專利名稱：治療間皮瘤的藥物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及旨在治療癌癥(如惡性間皮瘤)的方法和藥物。
背景技術(shù)：
惡性間皮瘤(MM)是一種相對罕見并具有高侵染性的腫瘤，源于襯于漿膜腔的間 皮細(xì)胞的失控增生，所述間皮細(xì)胞最常襯于胸膜(惡性胸膜間皮瘤或MPM) (Robinson等 人，(2005)Lancet 366:397-408)。在工業(yè)化國家流行病學(xué)的研究已經(jīng)確定暴露于石棉是 引起MPM 的一個(gè)最重要的病因(Gruber (2005) Lung Cancer 49S1 :S21_S23 ；Bartrip (2004) Postgrad Med. J. 80 :72_76)。盡管在世界各地，石棉的使用已顯著減少，但在未來20年中， 間皮瘤的發(fā)病率仍預(yù)計(jì)上升，因?yàn)閺谋┞队谑薜奖憩F(xiàn)臨床癥狀之間有很長的潛伏期(20 年 40年)。今天，癌癥診斷通常在疾病的晚期階段得以確定，因?yàn)樵诩膊〉脑缙陔A段缺乏明 顯的癥狀，因此很難對間皮瘤患者進(jìn)行預(yù)斷。因此，事實(shí)上MPM被認(rèn)為是一種用所有傳統(tǒng)治 療方法都相對難以治療的癌癥。因此迫切需要研發(fā)新的治療方法。在過去的十年間，對病毒治療法的興趣日益增加，部分涉及在人類基因治療中重 組病毒載體生產(chǎn)上增加的認(rèn)識?，F(xiàn)在許多RNA復(fù)制病毒被認(rèn)為是潛在的癌癥治療物。同樣， 已有人建議用改造的可復(fù)制型單純皰疹病毒(HSV)治療MPM，基于對MPM小鼠模型體外研究 和所得結(jié)果(Adusumilli等人.(2006) J. Gene Med. 8 :603_615)。然而，這些改造的病毒載 體在人體內(nèi)的長期安全性仍未知，需要進(jìn)行大量的臨床實(shí)驗(yàn)來論證HSV這方面的應(yīng)用。因此，需要具有受認(rèn)可的安全性(可靠地用于間皮瘤治療)的病毒載體。MV(麻疹病毒)是一種有包膜的，負(fù)鏈單鏈RNA病毒，屬于副粘液病毒科、麻疹 病毒屬。已開發(fā)出用于生產(chǎn)抗麻疹疫苗的各種可復(fù)制的MV活減毒株。舉例來說，施瓦茨 (Schwartz)株、Moraten株或Zagreb株(這些源于從埃德蒙頓(Edmonston)患者分離的MV 樣品)是安全且充分驗(yàn)證的MV疫苗株。最近已表明，體內(nèi)施用可復(fù)制型埃德蒙頓MV株，可導(dǎo)致建立的淋巴瘤和骨髓瘤 動(dòng)物模型中腫瘤生長緩慢或有時(shí)消退(Grote等人.(2001)Blood 97 =3746-3754 ；Peng等 人· (2001) Blood 98 :2002_2007)。另外，Anderson 等人(2004) Cancer Res. 64 :4919_4926， 已在體外實(shí)驗(yàn)中顯示，腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)CD46是用減毒的埃德蒙頓MV活株感染和殺死 這些細(xì)胞所必需的。然而，已知人類癌癥已不同程度表達(dá)⑶46(Niehans等人.(1996) American J. Pathol. 149 129-142)，因而令人懷疑用減毒的MV活株治療癌癥的普遍適用 性。發(fā)明概述本發(fā)明源于本發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)，即減毒的麻疹病毒可有效感染和殺死間皮瘤細(xì) 胞。此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明，與來自減毒的麻疹病毒感染的間皮瘤細(xì)胞裂解物相接觸的樹 突細(xì)胞可激活抗間皮瘤CD8T細(xì)胞。因此，本發(fā)明涉及減毒的麻疹病毒，其用于治療個(gè)體的惡性間皮瘤。
本發(fā)明也涉及至少一種減毒的麻疹病毒用于生產(chǎn)旨在治療個(gè)體惡性間皮瘤的藥物的用途。本發(fā)明也涉及治療個(gè)體惡性間皮瘤的方法，其中給所述個(gè)體施用治療有效量的至 少一種減毒的麻疹病毒。本發(fā)明還涉及制備用于治療個(gè)體癌癥的疫苗性樹突細(xì)胞的方法，包括下列步驟_用減毒的麻疹株體外感染優(yōu)選取自所述個(gè)體的癌細(xì)胞，以產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；-使樹突細(xì)胞與所述細(xì)胞裂解物接觸，以產(chǎn)生疫苗性樹突細(xì)胞。本發(fā)明也涉及能根據(jù)上述制備方法得到的疫苗性樹突細(xì)胞，涉及含所述疫苗性樹 突細(xì)胞作為活性成分及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，涉及所述用于治療個(gè)體癌癥的疫苗 性樹突細(xì)胞，并涉及所述疫苗性樹突細(xì)胞用于生產(chǎn)旨在治療個(gè)體癌癥的藥物的用途。