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh為3ml左右；(6)從液氮罐中取出凍存的hek293t/17細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，1～2min后轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合的程度大于80％進(jìn)行傳代；(7)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染的hek293t/17細(xì)胞，每2-6個(gè)培養(yǎng)皿為一組，將細(xì)胞胰酶消化后，用電動(dòng)移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個(gè)消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免培養(yǎng)皿變干；使用1ml移液器將所有細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；(8)將上述2-6個(gè)培養(yǎng)皿中的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再?zèng)_洗一便培養(yǎng)皿；(9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細(xì)胞懸液，將細(xì)胞傳到8-24個(gè)10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)約4×106個(gè)/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細(xì)胞密度和預(yù)期的相差較大，則需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照4×106個(gè)/皿的量接種；(10)每6個(gè)培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后晃動(dòng)數(shù)次，使細(xì)胞充分鋪開，然后放入5％co2培養(yǎng)箱。剩余細(xì)胞做同樣處理；(11)檢查所傳代細(xì)胞，細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻分布；(12)為細(xì)胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基,每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一個(gè)新的5ml離心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，補(bǔ)充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(14)另取一支5ml離心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動(dòng)，另一只手拿一把1ml移液槍，吸取0.5ml2×hbs溶液，緩慢滴加進(jìn)入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×hbs加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；(15)取一皿細(xì)胞，將離心管中的1ml鈣轉(zhuǎn)液滴加進(jìn)去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整個(gè)培養(yǎng)皿中；(16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個(gè)5％co2培養(yǎng)箱中。確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個(gè)。在5％co2培養(yǎng)箱中放置(6–8h)；(17)將第一個(gè)培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值調(diào)回到5％；(18)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80–85％左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng)基吸走，更換10ml新鮮的dmem完全培養(yǎng)基；(19)48小時(shí)后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細(xì)胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95％細(xì)胞都會(huì)帶有綠色熒光。將同一個(gè)病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10ml新鮮培養(yǎng)基；(20)72小時(shí)后，再次將同一個(gè)病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養(yǎng)皿；此時(shí)收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvocts-pms、lvocts-pmt。3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體；(1)將收集的上清液使用thermo真空泵，經(jīng)0.22μm-0.8μm的pes濾器抽濾，除去雜質(zhì)；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)將2個(gè)離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動(dòng)泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根據(jù)上樣量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進(jìn)行長(zhǎng)期保存；4、重組慢病毒載體滴度測(cè)定；(1)取24孔板接種293t細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個(gè)，所加培養(yǎng)基體積為500ul,不同種類的細(xì)胞生長(zhǎng)速度有所差異，進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞融合率為40％-60％；(2)準(zhǔn)備3個(gè)無菌ep管，在每個(gè)管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)接種細(xì)胞24小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為n；(3)取待測(cè)定的病毒原液10ul加入到第一個(gè)管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個(gè)管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500ul；(4)感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；(5)72小時(shí)后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個(gè)細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照dneasy試劑盒的說明抽提基因組dna。每個(gè)樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna并定量；(7)準(zhǔn)備目的dna檢測(cè)qpcrmix總管ⅰ(qpcr引物序列為seqidno.36---seqidno.37)：n＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(8)準(zhǔn)備內(nèi)參dna檢測(cè)qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列為seqidno.38---seqidno.39)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(9)在預(yù)冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組dna加入到a-d行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對(duì)照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組dna加入到e-g行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對(duì)照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr儀為abiprism7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測(cè)得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計(jì)算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)n＝感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)(13)重組慢病毒載體lvocts-pms、lvocts-pmt的滴度結(jié)果(如圖6所示)；二、octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建參見圖7，本發(fā)明所述octs-car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法如下：1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細(xì)胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補(bǔ)至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個(gè)新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細(xì)胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細(xì)胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補(bǔ)加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細(xì)胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細(xì)胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細(xì)胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細(xì)胞分選。(1)將獲得的pbmc計(jì)數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細(xì)胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時(shí)準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，分別標(biāo)記：cd4-/cd8-細(xì)胞液(a管)、cd4+/cd8+細(xì)胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤(rùn)洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細(xì)胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時(shí)再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細(xì)胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細(xì)胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細(xì)胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細(xì)胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細(xì)胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及octs-car-t細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細(xì)胞量，按moi＝5～20的量，分別加入lvocts-pms、lvocts-pmt慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，同時(shí)添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、octs-car-t細(xì)胞體外擴(kuò)增。