專利名稱：：間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可用于間皮瘤早期診斷的間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法。
背景技術(shù)：
：近年來，具有接觸石棉經(jīng)歷的人高頻率地發(fā)生間皮瘤已經(jīng)發(fā)展成社會(huì)問題。間皮瘤有惡性的也有良性的，多數(shù)惡性間皮瘤患者具有石棉接觸經(jīng)歷，從接觸石棉起經(jīng)過30-35年的長潛伏期而發(fā)生惡性間皮瘤。因此，不能否認(rèn)今后存在間皮瘤患者增加的可能性。此外，間皮瘤是難以早期發(fā)現(xiàn)的疾病，現(xiàn)在通過使用MRI、CT等的方法來診斷間皮瘤，但這些方法難以進(jìn)行早期診斷，存在的問題是很多情況下，診斷出間皮瘤時(shí)疾病已經(jīng)處于進(jìn)展之中。僅僅考慮到這種情況，也迫切希望本疾病的早期診斷，但是目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)有效的早期診斷標(biāo)志物。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的間皮瘤相關(guān)的標(biāo)志物包括被稱作Erc、MPF和間皮素(Mesothelin)的蛋白。這其中的來龍去脈如下。首先，1994年Yamaguchi等報(bào)導(dǎo)從人胰臟癌細(xì)胞HPC-Y5上清純化出了稱作MPF(Megakaryocytepotentiatingfactor,巨核細(xì)月包強(qiáng)化因子)的蛋白(文獻(xiàn)1),而且1995年Kojima等報(bào)導(dǎo)從人胰臟癌細(xì)胞HPC-Y5的cDNA克隆化了MPF(文獻(xiàn)2)。其后，Chang等制作了與在間皮細(xì)胞、卵巢癌和間皮瘤的表面表達(dá)的40kDa表位反應(yīng)的單克隆抗體Kl,在4吏用該抗體尋找編碼其抗原蛋白的基因時(shí)，分離出了具有編碼69kDa蛋白的1884bp開放閱讀框(openreadingframe)的基因。然后Chang等又闡明該69kDa蛋白為上述40kDa蛋白的前體，該69kDa蛋白因磷脂酰肌醇特異性磷脂酶(PI-PL)的作用而被切斷，從而在細(xì)胞表面表達(dá)40KDa蛋白。這以后，Chang等將該69kDa蛋白命名為間皮素(文獻(xiàn)3)，接下來又闡明上述的MPF與間皮素是同一蛋白。另一方面，Scholler等免疫卵巢癌細(xì)胞制作了單克隆抗體OV569,并對(duì)單克隆抗體OV569所識(shí)別的蛋白進(jìn)行了檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白具有與間皮素的膜結(jié)合區(qū)域相同的序列，其分子量為42-45kDa，并將其稱作可溶性間皮素(Solublememberofmesothelin)。研究表明該蛋白在中途發(fā)生了框移突變，其結(jié)果是變成C末端區(qū)域的GPI錨定部分不同的序列，因此變?yōu)榭扇苄浴６?，使用與OV569識(shí)別相同蛋白的另一單克隆抗體4H3構(gòu)建了夾心EIA(SandwichEIA)測定系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)卵巢癌患者血清的測定結(jié)果顯示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文獻(xiàn)4)。而且，Robinson等報(bào)導(dǎo)使用該測定系統(tǒng)對(duì)間皮瘤患者進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文獻(xiàn)5)。作為本發(fā)明人的樋野等通過長年對(duì)疾病模型動(dòng)物進(jìn)行研究，搜尋了腎癌發(fā)病模型Eker大鼠的原因基因。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了與正常腎組織相比、在Eker大鼠腎癌來源的細(xì)胞系中顯示高表達(dá)的基因，并將其中的l個(gè)命名為Erc。而且，對(duì)大鼠Erc的人同源物進(jìn)行搜尋的結(jié)果表明人的MPF與大鼠Erc具有56.1%的同源性(文獻(xiàn)6、7)。根據(jù)以上情況可以認(rèn)為(l)人Erc、MPF和間皮素(以下將它們稱為"Erc/MPF/間皮素")是全長622氨基酸的糖蛋白，其第290-295位氨基酸具有RPRFRR序列，因而受到費(fèi)林(Furin)樣蛋白酶的加工，裂解為31kDa和40kDa的片段；(2)40kDa片段的C末端側(cè)區(qū)域因其C末端包含GPI錨定區(qū)域而以與細(xì)胞膜結(jié)合的形式保留下來，而N末端側(cè)的31kDa片段以可溶性蛋白的形式分泌(以下將其稱作"31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，，)；(3)此外，結(jié)合在細(xì)胞膜上的40kDa片段的C末端側(cè)也可因磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶C(phosphatidiylinositol-specificphospholipaseC:PI-PLC)處理而從細(xì)月包中釋放出來；等等。有報(bào)導(dǎo)稱這些通過不同方法鑒定出的Erc/MPF/間皮素不僅在正常間皮細(xì)胞和間皮瘤中強(qiáng)表達(dá)，而且還存在于間皮瘤患者的血液中。然而，憑借這些認(rèn)識(shí)還無法明確在間皮瘤中分泌什么類型的Erc/MPF/間皮素。目前為止，本發(fā)明人等提示上述31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在間皮瘤患者的血清中以高濃度存在，并且報(bào)導(dǎo)了據(jù)此可以診斷間皮瘤(文獻(xiàn)8)。但是，該報(bào)導(dǎo)不能對(duì)目的蛋白在患者試樣中以怎樣的狀態(tài)存在進(jìn)行可視化。此外，該報(bào)導(dǎo)中是使用識(shí)別3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區(qū)域的抗體來進(jìn)行測定，因而僅能測定完整地保持了全長的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，而不能測定C末端因某種作用分解缺損而產(chǎn)生的片段。此外，在本發(fā)明人等的報(bào)導(dǎo)之后，還有人報(bào)導(dǎo)通過檢測31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，能夠診斷間皮瘤(文獻(xiàn)9),但該報(bào)導(dǎo)中ELISA系統(tǒng)測定的MPF的測定值并非以絕對(duì)值表示。此外，在該報(bào)導(dǎo)中，雖然實(shí)際測定了間皮瘤患者和健康正常人的血清，但其結(jié)果并非以MPF的絕對(duì)值表示，而只是簡單地以吸光度表示，這樣就無法對(duì)不同試驗(yàn)的值進(jìn)行比較。推測其中的原因是無法將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與血液中的MPF進(jìn)行換算。此外，作為其中的原因，還可以推測是抗體的特異性、親和性在重組體與血液中的天然型之間不同。而且，在該報(bào)導(dǎo)中雖然對(duì)所得數(shù)個(gè)抗體之間識(shí)別表位的差異進(jìn)行了研究，但實(shí)際上僅考察了各自的表位是否不同，而并未明確各抗體的識(shí)別表位的位置。由此可以斷定現(xiàn)有技術(shù)并不適用于實(shí)用性診斷。非專利文獻(xiàn)1YamaguchiN，HattoriK,Oh-edaM,KojimaT,ImaiN,OchiN.AnovelcytokineexhibitingmegakaryocytepotentiatingactivityfromahumanpancreatictumorcelllineHPC-Y5,,JBiolChem.269:805-808,1994.PMID:8288629非專利文獻(xiàn)2Kojima,T.;Oh-eda,M.;Hattori,K.;Taniguchi，Y.;Tamura，M.;Ochi,N.;Yamaguchi,N.:MolecularcloningandexpressionofmegakaryocytepotentiatingfactorcDNA.,J.Biol.Chem.270:21984-21990，1995.PubMedID:7665620非專利文獻(xiàn)3Chang,K;Pastan,I.:Molecularcloningofmesothelin,adifferentiationantigenpresentonmesothelium,mesotheliomas,ando曹iancancers.,Proc.Nat.Acad.Sci.93:136-140,1996.PubMedID:8552591非專利文獻(xiàn)4Scholler,N;Fu,N;Yang，Y;Ye,Z;Goodman,G.E.;Hellstrom，K.E.;Hellstrom,I.:Solublemember(s)ofthemesothelin/megakaryocytepotentiatingfactorfamilyaredetectableinserafrompatientswithovariancarcinoma.，Proc.Nat.Acad.Sci.9611531-11536,1999.PubMedID:10500211非專利文獻(xiàn)5RobinsonBW,CreaneyJ，LakeR,NowakA，MuskAW，deKlerkN，WinzellP，HellstromKE,HellstromLSo固emesothelin-relatedprotein-Abloodtestformesothelioma丄ungCancer.49Suppl1:S109-111,2005.PMID:15950789非專利文獻(xiàn)6Hino0，KobayashiE，NishizawaM，KuboY,KobayashiT,HirayamaY，TakaiS，KikuchiY，TsuchiyaH，OrimotoK，etal.RenalcarcinogenesisintheEkerrat.,JCancerResClinOncol.121:602-605，1995.PMID:7559744非專利文獻(xiàn)7YamashitaY,YokoyamaM,KobayashiE，TakaiS,HinoOMappinganddeterminationofthecDNAsequenceoftheErcgenepreferentiallyexpressedinrenalcellcarcinomaintheTsc2genemutant(Eker)ratmodel.,BiochemBiophysResCommun.275(1):134-140,2000.PMID:10944454非專利文獻(xiàn)8ShiomiK,MiyamotoH，SegawaT,HagiwaraY,OtaA，MaedaM,TakahashiK,MasudaK,SakaoY,HinoO.NovelELISAsystemfordetectionofN-ERC/mesothelinintheseraofmesotheliomapatients.CancerSci.97:928-932，2006.PMID:16776777非專利文獻(xiàn)90ndaM，NagataS，HoM,BeraTK，HassanR，AlexanderRH,PastanI.Megakaryocytepotentiationfactorcleavedfrommesothelinprecursorisausefultumormarkerintheserumofpatientswithmesothelioma.ClinCancerRes.12:4225-4231，2006.PMID:16857795