本發(fā)明還涉及治療個(gè)體癌癥的方法，其中將治療有效量的根據(jù)上述制備方法獲得 疫苗性樹突細(xì)胞施用于所述個(gè)體。發(fā)明詳述正如本文所預(yù)期的，所述個(gè)體優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。也優(yōu)選已經(jīng)暴露于石 棉的個(gè)體。正如本文所預(yù)期的，表述“減毒的麻疹病毒”是指任何源于麻疹致病病毒并且和所 述麻疹致病病毒相比呈現(xiàn)毒性減弱的病毒。正如本文所預(yù)期，所述減毒的麻疹病毒可用本 領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)由麻疹致病病毒得到，所述技術(shù)例如在培養(yǎng)的細(xì)胞上連續(xù)傳 代和/或基因工程。減毒的麻疹病毒具體可為重組病毒，任選表達(dá)其他基因。減毒的麻疹 病毒更具體可為其中一種或多種蛋白(優(yōu)選為輔助C蛋白)的表達(dá)被廢除的麻疹病毒。當(dāng) 施用給人時(shí)，減毒的麻疹病毒優(yōu)選不實(shí)質(zhì)引起麻疹癥狀。此外，減毒的麻疹病毒優(yōu)選為活的 且可復(fù)制。所述減毒的麻疹病毒優(yōu)選為埃德蒙頓(Edmonston)株。減毒的麻疹病毒的埃德 蒙頓株為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并特別報(bào)道于Griffin(2001)Field' s Virology 4th Edition vol. 2 Knipe 禾口 Howley(ed. )Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1401-1441 ；Hilleman(2002)Vaccine 20:651-665)。所述減毒的麻疹病毒更優(yōu)選選自施 瓦茨株和Moraten株。這些株(它們的基因組被證明相同)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并 且廣泛用于抗麻疹疫苗的生產(chǎn)。它們特別描述于在Schwarz (1962) Am. J. Dis. Child 103 216-219 ；Parks 等人· (2001) J. Virol. 75 :921_933 和 Parks 等人· (2001) J. Virol. 75 910-920。所述減毒的麻疹病毒最優(yōu)選用pTM-MVSchw質(zhì)粒(SEQ ID NO 1)生產(chǎn)，報(bào)道于 Combredet 等人· (2003) J. Virol. 77 11546-11554。在本發(fā)明框架內(nèi)待治療的癌癥優(yōu)選為惡性間皮瘤，更優(yōu)選為惡性胸膜間皮瘤或 腹膜間皮瘤，最優(yōu)選為惡性胸膜間皮瘤。這些癌癥特別報(bào)道于Kazan-Allen(2005)Limg cancer 49S1 :S3_S8 和 Robinson 等人.(2005) Lancet 366:397-408。將減毒的麻疹病毒施用給個(gè)體，可通過胸膜內(nèi)腔或鼻內(nèi)、肌肉、靜脈或皮下途徑施 用。將減毒的麻疹病毒通過胸膜內(nèi)腔施用給個(gè)體，優(yōu)選施用于比鄰待處理腫瘤處，或直接施 用于待處理腫瘤。如有必要，減毒的麻疹病毒可與任何合適的藥學(xué)可接受的載體組合。施 用的減毒的麻疹病毒的治療有效量優(yōu)選在IO3 IO6的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。 TCID50測定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并特別報(bào)道于Karber (1931)在Arch. Exp. Path.Pharmak. 162:840_483ο 從待用疫苗性樹突細(xì)胞治療的個(gè)體中提取癌癥細(xì)胞的步驟優(yōu)選不包括于上述制 備疫苗性樹突細(xì)胞的方法中。所述步驟可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的提取細(xì)胞的任何技術(shù) 來進(jìn)行，例如活組織檢查和滲漏/積液術(shù)(effusions)(例如，胸膜積液)。在被提取后，癌 細(xì)胞可根據(jù)經(jīng)典技術(shù)培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，或者例如冷凍(例如在-80°C)保存。當(dāng)癌細(xì)胞不是 來自待用疫苗性樹突細(xì)胞處理的個(gè)體，它們可主要來自同種異體的人類間皮瘤細(xì)胞系。