(1)每2天等量補(bǔ)加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細(xì)胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，凍存培養(yǎng)的octs-car-t細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。實(shí)施例2octs-car-t細(xì)胞病原檢測(cè)和表達(dá)檢測(cè)。一、內(nèi)毒素檢測(cè)；(1)、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為15eu/支；(2)、鱟試劑靈敏度λ＝0.25eu/ml，0.5ml/管(3)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支，分別用bet水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s；(4)、加樣：取鱟試劑若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對(duì)照管，加入bet水0.1ml；2支為陽性對(duì)照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對(duì)照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液(稀釋20倍的待測(cè)樣品1ml+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml＝2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4，37±1℃水浴(或培養(yǎng)箱)保溫60±1min；表4內(nèi)毒素稀釋比例及對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素含量(5)、octs-car-t細(xì)胞的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果(如表5所示)，所有細(xì)胞的內(nèi)毒素含量均小于2.5eu/ml，符合《中華人民共和國藥典》中小于10eu/ml的標(biāo)準(zhǔn)；表5稀釋倍數(shù)原液510204080160對(duì)應(yīng)eu/ml0.251.252.55102040octs-pms-car-t(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)octs-pmt-car-t(+)(-)(-)(-)(-)(-)(-)二、支原體檢測(cè)；(1)在實(shí)驗(yàn)前三日，細(xì)胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)收集1ml細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；(3)13000g離心1min，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；(4)加入500ulpbs用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000g離心5min；(5)步驟4重復(fù)一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用槍頭吹吸，充分混勻后,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置于95℃中加熱5min；(8)13000g離心5min后，取5μl上清作為模板，25μlpcr反應(yīng)體系為：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循環(huán)條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原體檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖8所示)，octs-car-t細(xì)胞中均不含支原體。三、octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測(cè)及免疫分型檢測(cè)；(1)收集經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細(xì)胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞并調(diào)整為1×106/ml。(2)向離心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混勻，350g離心5min，棄上清。(3)重復(fù)步驟2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混勻，4℃孵育45min。(5)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混勻，350g離心5min，棄上清。(6)重復(fù)步驟5兩次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入0.2ulpe-sa，混勻，37℃避光孵育15min。(8)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混勻，350g離心5min，棄上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，350g離心5min，棄上清。(10)重復(fù)步驟9兩次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。(12)octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及免疫分型檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，制備的octs-car-t細(xì)胞的感染效率大多數(shù)位于30％～40％之間，cd4陽性細(xì)胞和cd8陽性細(xì)胞的比例位于1:3～3:1之間，可以進(jìn)行后續(xù)功能檢測(cè)。實(shí)施例3octs-car-t細(xì)胞的功能檢測(cè)。一、靶細(xì)胞殺傷效果評(píng)估。(1)分別培養(yǎng)靶細(xì)胞[pdl1+k562、mesothelin+k562、pdl1+mesothelin+k562、k562細(xì)胞]和效應(yīng)細(xì)胞[octs-car-t細(xì)胞]；(2)收集靶細(xì)胞4x105cells和octs-car-t細(xì)胞2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；(4)重復(fù)步驟3一次；(5)用700ul培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸靶細(xì)胞；(6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實(shí)驗(yàn)孔，效應(yīng)細(xì)胞分別與單靶細(xì)胞和雙靶細(xì)胞共孵育的分組情況如表6所示，并設(shè)置對(duì)照組(k562細(xì)胞)，每組3個(gè)復(fù)孔；表6效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞1靶細(xì)胞2靶細(xì)胞3octs-pms-car-tpdll+k562mfsothelin+k562pdll+mesothelin+k562octs-pmt-car-tpdll+k562mesothelin+k562pdll+mesothelin+k562(7)250g，5min平板離心；(8)37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；(9)250g，5min平板離心；(10)取每個(gè)孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul終止液；(13)酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm吸光度；(14)將3個(gè)復(fù)孔取平均值；將所有實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；將靶細(xì)胞最大值的吸光值減去體積校正對(duì)照吸光值的均值。(15)將步驟14中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計(jì)算每個(gè)效靶比所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比。結(jié)果如圖10所示，octs-car-t對(duì)各自的單靶細(xì)胞和雙靶細(xì)胞均有較好的殺傷效果，tumocts結(jié)構(gòu)的car-t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率略高于seriesocts結(jié)構(gòu)的car-t細(xì)胞；殺傷效率＝(實(shí)驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔-靶細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞最大孔-靶細(xì)胞孔)x100％(16)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過對(duì)傳統(tǒng)car結(jié)構(gòu)中抗原識(shí)別區(qū)的改造形成的octs結(jié)構(gòu)，能夠顯著提高octs-car-t細(xì)胞識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞的范圍，因此octs-car-t細(xì)胞將在未來的胰腺癌、惡性間皮瘤等mesothelin陽性/pdl1陽性/mesothelin、pdl1雙陽性惡性腫瘤的細(xì)胞治療中發(fā)揮巨大的作用。序列表<110>上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種基于octs技術(shù)的胰腺癌、惡性間皮瘤car-t治療載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>hj17-13351<160>39<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct720cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac780acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc840tcactgattaagcattggtaa861<210>2<211>674<212>dna<213>人工序列<400>2cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc60ttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacca120actctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttcta180gtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct240ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttg300gactcaagacg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