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問題因此，本發(fā)明的目的是提供間皮瘤診斷劑和間皮瘤診斷試劑盒，與目前為止報(bào)導(dǎo)的間皮瘤診斷試劑盒等相比，其能夠有效地高靈敏度地識(shí)別健康正常人與間皮瘤患者，從有接觸石棉經(jīng)歷的人中鑒別出間皮瘤患者，識(shí)別肺癌等其它疾病的患者與間皮瘤患者，等等。解決問題的方法本發(fā)明人等使用間皮瘤患者來源的體液進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體液中，與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素一起還存在其分解片段。于是知曉了下述情況采用現(xiàn)有的測定系統(tǒng)無法4全測出31kDa分泌型Erc/MPF/6間皮素的片段，所述測定系統(tǒng)使用以下述多肽作為抗原而得到的抗體，所皮素的N末端和C末端的氨基酸。于是，本發(fā)明人等對(duì)能夠測定31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素與其片段這兩者的測定系統(tǒng)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)通過選擇識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的適當(dāng)部位的抗體，能夠與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素一起高靈敏度地測定其片段，其結(jié)果是能夠比傳統(tǒng)上準(zhǔn)確度更好地診斷間皮瘤；從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗體，更具體地說，本發(fā)明的抗體識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段。此外，本發(fā)明涉及以識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗體為有效成分的間皮瘤診斷劑，更具體地說，本發(fā)明涉及以下述抗體為有效成分的間皮瘤診斷劑，所述抗體識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段。而且，本發(fā)明涉及具備識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗體的間皮瘤診斷試劑盒，更具體地說，所述間皮瘤診斷試劑盒由含有第1種抗體的第1試劑、和含有第2種抗體的第2試劑組合而成；所述第1種抗體識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；所述第2種抗體識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；并且，所述第2種抗體的識(shí)別部位與所述第i種抗體的識(shí)別部位不同。而且，本發(fā)明涉及間皮瘤診斷方法，該方法采用上述間皮瘤診斷試劑盒測定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，并以該量作為指標(biāo)。發(fā)明的效果本發(fā)明的抗體不僅可以;險(xiǎn)出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，還可以檢出由31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素因種種原因而生成的片段中的N端側(cè)片段。因此，通過使用本測定系統(tǒng)，能夠測定生物體內(nèi)本來存在的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，與傳統(tǒng)上采用的測定系統(tǒng)比較，能夠準(zhǔn)確度更好地診斷間皮瘤和判斷進(jìn)展?fàn)顩r。而且，通過使用本測定系統(tǒng)，能夠進(jìn)行高靈敏度測定，而不依賴于試樣的采集條件、保存條件等。圖1顯示了單克隆抗體7E7的通過western印跡進(jìn)行的特異性試驗(yàn)的結(jié)果(這里，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結(jié)果泳道l為導(dǎo)入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的COS-l細(xì)胞的裂解液，泳道2為導(dǎo)入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的COS-l細(xì)胞的培養(yǎng)上清，泳道3為僅導(dǎo)入了載體的COS-l細(xì)胞的培養(yǎng)上清，泳道4、5、6分別為HeLa細(xì)胞、MKN-28細(xì)胞、NRC-12細(xì)胞的培養(yǎng)上清)。圖2顯示了單克隆抗體16K16的通過western印跡進(jìn)行的特異性試驗(yàn)的結(jié)果(這里，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結(jié)杲泳道l為導(dǎo)入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清，泳道2為未導(dǎo)入基因的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清，泳道3和4分別為上述兩者的細(xì)胞裂解液)。圖3顯示了單克隆抗體7E7的通過western印跡進(jìn)行的識(shí)別部位確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果(圖中x符號(hào)表示假陰性)。圖4顯示了單克隆抗體16K16的通過western印跡進(jìn)行的識(shí)別部位確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果(圖中x符號(hào)表示假陰性)。圖5顯示了多克隆抗體4的通過western印跡進(jìn)行的特異性試驗(yàn)的結(jié)果(各泳道的樣品與圖1中相同)。圖6為使用各種抗體進(jìn)行的間皮瘤患者胸腔積液中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量的測定的結(jié)果(圖中，I-VIII顯示了用于ELISA試劑盒的抗體組合(I為4和34、II為211和34、III為7E7和34、IV為211和4、V為16K16和4、VI為7E7和4、VII為34和4、VIII為7E7和16K16的組合))。圖7顯示了使用7E7-16K16試劑盒制作的代表性校正曲線。圖8顯示了采用7E7-16K16試劑盒測定的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖9顯示了使用7E7-4試劑盒制作的代表性校正曲線。圖IO顯示了采用7E7-4試劑盒測定的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖ll顯示了采用7E7-4試劑盒測定的健康正常人血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖12為采用7E7-16K16試劑盒對(duì)血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進(jìn)行測定的結(jié)果(圖中，A為對(duì)下述試樣進(jìn)行測定的結(jié)果，所述試樣是這樣獲得的采血并室溫放置l小時(shí)，再于室溫放置16小時(shí)，接著離心分離出血清，然后冷凍；B為對(duì)下述試樣進(jìn)行測定的結(jié)果，所述試樣是這樣獲得的采血并室溫放置l小時(shí)，接著離心分離出血清，再于室溫放置16小時(shí)，然后冷凍)。圖13為使用7E7-4試劑盒對(duì)血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進(jìn)行測定的結(jié)果(圖中，A為對(duì)下述試樣進(jìn)4亍測定的結(jié)果，所述試樣是這樣獲得的采血并室溫放置l小時(shí)，再于室溫放置16小時(shí)，接著離心分離出血清，然后冷凍；B為對(duì)下述試樣進(jìn)行測定的結(jié)果，所述試樣是這樣獲得的采血并室溫放置l小時(shí)，接著離心分離出血清，再于室溫放置16小時(shí)，然后冷凍)。圖14顯示了使用間皮瘤患者胸腔積液、通過單克隆抗體7E7和多克隆抗體34、211、4進(jìn)行的western印跡的結(jié)果(圖中，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結(jié)果泳道1為未處理的間皮瘤患者胸腔積液，泳道2為C末端抗體柱吸附級(jí)分，泳道3為N末端、C末端抗體柱非吸附級(jí)分，泳道4為7E7抗體柱非吸附級(jí)分，泳道5為7E7抗體柱吸附級(jí)分；箭頭表示31kDa)。圖15顯示了采用ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試劑盒)，對(duì)間皮瘤患者、健康正常者、石棉關(guān)聯(lián)疾病患者/有石棉接觸經(jīng)歷者(胸膜斑塊(胸膜7。，一夕)患者、有接觸經(jīng)歷者、石棉沉著病(石綿癥)患者、良性石棉胸膜炎患者)、肺癌患者、其它鑒別疾病患者的血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度進(jìn)行測定的結(jié)果。圖中、橫軸的MM表示間皮瘤患者、PP表示胸膜斑塊患者、Ex表示有石棉接觸經(jīng)歷者、As表示石棉沉積癥患者、BAP表示良性石棉胸膜炎患者、LC表示肺癌患者、Others表示其它識(shí)別疾病患者、Volunteers表示健康正常人。此外，圖中縱軸表示檢出的Erc/MPF/間皮素的量[ng/m匕]。