在上述的制備方法中，癌細(xì)胞可通過和病毒直接接觸(例如以1的感染復(fù)數(shù) (Μ0Ι)，在37°C溫育2小時(shí))而被減毒的麻疹病毒感染。在感染后，由于病毒作用感染的細(xì) 胞自發(fā)死亡。在細(xì)胞裂解后通常首先形成合胞體。這一現(xiàn)象能通過直接顯微鏡觀測感染的 細(xì)胞證明。本文所預(yù)期的“細(xì)胞裂解物”包含整個(gè)(或總)細(xì)胞裂解物，或部分細(xì)胞裂解物， 例如膜部分(例如胞漿包涵體或凋亡小體)。將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所充分理解的是，在上述 制備方法第一步中獲得的細(xì)胞裂解物相當(dāng)于病毒感染的癌細(xì)胞裂解物。樹突細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法得到。樹突細(xì)胞優(yōu)選來自待治療 個(gè)體。目前優(yōu)選的樹突細(xì)胞是單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞。單核細(xì)胞衍生細(xì)胞的獲取為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所特別熟知。單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞優(yōu)選用實(shí)施例4中報(bào)道的一般方法獲得，或 根據(jù) Spisek 等人.(2001) Cancer Immunology Immunotherapy 50 :417_427 獲得，或根據(jù) Royer等人.(2006) Scand. J. Immunol. 63 401-409獲得。單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞源于待 治療個(gè)體，這些單核細(xì)胞可從所述個(gè)體的白細(xì)胞采集物中獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)明晰的是，應(yīng)維持樹突細(xì)胞和細(xì)胞裂解物接觸足夠長的時(shí) 間，以確保所述樹突細(xì)胞被細(xì)胞裂解物中存在的抗原有效裝載。一旦裝載(或負(fù)載的 (pulsed))，便獲得了本發(fā)明的疫苗性樹突細(xì)胞。裝載可用下文中實(shí)施例4描述的一般方法 來進(jìn)行。足以確保樹突細(xì)胞有效裝載的樹突細(xì)胞和細(xì)胞裂解物之間的例示接觸時(shí)間大約是 24小時(shí)。接觸時(shí)間具體要保持到所述樹突細(xì)胞變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。激活狀態(tài)通常在樹突細(xì)胞裝 載完成后出現(xiàn)。樹突細(xì)胞的激活狀態(tài)(或成熟狀態(tài))可被本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的許多標(biāo) 記物證實(shí)，例如膜或細(xì)胞因子標(biāo)記物。這些激活的樹突細(xì)胞的標(biāo)記物特別列于實(shí)施例5中。因此，根據(jù)本發(fā)明的制備方法獲得的疫苗性樹突細(xì)胞有著特別的優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈?是抗癌CD8T細(xì)胞的有效刺激物。同樣有優(yōu)勢的是，本發(fā)明的制備方法可允許制備處于激活 狀態(tài)的疫苗性樹突細(xì)胞。附圖簡述

圖1、2、3、4和5 間皮瘤對減毒的麻瘡病毒(MV)的易感性圖1 =Schwarz MV疫苗株的選擇性溶瘤活性。用非重組的MV(Μ0Ι 1.0)感染一組 人上皮樣間皮瘤細(xì)胞系(M11、M13、M47、M56*M61)和永生的正常間皮細(xì)胞系(Met5A)，并 在72小時(shí)后進(jìn)行感染的培養(yǎng)物形態(tài)的顯微鏡觀測。圖2 3 和正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的⑶46受體的更高表面表達(dá)。細(xì)胞用綴合 FITC的CD46特異性抗體(灰色柱狀圖)或相關(guān)的同種異型Ig對照(白色柱狀圖)染色 (圖2)。數(shù)量表示平均熒光指數(shù)，柱狀圖表示得到的間皮細(xì)胞(白色柱)和間皮瘤細(xì)胞系 (陰影線柱)的CD46表達(dá)的平均值(圖3)。圖4 5 =Schwarz MV疫苗株優(yōu)先感染轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。分別培養(yǎng)(圖4)或共 培養(yǎng)(圖5)相同數(shù)量的M13和Met5A細(xì)胞過夜，使細(xì)胞粘附，并以1. 0的MOI用eGFP-重組MV進(jìn)行感染。