發(fā)明的具體實(shí)施方式在本說明書中，對(duì)于"31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽(以下稱為"N片段，，)，，沒有特殊限制，只要是具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的、31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽即可。在SEQIDNO:l中，第1位的曱硫氨酸第33位的脯氨酸為信號(hào)序列，作為N片段，優(yōu)選除去了信號(hào)序列氨基酸的肽。對(duì)于N片段中缺失的C末端的氨基酸的數(shù)目，沒有特殊限制，只要是l個(gè)以上即可，可以列舉出例如5個(gè)以上、IO個(gè)以上、15個(gè)以上、20個(gè)以上、25個(gè)以上、30個(gè)以上、35個(gè)以上、40個(gè)以上等。作為N片段中缺失的C末端的氨基酸的數(shù)目，對(duì)其上限沒有特殊限制，可以列舉出例如155個(gè)、150個(gè)、100個(gè)、90個(gè)、80個(gè)、70個(gè)、65個(gè)、60個(gè)等。此外，作為N片段，可以列舉出例如將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段。作為所使用的體液，對(duì)其沒有特殊限制，可以列舉出例如血液、血清、血漿、胸腔積液、尿或腹水，優(yōu)選血液或血清。此外，對(duì)于放置的時(shí)間沒有特殊限制，優(yōu)選為l小時(shí)以上，更優(yōu)選為2小時(shí)以上，最優(yōu)選為3小時(shí)以上。作為本說明書中的N片段，其為例如將具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列(該序列相當(dāng)于登錄號(hào).AAV87530所述的人Erc/MPF/間皮素氨基酸序列的第1~295位)的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中于室溫放置3小時(shí)以上而生成的片段中的、N端側(cè)片段，其包括長度不同的多個(gè)片段。此外，本說明書中的N片段優(yōu)選下述抗體不能識(shí)別的片段，所述抗體是以通常的抗體制作中使用的包含C末端氨基酸的多肽為抗原、按常規(guī)方法制作的抗體。作為本說明書中的N片段，更優(yōu)選下述片段，所述片段是31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素分解產(chǎn)生的片段，并且其具有31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素氨基酸序列(SEQIDNO:l)中的第34229位(優(yōu)選第34139位、特別優(yōu)選第68~139位)的氨基酸序列。在本說明書中，"間皮瘤"是指間皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤，更具體地說，可以列舉出例如上皮型間皮瘤、肉瘤型間皮瘤、二相性間皮瘤等。對(duì)于本發(fā)明的抗體沒有特殊限制，只要是識(shí)別N片段的抗體即可。作為N片段，可能存在多個(gè)片段，本發(fā)明的抗體只要能夠作為間皮瘤的診斷劑應(yīng)用即可，并非必須要識(shí)別所有的片段，識(shí)別這些片段中的一部分也是可以的。作為本發(fā)明的抗體，優(yōu)選識(shí)別2種以上N片段的抗體。作為本發(fā)明的抗體，可以列舉出例如識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時(shí)以上而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段的抗體。作為本發(fā)明的抗體，更優(yōu)選識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素、及N片段這兩者的抗體。作為這樣的抗體，可以列舉出例如識(shí)別在31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段中保守的氨基酸序列的抗體。作為這樣的識(shí)別部位，可以列舉出例如以下(a)(d)的氨基酸序列(SEQIDNO:2~5),這其中優(yōu)選(a)(c)，更優(yōu)選(b)或(c)。(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第3451位SEQIDNO:2)(b)GFPCAE(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第6873位SEQIDNO:3)(c)PQACTH(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第134~139位SEQIDNO:4)(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第211229位SEQIDNO:5)對(duì)于本發(fā)明抗體的來源沒有特殊限制，也可以不是人來源的抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體，因其識(shí)別部位明確。本發(fā)明的抗體可以這樣制備以完整的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或其一部分作為抗原，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法例如《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座續(xù)編(続生化學(xué)実験講座)、免疫生物化學(xué)研究方法(免疫生化學(xué)研究法)》(日本生化學(xué)會(huì)編)等所述的方法獲得抗體，利用與N片段中保守的氨基酸序列的一部分一致的多肽等對(duì)這些抗體進(jìn)行篩選，從而進(jìn)行選擇。在本發(fā)明抗體的制造中，作為抗原使用的完整31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或其一部分可以列舉出用合成儀合成的與SEQIDNO:1的氨基酸序列的第1295位、優(yōu)選第35295位的全部或者一部分一致的多肽；或者，將編碼上述氨基酸序列的cDNA(SEQIDNO:6)的全長或者一部分按常規(guī)方法導(dǎo)入載體、使用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等宿主微生物或培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌等宿主微生物或培養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行生產(chǎn)，從而得到重組體蛋白或多肽，再用親和柱、鎳柱等進(jìn)行純化而得到的多肽等。此外，與編碼上述氨基酸序列的cDNA的全長或者一部分一致的多核苷酸可以這樣獲得以大鼠Erc/MPF/間皮素cDNA等哺乳動(dòng)物來源的Erc/MPF/間皮素cDNA作為探針，從人腫瘤細(xì)胞系等cDNA文庫進(jìn)行克隆。具體而言，制備本發(fā)明抗體的規(guī)程如下。即，為了以多克隆抗體的形式制備本發(fā)明的抗體，首先，采用PCR法制作編碼人31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的cDNA序列(SEQIDNO:6)的多核苷酸。然后，將其插入pGEX等載體，將該載體導(dǎo)入大腸桿菌等宿主微生物，用LB培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)來生產(chǎn)多肽的重組體蛋白。然后，以所得重組體蛋白為抗原，將其溶解在磷酸鈉緩沖液(PBS)中，再使它們與弗氏完全佐劑或不完全佐劑或者明礬等輔劑(補(bǔ)助剤)結(jié)合，然后以此為免疫原對(duì)哺乳動(dòng)物等進(jìn)行免疫。作為免疫的動(dòng)物，可以使用本領(lǐng)域常用的動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔、羊、馬或雞等。此外，作為免疫時(shí)免疫原的施用方法，可以是皮下注射、腹腔內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射或肌肉內(nèi)注射，優(yōu)選皮下注射或腹腔內(nèi)注射。免疫可以進(jìn)行l(wèi)次，或者可以以合適的間隔、優(yōu)選以1周5周的間隔，進(jìn)行多次。最后，按照常規(guī)方法，從免疫后的動(dòng)物采集血液，從該血液分離出血清，從血清中采用下述方法獲得作為多克隆抗體的本發(fā)明的抗體使用固定有用作抗原的重組體蛋白的柱子來進(jìn)行親和柱層析，這樣來進(jìn)行抗原特異純化，從而獲得作為多克隆抗體的本發(fā)明的抗體。此外，為了以單克隆抗體的形式制備本發(fā)明的抗體，按照單克隆抗體制備的常規(guī)方法例如《抗肽抗體實(shí)驗(yàn)規(guī)程(抗^7。千K抗體実験7?？诓?一小)》(大海忍、辻村邦夫、稻垣昌樹著，秀潤社，1994年)、《單克隆抗體實(shí)驗(yàn)指南(単夕口一乂抗體實(shí)験7二二7》)》(富山朔二安東民衛(wèi)/編著、講談社、1987年)等所述的方法，用上述重組體蛋白免疫動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞，將該免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合從而得到雜交瘤，從該雜交瘤的培養(yǎng)物中采集抗體。對(duì)于這樣采集的抗體，通過使用96孔微型滴定板的EIA方法進(jìn)行篩選，可以獲得作為單克隆抗體的本發(fā)明的抗體，其中，所述96孔微型滴定板上固定有用作抗原的、重組體蛋白或具有上述氨基酸序列的合成肽等。體所特別優(yōu)選的識(shí)別下述氨基酸序列(b)或(c)的單克隆抗體，可以這樣獲得通過使用微型滴定板的EIA法，對(duì)上述從雜交瘤的培養(yǎng)物采集的抗體，進(jìn)12行進(jìn)一步篩選，其中，所述微型滴定板上固定了以下的氨基酸序列(a)或(b)作為抗原。(b)GFPCAE(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第68~73位SEQIDNO:3)(c)PQACTH(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第134-139位SEQIDNO:4)如此獲得的本發(fā)明的抗體，可以根據(jù)需要進(jìn)行標(biāo)記或固定化，來制備成適于本發(fā)明的本發(fā)明診斷劑的形式。這其中，標(biāo)記可以通過結(jié)合辣根過氧化物酶(以下稱為"HRP")、堿性磷酸酶等酶，異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光物質(zhì)，32P、1251等放射性物質(zhì)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記物質(zhì)來進(jìn)行。此外，固定化可以通過將本發(fā)明的抗體結(jié)合在合適的固相上來進(jìn)行。作為固相，可以使用免疫化學(xué)測定法中常用的任何固相，可以列舉出例如聚苯乙烯制的96孔微型滴定板、氨基結(jié)合型微型滴定板等板，各種珠子。為了將本發(fā)明的抗體固定化，例如可以將包含抗體的緩沖液加在載體上，并進(jìn)行、、曰古/皿3。此外，本發(fā)明的間皮瘤診斷試劑盒(以下稱為"本發(fā)明試劑盒")可以這樣制作使用視需要進(jìn)行了標(biāo)記或固定化的本發(fā)明的抗體，此外再組合稀釋用緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、底物用緩沖液、終止液、清洗液等，按照常規(guī)方法來制備。本發(fā)明的間皮瘤診斷試劑盒優(yōu)選具備識(shí)別3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的2種抗體，更優(yōu)選具備識(shí)別部位各不相同的、識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的2種抗體。具體而言，在使用2種本發(fā)明的抗體來制作本發(fā)明試劑盒時(shí)，可以組合使用含有識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的第1種抗體的第1試劑(例如固定化抗體)，以及含有作為識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗體的、與上述第1種抗體識(shí)別部位不同的第2種抗體的第2試齊'J(例如標(biāo)記抗體)。作為用于本發(fā)明試劑盒的第1種抗體和第2種抗體的組合，沒有特殊限制，可以列舉出例如識(shí)別部位包含于31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的全長氨基酸序列(SEQIDNO:1)的第34229位、優(yōu)選第34139位、特別優(yōu)選第68139位的氨基酸序列中的抗體的組合。作為第l種抗體和第2種抗體的具體例子，可以列舉出識(shí)別以下(a)(d)中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列(SEQIDNO:25)的抗體的組合；這些組合中，優(yōu)選識(shí)另'J(a)或(b)所述的氨基酸序列的抗體、與識(shí)別(c)或(d)所述的氨基酸序列的抗體的組合，更優(yōu)選識(shí)別(a)或(b)所述的氨基酸序列的抗體、與識(shí)別(c)所述的氨基酸序列的抗體的組合，特別優(yōu)選(b)與(c)的組合。(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第3451位:SEQIDNO:2)(b)GFPCAE(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第6873位SEQIDNO:3)(c)PQACTH(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第134~139位SEQIDNO:4)(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第211229位SEQIDNO:5)如上述地制作的本發(fā)明診斷劑和本發(fā)明試劑盒，通過其中包含的本發(fā)明的抗體，不僅可以測定間皮瘤患者的各種體液中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，還可以測定因各種原因而產(chǎn)生的片段。作為使用本發(fā)明診斷劑和本發(fā)明試劑盒的具體的、31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素與其片段這兩者的存在或量的測定方法，可以列舉出放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvalletal.,(1980):MethodsinEnzymol.，70,419-439)、焚光抗體法、斑塊法(7。，一夕法)、斑點(diǎn)法(7求:y卜法)、凝集法、奧克特洛尼(Ouchterlony)法、免疫色譜法等、通常在免疫化學(xué)測定法中使用的各種方法(《雜交瘤法與單克隆抗體》，抹式會(huì)社R&DPlanning發(fā)行，第30頁~第53頁，昭和57年3月5曰)。便性等觀點(diǎn)來看，優(yōu)選ELISA法。更具體地，關(guān)于31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素及其片段的測定，以ELISA法中的一種即夾心法為例，將其規(guī)程說明如下。首先，作為步驟(A),將識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的第一種抗體(以下稱為"第一抗體，，)固定在載體上。然后，作為步驟(B),將未固定抗體的載體表面用與第一抗體無關(guān)的例如蛋白等封閉起來。而且，作為步驟(C)，向其上加入包含各種濃度的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣，生成31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段、與第一抗體的復(fù)合體。其后，作為步驟(D)，加入標(biāo)記的第二種抗體(以下稱為"第二抗體，，)，使其與上述復(fù)合體結(jié)合，其中，所述第二種抗體識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽，且其識(shí)別的部位與固定化的第一抗體的識(shí)別部位不同。最后，作為步驟(E),通過測定上述復(fù)合體的標(biāo)記量，可以從預(yù)先制作好的校正曲線確定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的總量。具體地，在步驟(A)中，對(duì)于用于固定第一抗體的載體，沒有特殊限制，可以使用免疫化學(xué)測定法中常用的任何載體。具體地可以列舉出聚苯乙烯制的9.6孔微型滴定板、或者氨基結(jié)合型微型滴定板。此外，為了固定第一抗體，例如可以將包含上述抗體的緩沖液加在載體上，并進(jìn)行溫育。作為緩沖液，可以使用公知緩沖液，可以列舉出例如10mM的PBS。緩沖液中的上述抗體的濃度可以從一個(gè)寬范圍中選擇，通常為0.01~100|ig/ml左右，優(yōu)選為0.1~20)ig/ml。此外，在使用96孔微型滴定板作為載體時(shí)，希望為300|_11/孔以下、20~150|^1/孔左右。而且，對(duì)于溫育條件沒有特殊限制，通常4'C左右溫育一夜是合適的。此外，在步驟(A)中的固定了第一抗體的載體上，有些情況下會(huì)存在與抗原抗體反應(yīng)無關(guān)地吸附此后添加的試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的部分，出于防止這種情況的目的，進(jìn)行步驟(B)的封閉。作為封閉劑，可以使用例如BSA、脫脂乳溶液、Block-Ace(大日本制藥生產(chǎn)(編號(hào).UK-25B))等市售的封閉劑。對(duì)于具體的封閉沒有限定，例如可以這樣進(jìn)行向固定了抗原的部分上添加適量的Block-Ace，約4"C溫育一夜，然后用緩沖液進(jìn)行清洗。而且，在步驟(C)中，使包含31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣與固定化的第一抗體接觸，用該固定化的第一抗體捕捉試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段，從而生成復(fù)合體。對(duì)于用來生成該復(fù)合體的條件沒有限定，可以在4。C37。C左右反應(yīng)約1小時(shí)~1夜。反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選用緩沖液清洗載體，來除去未反應(yīng)的蛋白等。作為用于該反應(yīng)的緩沖液，優(yōu)選具有10mM的PBS(pH7.2)和0.05。/。(v/v)的Tween20的組成的緩沖液。此外，進(jìn)一步在步驟(D)中，向固定化的第一抗體與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段的復(fù)合體加入與固定化的第一抗體識(shí)別部位不同的標(biāo)記的第二抗體，從而生成由固定化第一抗體-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標(biāo)記的第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體。該反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選用緩沖液清洗載體，來除去未反應(yīng)的蛋白等。作為用于該反應(yīng)的緩沖液，可以使用上述的緩沖液。該步驟(D)中使用的標(biāo)記的第二抗體的量為稀釋成固定化第一抗體的約5，000~10，000倍的量，優(yōu)選稀釋為最終吸光度為1.52.0的量。稀釋可以使用緩沖液，對(duì)于反應(yīng)條件沒有特殊限制，可以優(yōu)選在4。C37。C左右進(jìn)行約1小時(shí)，反應(yīng)后用緩沖液進(jìn)行清洗。通過以上反應(yīng)，能夠生成由固定化的第一抗體-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標(biāo)記的第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體。最后在步驟(E)中，向固定化的第一抗體-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標(biāo)記的第二抗體的復(fù)合體加入與標(biāo)記物質(zhì)反應(yīng)的生色底物溶液，測定吸光度。當(dāng)上述反應(yīng)中使用過氧化物酶作為標(biāo)記物質(zhì)時(shí)，例如可以使用包含過氧化氫和3，3',5,5'-四曱基聯(lián)苯胺(以下稱為"TMB，，)的生色底物溶液。此外，吸光度可以這樣測定向由固定化的第一抗體-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標(biāo)記的第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體加入生色底物溶液，約25。C反應(yīng)約30分鐘，然后加入1~2N的石危酸來終止酶反應(yīng)，在450nm的波長下進(jìn)行測定。另一方面，當(dāng)使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物質(zhì)時(shí)，采取下述方法是合適的以磷酸對(duì)硝基苯酯作為底物來生色，加入2N的氫氧化鈉來終止酶反應(yīng)，測定415nm處的吸光度。而且，將已知濃度的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素用于上述夾心法等，預(yù)先作成校正曲線，使用該校正曲線能夠計(jì)算出試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量。通過上述測定方法等，能夠計(jì)算出試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片^:的量、即生物體內(nèi)本來存在的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，據(jù)此，可以從健康正常者中診斷出間皮瘤患者、區(qū)分間皮瘤患者的外科手術(shù)是否成功、預(yù)見間皮瘤的復(fù)發(fā)等。對(duì)于用于間皮瘤診斷等的試樣沒有特殊限制，只要是存在31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣即可，可以列舉出例如全血、血清、血漿、尿、淋巴液、胸腔積液(胸水)、腹水等體液。在這些試樣中，優(yōu)選血清、血漿、胸腔積液或腹水。16具體地，間皮瘤的診斷可以以試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量為指標(biāo)，當(dāng)判定該量與健康正常者的平均值相比顯著地高時(shí)，診斷為間皮瘤。作為判定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量與健康正常者的平均值相比顯著地高的指標(biāo)的例子，可以列舉出例如采用從健康正常人血清組獲得的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量的平均值+2x標(biāo)準(zhǔn)偏差的值、優(yōu)選從健康正常人血清組獲得的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量的平均值+5x標(biāo)準(zhǔn)偏差的值，作為統(tǒng)計(jì)學(xué)上的截留值，但不限于此。而且，上述間皮瘤的診斷中，還可以用試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的濃度來代替試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量作為指標(biāo)。此外，間皮瘤的外科手術(shù)是否成功，或復(fù)發(fā)的預(yù)測，可以基于間皮瘤患者試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量因有無間皮瘤細(xì)胞的存在而變化來進(jìn)行。即，在間皮瘤外科手術(shù)前后測定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量，比較手術(shù)前后的該量，如果手術(shù)后的量顯著低于手術(shù)前的量，則可以確認(rèn)通過該外科手術(shù)除去了間皮瘤細(xì)胞。此外，如果在間皮瘤外科手術(shù)后也對(duì)試樣中3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量進(jìn)行監(jiān)測，則在該量增加時(shí)，可以預(yù)測存在間皮瘤細(xì)胞即出現(xiàn)復(fù)發(fā)。通過使用本發(fā)明診斷劑和本發(fā)明試劑盒測定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量，不僅可以如上述地從健康正常者中診斷出間皮瘤患者、區(qū)分間皮瘤患者的外科手術(shù)是否成功、預(yù)見間皮瘤的復(fù)發(fā)等，還可以用來從有石棉接觸經(jīng)歷者中鑒別間皮瘤患者、識(shí)別皮瘤患者與肺癌等其它疾病的患者。即，有石棉接觸經(jīng)歷者中胸膜胼胝(pleuralcallosity)、良性胸膜炎、肺纖維癥、肺癌等的發(fā)病率被認(rèn)為高于健康正常者。但是，這些疾病中，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的測定值顯著低于間皮瘤患者，可以與間皮瘤患者區(qū)分開來。這對(duì)治療方法的最優(yōu)化是非常有用的。即，如果能夠識(shí)別間皮瘤患者與例如肺癌患者，那么就可以采取完全不同的治療策略。這樣可以避免枉然施用無效抗癌劑而給患者造成痛苦，可以成為面向近年受到關(guān)注的定制醫(yī)療的策略。實(shí)施例17以下，通過實(shí)施例更具體地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1單克隆抗體的制作(l):(1)免疫用抗原的制作以完整人Erc/MPF/間皮素cDNA(登錄號(hào).AY743922)為模板，使用以下所示的引物No.5，-3和No.3，-3，對(duì)與SEQIDNO:1所表示的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的氨基酸序列的第35位~295位區(qū)域?qū)?yīng)的核苷酸(SEQIDNO:6的核苷酸序列的103885位)進(jìn)行了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR法)擴(kuò)增。然后，在上述得到的寡核苦酸上附加編碼GST(GlutathioneS-transferase)標(biāo)簽的序列，并在其C末端側(cè)區(qū)域附加編碼組氨酸(Histidine)標(biāo)簽的序列，將該GST-31kDa分泌型間皮素-His區(qū)域插入pGEX-6P-l(Amershambiosciences公司制造)，以此作為表達(dá)載體，將其導(dǎo)入大腸桿菌，以融合蛋白的形式進(jìn)行了表達(dá)。引物No.5，-3(SEQIDNO:7):5，陽ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3'引物No.3，-3(SEQIDNO:8):5，-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA隱3'將該大腸桿菌在5mL添加氨千西林的LB培養(yǎng)基中37。C振蕩培養(yǎng)一夜。再將其加入到l，OOOmL的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，添加500mM的異丙基-l-硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)lmL，再振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。將這樣獲得的培養(yǎng)液于4。C、6,000rpm離心分離15分鐘，將沉淀用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗2次。其后，加入添加有l(wèi)mM的EDTA、1%的TritonX-100的20mMTris-HC1緩沖液(pH7.4)20ml，對(duì)該液進(jìn)行30秒x4次的超聲波處理來破碎菌體，提取目的蛋白后，于4。C、10,000rpm、離心分離30分鐘，獲得了上清。從該上清中使用谷胱甘肽-sepharose珠子Glutathion-sepharosebeads:Amershambiosciences公司制造)純化出GST-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His蛋白后，通過PreScission蛋白酶(PreScissionProtease:Amershambiosciences公司制造)處理切除GST部分，得到了3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His。(2)單克隆抗體的制作使用上述(l)獲得的蛋白作為免疫用抗原，每隔1周或2周施用50pl(50iig)來免疫小鼠?？乖瓋H在初次免疫中與弗氏完全佐劑混和，而在第二次以后與弗氏不完全佐劑混和。將免疫化小鼠的脾單核細(xì)胞和融合配偶體(partner)X63-Ag8-653用于聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合，按文獻(xiàn)(J.Immunol.146:3721-3728)所述方法選擇出雜交瘤。該選擇通過選#^與固定化31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素反應(yīng)的細(xì)胞來進(jìn)行。使上述選擇的細(xì)胞在作為無血清培養(yǎng)基的GIT培養(yǎng)基(和光純藥)中產(chǎn)生抗體，直至80%的細(xì)胞死亡。然后，對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行離心(l,OOOrpm、15分鐘)來除去細(xì)胞，再添加硫酸銨至50%飽和狀態(tài)，于4。C靜置一夜，通過離心回收了沉淀(l,OOOrpm、30分鐘)。進(jìn)一步，將該沉淀溶解在2倍稀釋的結(jié)合緩沖液(bindingbuffer:ProteinAMAPSIIkit制造)中，然后在蛋白A柱(Pharmacia-Amersham制造)上吸附IgG。其后，進(jìn)行一夜的PBS透析來純化抗體，得到了多種識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的抗體。并且，將這些抗體中的兩個(gè)命名為7E7和16K16。(3)利用western印跡確認(rèn)單克隆抗體7E7和16K16的特異性使用在COS-l細(xì)胞或者CHO細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)的Erc/MPF/間皮素蛋白等樣品，通過western印跡確認(rèn)了上述(2)中所得單克隆抗體7E7和16K16識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素。在進(jìn)行western印跡之前，向每種樣品中添加2-巰基乙醇(2Me)來使之處于還原狀態(tài)。western印跡按常規(guī)方法(例如《分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)方法(分子生物學(xué)基礎(chǔ)実験法)》，南江堂)進(jìn)行。western印跡的結(jié)果示于圖1和圖2。根據(jù)圖1和圖2，使用單克隆抗體7E7和16K16中的任何一個(gè)，對(duì)于強(qiáng)制表達(dá)的Erc/MPF/間皮素樣品，在71kDa完整型Erc/MPF/間皮素和31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的表達(dá)部位上均有條帶，可以確認(rèn)這些抗體對(duì)Erc/MPF/間皮素具有反應(yīng)性。實(shí)施例2單克隆抗體7E7和16K16的抗原識(shí)別部位的探索制作了六個(gè)六個(gè)氨基酸地缺損(即逐次地缺損六個(gè)氨基酸)31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區(qū)域的一系列融合蛋白，使它們與單克隆抗體7E7和16K16反應(yīng)，來探索抗原識(shí)別部位。首先，以實(shí)施例1中制作的GST-31kDa分泌型間皮素-His區(qū)域?yàn)槟０?，制作能夠六個(gè)六個(gè)地缺失氨基酸的反義引物，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行了擴(kuò)增。接下來，將其插入pGEX-6P-1(Amershambiosciences公司制造)，以此作為表達(dá)載體，再將其導(dǎo)入大腸桿菌。將該大腸桿菌在5mL添加氨千西林的LB培養(yǎng)基中37。C振蕩培養(yǎng)一夜。再將其加入到1,OOOmL的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，添加500mM的異丙基-l-硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)lmL，再振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。將這樣獲得的培養(yǎng)液于4°C、6，OOOrpm離心分離15分鐘，將沉淀用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗2次。其后，加入添加有l(wèi)mM的EDTA、1%的TritonX-100的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.4)20ml，對(duì)該液進(jìn)行30秒x4次的超聲波處理來破碎菌體，提取目的蛋白后，于4。C、10,OOOrpm、離心分離30分鐘，獲得了上清。從該上清中使用谷胱甘肽-sepharose玉朱子Glutathion-sepharosebeads:Amershambiosciences7/^司制造)纟屯"f匕出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素逐次缺損六個(gè)氨基酸而得到的GST-31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His缺損蛋白。接下來，對(duì)于這些缺損蛋白，利用單克隆抗體7E7和16K16按常規(guī)方法(例如《分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)方法(分子生物學(xué)基礎(chǔ)実験法)》，南江堂)進(jìn)行western印跡和斑點(diǎn)印跡，確定了其識(shí)別部位。western印跡和斑點(diǎn)印跡的結(jié)果如圖3和圖4所示。對(duì)應(yīng)于圖3和圖4中的1~6和AH的蛋白的氨基酸序列如表l所示。表中的數(shù)字表示從31kDa分泌型間皮素的N末端起向其C末端方向的連續(xù)的氨基酸的個(gè)數(shù)。根據(jù)該圖可以判明單克隆抗體7E7抗體識(shí)別134位~139位的區(qū)域，而單克隆抗體16K16識(shí)別N末端起第684立~734i的區(qū)i或。表1123456AGST-hERC24719915110355已2892411931459749C2832351871399143D27722918113385GSTE27122317512779-mRNAF26521716912173-mRNAG25921116311567GST-hERCH25320515710961GST實(shí)施例3多克隆抗體的制作(l):20(1)免疫用抗原的制作酸序列(d)的肽，從伊藤HAM抹式會(huì)社購買了HPLC色語純化的制品。將該肽作為用于多克隆抗體制作的抗原。(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第21卜229位SEQIDNO:5)(2)多克隆抗體的制作等量混合(l)中制作的肽100嗎和弗氏完全佐劑來制作乳液，用該乳液對(duì)兔進(jìn)行了免疫。免疫1周后，等量混合抗原lOO(ig與弗氏不完全佐劑來制作乳液，對(duì)兔進(jìn)行了附加免疫，此后進(jìn)行3次相同操作，每次間隔為一周。其后，在采用固定化有抗原肽的ELISA法確認(rèn)到對(duì)免疫原的效價(jià)上升后，采全血，1500rpm離心15分鐘，從而分離出抗血清，使用結(jié)合有抗原肽的親和柱進(jìn)行抗原特異純化，得到了多克隆抗體。而且，將該抗體命名為211抗體。實(shí)施例4多克隆抗體的制作(2):(1)免疫用抗原的制作對(duì)于具有下述氨基酸序列的肽，從伊藤HAM抹式會(huì)社購買了HPLC色譜純化的制品，所述氨基酸序列為在相當(dāng)人31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素內(nèi)部序列的下述氨基酸序列(a)的C末端側(cè)又附加了半胱氨酸(C)而得到的氨基酸序列。將該肽作為用于多克隆抗體制作的抗原。(a)SRTLAGETGQEAAPLDGVC(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第34~51位SEQIDNO:2)(2)多克隆抗體的制作等量混合(l)中制作的肽100嗎和弗氏完全佐劑來制作乳液，用該乳液對(duì)兔進(jìn)行了免疫。免疫l周后，等量混合抗原IOO昭與弗氏不完全佐劑來制作乳液，對(duì)兔進(jìn)行了附加免疫，此后進(jìn)行3次相同操作，每次間隔為一周。其后，在采用固定化有抗原肽的ELISA法確認(rèn)到對(duì)免疫原的效價(jià)上升后，采全血，1500rpm離心15分鐘，從而分離出抗血清，使用結(jié)合有抗原肽的親和柱進(jìn)行抗原特異純化，得到了多克隆抗體。而且，將該抗體命名為34抗體。21參考例1多克隆抗體的制作(1)免疫用抗原的制作對(duì)于具有下述氨基酸序列的肽，從Auspep公司購買了HPLC色譜純化的制品，所述氨基酸序列為在相當(dāng)人3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素內(nèi)部序列的下述氨基酸序列(e)的C末端側(cè)又附加了半胱氨酸(C)而得到的氨基酸序列。將該肽作為用于多克隆抗體制作的抗原。(e)RQPERTILRPRFRR(SEQIDNO:1的氨基酸序列的第282295位SEQIDNO:9)(2)多克隆抗體的制作等量混合(l)中制作的肽100嗎和弗氏完全佐劑來制作乳液，用該乳液對(duì)兔進(jìn)行了免疫。免疫1周后，等量混合抗原IOO嗎與弗氏不完全佐劑來制作乳液，對(duì)兔進(jìn)行了附加免疫，此后進(jìn)行3次相同操作，每次間隔為一周。其后，在采用固定化有抗原肽的ELISA法確認(rèn)到對(duì)免疫原的效價(jià)上升后，采全血，1500rpm離心15分鐘，從而分離出抗血清，使用結(jié)合有抗原肽的親和柱進(jìn)行抗原特異純化，得到了多克隆抗體。而且，將該抗體命名為4抗體。(3)利用western印跡確認(rèn)多克隆抗體4的特異性接下來，為了確認(rèn)(2)中所得多克隆抗體4識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，使用多克隆抗體4,對(duì)在COS-l細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)的Erc/MPF/間皮素蛋白等，按如前述的常規(guī)方法進(jìn)行了western印跡。western印跡的結(jié)果如圖5所示。樣品與實(shí)施例1(3)中使用的相同。根據(jù)該圖，可以確認(rèn)該抗體4對(duì)強(qiáng)制表達(dá)的Erc/MPF/間皮素樣品具有反應(yīng)性。實(shí)施例5間皮瘤患者胸腔積液中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素量的測定組合實(shí)施例1、3、4和參考例1中制作的單克隆抗體或多克隆抗體，采用實(shí)施例6和參考例2中描述的方法構(gòu)建ELISA系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)測定了間皮瘤患者胸腔積液中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。其結(jié)果示于圖6。根據(jù)該圖，使用單克隆抗體7E7和16K16的組合、單克隆抗體7E7和多克隆抗體34的組合、單克隆抗體211和多克隆抗體34的組合測得的胸22腔積液中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度依次升高。此外，根據(jù)該結(jié)果，采用4抗體的系統(tǒng)測得的濃度低，可知胸腔積液中直至C末端均得以保持的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素分子種類(分子種)少。另一方面，在采用34抗體的系統(tǒng)方面，測得的濃度按7E7抗體〉211抗體的順序降低，還可以判明保持了N末端的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素分子種類自C末端側(cè)開始分解缺損，但該缺損未到達(dá)7E7抗體所識(shí)別的部位。實(shí)施例6ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試劑盒)的制作(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作將抗體制作時(shí)所用的抗原蛋白(31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His)作為基準(zhǔn)，測定COS-l細(xì)胞表達(dá)的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度，以此作為ELISA測定系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。(2)單克隆抗體16K16與HRP的結(jié)合物的制作如以下地制作了實(shí)施例1所得單克隆抗體16K16與HRP的結(jié)合物。將必要量的HRP溶于蒸餾水，并用Nal04進(jìn)行氧化，然后在pH4.4的lmM醋酸緩沖液中透析一夜。此外，將l-10mg的單克隆抗體16K16在pH9.5的0.1M石灰酸緩沖液中透析一夜。將這些透析過的16K16抗體與HRP混合起來，使得相對(duì)于抗體lmg、HRP為0.4mg,室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后，向其中加入NaBH4，在冰中反應(yīng)2小時(shí)，然后在PBS中透析一夜。而且，對(duì)該反應(yīng)物進(jìn)行凝膠過濾，制作了單克隆抗體16K16與HRP的結(jié)合物。(3)ELISA測定系統(tǒng)的制作夾心ELISA法的構(gòu)建如下進(jìn)行。首先，在96孔ELISA用板中分別加入10嗎/ml的7E7抗體100^1。然后，使之在4。C反應(yīng)一夜后，在1。/oBSA/PBS/NaN3溶液中進(jìn)行封閉，作為夾心ELISA用板。此外，以上述(2)中制作的單克隆抗體16K16與HRP的結(jié)合物作為標(biāo)記抗體。將適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試樣添加到各孔中，37。C反應(yīng)1小時(shí)(l次反應(yīng))，清洗后加入HRP(horseradishperoxidase)標(biāo)記的單克隆抗體16K16,4。C反應(yīng)30分鐘(2次反應(yīng))，清洗后加入含四曱基聯(lián)苯胺(TetraMethylBenzidine(TMB))的底物液，室溫放置30分鐘，加入反應(yīng)終止液(1N的H2S04)終止反應(yīng)后，測定波長450nm處的吸光度，使用由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作的校正曲線，計(jì)算出試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。23圖7示出了代表性的校正曲線制作例。此外，圖8示出了使用本測定系統(tǒng)測定的各種培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。其結(jié)果可知HeLa細(xì)胞中大量地產(chǎn)生31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素。參考例2ELISA測定系統(tǒng)(7E7-4試劑盒)的制作(l)多克隆抗體4與HRP的結(jié)合物的制作按與實(shí)施例6的(2)相似的方式制作了參考例1中所得多克隆抗體4與HRP的結(jié)合物。P)ELISA測定系統(tǒng)的制作使用實(shí)施例1所得單克隆抗體7E7與參考例1所得多克隆抗體4的夾心ELISA法的構(gòu)建如下進(jìn)行。首先，向96孔ELISA用板中分別加入10(ig/ml的單克隆抗體7E7100lil。然后，使之在4。C反應(yīng)一夜后，在l%BSA/PBS/NaN3溶液中進(jìn)行封閉，以此作為夾心ELISA用板。此外，以上述(l)中制作的多克隆抗體4與HRP的結(jié)合物作為標(biāo)記抗體。將適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試樣添加到各孔中，37。C反應(yīng)1小時(shí)(l次反應(yīng))，清洗后加入HRP(horseradishperoxidase)標(biāo)記的4抗體，4。C反應(yīng)30分鐘(2次反應(yīng))，清洗后加入含四曱基聯(lián)苯胺(TetraMethylBenzidine(TMB))的底物液，室溫放置30分鐘，加入反應(yīng)終止液(1N的H2S04)終止反應(yīng)后，測定波長450nm處的吸光度，使用由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作的校正曲線，計(jì)算出試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖9示出了代表性的校正曲線的制作例。此外，圖IO示出了使用本測定系統(tǒng)測定的各種培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。而且，圖11示出了健康正常人血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。健康正常人血清中的健康正常人血清的平均值為7.66ng/ml，添加肝素的血漿為10.60ng/ml,添加EDTA的血漿為11.77ng/ml。實(shí)施例7各種患者血清的測定使用實(shí)施例6中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試劑盒)，如下地測定了間皮瘤患者27例、胸膜胼胝患者28例、良性胸膜炎和彌散性胸膜胼胝患者6例、有石棉接觸經(jīng)歷的肺纖維癥11例、和其它鑒別疾病(包括肺癌)8例的血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度。此外，作為比較，使用參考例2中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-4試劑盒)進(jìn)行了相同的測定。血清樣品在采集后立即用PBS稀釋8倍，然后按實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行測定。根據(jù)稀釋樣品的吸光度求出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度，而且，由該濃度換算出原液濃度(8倍)。該測定結(jié)果示于表2。表2病例間皮瘤(全部)胸膜胼胝良性胸膜炎/彌散性胸膜辨月氐膝露/肺纖維癥其它鑒別疾病(包括肺癌)試劑盒種類*ABABA已A巳A已1.080.620.746.741.180.301.970.581.310481.060.800.930.741.800.751.990.031.690.741.641.121.320.242.521.972.801.221950."1.951.241.681.262.550.573.072.103.536.572-601.182.151.363.411.103.231.083.770.682.981.042.161.104.001.983.264.134.250.993.080.852.301.04—3.641.966.034.333.291,622.422.25—3.831.009.761.884.261.752.640.43-4.421.73—一5.812.852.721.07一4.48315一一5.912.892.862.02—一5.277.66—一6.153.713.061.346.442.703.144.34測定值(ng/ml)6.454.793.370-996.601923.572.3611.105.643.592.0711.704.033.661.2212.865.873.701.1513.4721.463.821.1617.4D15.904.042.3524.086.354.161.1627.5810.324.532.2535.8725.644.672.2445.4414.685.253.0445.4948.185.682.5150.9053.135.762.1855.5924.175.861.68一-7.456.82Culoff值3陽性例16/2714/271/284/280/60/60/113/112/82/8*試劑盒種類A:7E7-16K16試劑盒B:7E7-4試劑盒其結(jié)果，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度，在間皮瘤患者中顯示1.0655.59ng/mL的范圍，平均值為15.21ng/mL;在胸膜胼胝患者中顯示0.74~7.45ng/mL的范圍，平均值為3.47ng/mL;在良性胸膜炎和彌散性胸膜胼胝患者中顯示1.184.00ng/mL的范圍，平均值為2.58ng/mL;在有石棉接觸經(jīng)歷的肺纖維癥中顯示1.975.27ng/mL的范圍，平均值為3.45ng/mL;在25其它鑒別疾病(包括肺癌)中顯示1.319.76ng/mL的范圍，平均值為4.04ng/mL。這樣可以判斷與其它疾病患者相比，在間皮瘤患者血清中，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度為高值。此外，在將7E7-16K16試劑盒的截留(CutOff)值設(shè)定為6.0ng/ml時(shí)、和將7E7-4試劑盒的截留(CutOff)值設(shè)定為3.0ng/ml時(shí)，陽性率如表中所示。而且，使用7E7-4試劑盒，間皮瘤患者的陽性率降低，而胸膜胼胝、接觸/肺纖維癥例的陽性率升高。對(duì)于其它筌別疾病，無論哪種試劑盒陽性率均相同。整體來看，可以判明7E7-16K16試劑盒能夠高靈敏度、高特異性地診斷間皮瘤患者。實(shí)施例8健康正常人血清和血漿的測定使用實(shí)施例6中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試劑盒)，如下地測定健康正常人52例的血清、和EDTA血漿中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度。血清樣品在采集后立即用PBS稀釋8倍，然后按實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行測定。才艮據(jù)稀釋樣品的吸光度求出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度，而且，由該濃度換算出原液濃度(8倍)。該測定結(jié)果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>其結(jié)果為在健康正常人中，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度在血清中顯示1.03~8.19ng/mL的范圍，平均值為3.36ng/mL;在血漿中顯示1.448.29ng/mL的范圍，平均值為3.60ng/mL。實(shí)施例9血清和血漿中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的穩(wěn)定性確認(rèn)使用實(shí)施例6中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試劑盒)，如下測定了健康正常人5例(ae)的血清或EDTA血漿中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的穩(wěn)定性。血液樣品在采血后分裝于真空釆血管中，室溫放置1小時(shí)，1500rpm離心分離10分鐘，分離出血清，立即于-20。C冷凍保存。將該試樣作為對(duì)照。除此以外，準(zhǔn)備下述試樣采血后室溫放置1小時(shí)，再于室溫放置16小時(shí)，然后離心分離出血清，并進(jìn)行冷凍(試驗(yàn)區(qū)A);以及，采血后室溫放置1小時(shí)，然后離心分離出血清，再于室溫放置16小時(shí)，然后冷凍(試驗(yàn)區(qū)B)。將這些試樣融解，然后用PBS稀釋8倍，按照上述實(shí)施例所述的方法進(jìn)行測定。根據(jù)稀釋樣品的吸光度求出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度，而且，由該濃度換算出原液濃度(8倍)。7E7-16K16試劑盒的測定結(jié)果如圖12所示。此外，作為比較，使用參考例2制作的測定系統(tǒng)(7E7-4試劑盒)進(jìn)行了相同的測定。其結(jié)果示于圖13。其結(jié)果，在使用7E7-16K16試劑盒時(shí)，無論是采血后室溫放置16小時(shí)的情況，還是采血分離后室溫放置16小時(shí)的情況，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度均未表現(xiàn)出大的變化，可以判明其是在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定的、適于進(jìn)行準(zhǔn)確測定的測定系統(tǒng)。而且，在5例健康正常人中，關(guān)于試樣b，未得到在試驗(yàn)區(qū)放置B16小時(shí)后的數(shù)據(jù)，因此將其排除在外。另一方面，在通過檢出方面使用識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區(qū)域的抗體的7E7-4試劑盒進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)中，在血清的情況下，當(dāng)從采血后至分離的期間在室溫放置3小時(shí)時(shí)，與對(duì)照相比，測定值降低5-30%。此外，當(dāng)從血清分離后至冷凍的期間在室溫放置時(shí)，3小時(shí)內(nèi)降低了5-30%。這些事實(shí)提示在血液狀態(tài)下、或者在分離出血清的狀態(tài)下，室溫放置3小時(shí)以上能夠使31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素片段化。實(shí)施例10間皮瘤患者胸腔積液中各種分泌型Erc/MPF/間皮素片段的存在的檢測在實(shí)施例9中顯示31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素能夠在血清中分解，從而片段化。即，在采血后和血清分離后的放置時(shí)間(3小時(shí)以上)里，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區(qū)域分解、缺損，因而，無法使用利用識(shí)別該區(qū)域的抗體的測定試劑盒來進(jìn)行測定。其結(jié)果，顯示出的測定結(jié)果是似乎不存在目的蛋白(31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素)。但是，分解之前在血液中應(yīng)該存在分子，而在這種檢查中給出了錯(cuò)誤結(jié)果。因此，使用具有適當(dāng)識(shí)別部位的抗體是非常重要的。因而，為了確認(rèn)該事實(shí)，使用采集后室溫放置的間皮瘤患者胸腔積液，通過實(shí)施例和參考例中制作的單克隆抗體7E7和多克隆抗體34、211、4按以下方法進(jìn)行了western印跡，其中，采集后室溫放置的間皮瘤患者胸腔積液#1認(rèn)為到達(dá)了與以血液狀態(tài)或者分離成血清的狀態(tài)室溫放置3小時(shí)以上后的狀態(tài)等同的狀態(tài)。首先，將單克隆抗體7E7和多克隆抗體34、4分別與Formyl-Cellulofme(生化學(xué)工業(yè)抹式會(huì)社)混合，并使用還原劑使它們結(jié)合，將其填充入柱中。接著，利用該柱與強(qiáng)酸性溶液、高鹽濃度溶液等隊(duì)間皮瘤患者胸腔積液進(jìn)行分級(jí)。具體地，使間皮瘤患者胸腔積液通過結(jié)合有多克隆抗體4的柱，分為吸附成分(C末端抗體柱吸附級(jí)分)和未吸附成分。其后，使未吸附于上述柱的成分通過結(jié)合有多克隆抗體34的柱，分為吸附成分和未吸附成分(N末端、C末端抗體柱非吸附級(jí)分)。進(jìn)一步，使吸附于上述柱的成分通過結(jié)合有單克隆抗體7E7的柱，分為吸附成分(7E7抗體柱吸附級(jí)分)和未吸附成分(7E7抗體柱非吸附級(jí)分)。以各級(jí)分作為樣品，通過單克隆抗體7E7和多克隆抗體34、211、4進(jìn)行了western印跡。其結(jié)果如圖14所示。其結(jié)果，可以判明采集后室溫放置的間皮瘤患者胸腔積液中存在多種3lkDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺損其C末端區(qū)域而得到的片段(N端側(cè)片段)。這還提示在血液狀態(tài)或者分離成血清的狀態(tài)室溫放置3小時(shí)以上后的狀態(tài)下，也存在多個(gè)N端側(cè)片段?？梢耘忻飨襁@樣，由于所用抗體的識(shí)別部位的差異，會(huì)存在無法檢出的片段，因此，為了高效率地^r出生物體內(nèi)本來存在的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，進(jìn)行這樣的檢索、選擇適當(dāng)?shù)目贵w是重要的，其結(jié)果能夠構(gòu)建以高靈敏度檢測目的蛋白的測定系統(tǒng)。在這樣的測定系統(tǒng)中，能夠以高靈敏度進(jìn)行檢測，因而能夠檢出更微量的存在，進(jìn)而能夠進(jìn)行早期檢測和i貪斷。實(shí)施例11施行外科手術(shù)后的監(jiān)測對(duì)于被診斷為惡性間皮瘤而實(shí)施了外科手術(shù)的患者，在術(shù)前術(shù)后進(jìn)行采血，分離出血清，使用實(shí)施例6中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-16K16試28劑盒)和、參考例2中制作的ELISA測定系統(tǒng)(7E7-4試劑盒)，測定了31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。其結(jié)果，在使用7E7-16K16試劑盒進(jìn)行的測定中，術(shù)前為35.87ng/ml，而術(shù)后降低至3.21ng/m。在使用7E7-4試劑盒進(jìn)行的測定中，由25.64ng/ml降低至術(shù)后的1.47ng/ml。這提示通過測定術(shù)前術(shù)后的血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素量，能夠?qū)κ中g(shù)除去間皮瘤細(xì)胞這一事件進(jìn)行確認(rèn)。此外，相反地，該結(jié)果提示血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素歸因于間皮瘤細(xì)胞的存在，因此，通過在術(shù)后也對(duì)31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進(jìn)行監(jiān)測，可以預(yù)測復(fù)發(fā)。實(shí)施例12各種患者血清的測定與實(shí)施例7相似地，對(duì)間皮瘤患者39例、健康正常者102名、石棉關(guān)聯(lián)疾病患者/有石棉接觸經(jīng)歷者201例(胸膜斑塊患者98例、有接觸經(jīng)歷者83例、石棉沉積癥患者6例、良性石棉胸膜炎患者14例)、肺癌患者45例、其它鑒別疾病患者8例的血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進(jìn)行了測定。結(jié)果如圖15所示。如圖所示，在使用本發(fā)明的抗體對(duì)Erc/MPF/間皮素進(jìn)行測定的結(jié)果方面，與間皮瘤以外的肺疾病患者、石棉接觸經(jīng)歷者或健康正常人相比較，間皮瘤患者中的測定值高。因此，這表明本發(fā)明的抗體可以用于有效的間皮瘤診斷。本申請(qǐng)要求2006年12月8日于日本國提出的特愿2006-331409的優(yōu)先權(quán)，本說明書中援引該申請(qǐng)中記載的內(nèi)容。此外，本說明書中援引本申請(qǐng)中引用的專利、專利申請(qǐng)和文獻(xiàn)所記載的內(nèi)容。29權(quán)利要求1.識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽的抗體。2.識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段的抗體。3.識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段的抗體。4.識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時(shí)以上而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段的抗體。5.—種抗體，該抗體的識(shí)別部位包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的第34229位。6.—種抗體，該抗體的識(shí)別部位包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的第34-139位。7.—種抗體，該抗體的識(shí)別部位包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的第68~139位。8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的抗體，該抗體還識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素。9.一種間皮瘤診斷劑，其具備權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的抗體。10.—種間皮瘤診斷試劑盒，其具備權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的抗體。11.一種間皮瘤診斷試劑盒，其由含有第l種抗體的第1試劑、和含有第2種抗體的第2試劑組合而成；所述第1種抗體識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽；所述第2種抗體識(shí)別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的氨基酸而得到的肽，且識(shí)別部位與所述第l種抗體的識(shí)別部位不同。12.—種間皮瘤診斷方法，其中，釆用根據(jù)權(quán)利要求IO或11所述的間皮瘤診斷試劑盒來測定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，并以該量作為指標(biāo)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的間皮瘤診斷方法，其中，所述試樣為血清、血漿、胸腔積液或腹水。全文摘要本發(fā)明的課題是提供間皮瘤診斷劑等，與目前為止報(bào)導(dǎo)的間皮瘤診斷試劑盒等相比，其能夠有效地識(shí)別健康正常人與間皮瘤患者，從有接觸石棉經(jīng)歷的人中鑒別出間皮瘤患者，識(shí)別肺癌等其它疾病的患者與間皮瘤患者，等等。本發(fā)明的間皮瘤診斷劑以下述抗體為有效成分，所述抗體識(shí)別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時(shí)以上而產(chǎn)生的片段的N端側(cè)片段。文檔編號(hào)C07K16/18GK101563454SQ20078004518公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日發(fā)明者樋野興夫,清藤勉申請(qǐng)人:株式會(huì)社免疫生物研究所