在分別培養(yǎng)中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行在感染后不同時(shí)間(24、48和72小時(shí)) 的eGFP表達(dá)分析(圖4)。在共培養(yǎng)模式中，用HLA-A2染色進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)镠LA等位 基因的差異表達(dá)使可辨別兩種細(xì)胞系。柱狀圖表示共培養(yǎng)中Met5A(白色柱)和M13(黑色 柱)的％ eGFP-陽性細(xì)胞(圖5)。圖6 =MV-感染的間皮瘤細(xì)胞系的免疫原件 圖6 :MV-和UV-處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在指示的時(shí)刻(Dl = 24h，D2 = 48h，D3 = 72h，及D4 = 96h)由UV暴露(5kJ/cm2)或MV感染(Μ0Ι = 1. 0)引起的M13腫瘤細(xì)胞凋亡 (陰影線柱)對比未處理的對照細(xì)胞(白色條快)的流式細(xì)胞儀分析。圖7和8 單核細(xì)胞衍牛的DC對抗體的吞噬作用圖7 =UV-或MV-處理的M13腫瘤細(xì)胞用PKH-26標(biāo)記，并和未成熟的DC共培養(yǎng)24 小時(shí)。隨后對獲取的樹突細(xì)胞用綴合FITC的抗HLA-DR抗體染色，并用流式細(xì)胞儀分析。顯 示了三個(gè)具有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中具有代表性的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。雙陽性DC數(shù)是基于HLA-DR表達(dá) 選通的PKH-26陽性DC的百分率(綴合FITC的抗體，克隆B8. 12. 2，Immunotech)，表示凋 亡細(xì)胞的吞噬效率。圖8 柱狀圖表示來自所測試各裝載條件得到的吞噬作用產(chǎn)量的平均值。B 9、10和11 誦i寸與MV-感染的間皮瘤細(xì)胞,共培IfH秀導(dǎo)的DC成孰圖9和10 以指定組合培養(yǎng)未成熟的DC和M13腫瘤細(xì)胞(1/1的比例)24小時(shí)。 作為對照，將DC和TLR3配體、聚肌苷酸聚胞苷酸(50μ g/ml ；Sigma)共溫育，或?qū)C直接 用MV感染(Μ0Ι = 1.0)。隨后提取DC，并用特異于指定的細(xì)胞表面分子的綴合PE的抗體 平板染色(圖9-HLA分子；圖10-成熟標(biāo)記物)。根據(jù)DC的形態(tài)特征對它們選通，其中死 細(xì)胞基于T0PR0-3染色(分子探針)被去除。用三色流式細(xì)胞儀分析DC表面顯型。柱狀 圖表示來自4種獨(dú)立供體的平均值。圖 11 通過 CBA (針對 IL-6、IL-I β ,TNFa、IL—12 和 IL—10)禾口 ELISA (針對 IFN a ) 測定來研究24小時(shí)共培養(yǎng)上清上的DC細(xì)胞因子分泌模式。圖12 裝載MV-感染的間皮瘤細(xì)胞的DC誘導(dǎo)MSLN特異性⑶8T細(xì)胞致敏圖12 :MSLN特異性⑶8 T細(xì)胞數(shù)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，所述⑶8 T細(xì)胞源于和 未負(fù)載或者負(fù)載UV-M13或MV-M13的DC致敏一周的共培養(yǎng)物。柱狀圖表示基于人CD8表達(dá) 選通的T細(xì)胞中的PE-四聚物陽性細(xì)胞(綴合PE_Cy5的抗體，克隆RPA-T8，BDBiosciences) 的百分率。顯示的是一個(gè)有代表性的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例實(shí)施例1 間皮瘤對MV感染和溶瘤活性的易感性為了比較MV-涉及的對腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)，一組五種上皮樣間皮 瘤細(xì)胞系(Mil、M13、M47、M56、和M61)和一種間皮細(xì)胞(Met5A)用Schwarz疫苗株以1. 0 的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染。間皮瘤細(xì)胞系(Mil、M13、M47、M56、和M61)來自對癌癥患者進(jìn)行胸腔穿刺術(shù)收 集的胸膜積液。上皮樣間皮瘤的診斷用活組織切片免疫組化染色來確定。對照間皮細(xì)胞 系(Met5A)分離自無癌癥的病人的胸膜液，并通過轉(zhuǎn)染編碼SV40 T-抗原的pRSV質(zhì)粒 (ATCC-LGC Promochem, Molsheim, France)使其永生。將細(xì)胞系維持在添加10%的熱滅活的小牛胎兒血清(FCS來自Biowest, Nuaille, France)、1 %的L-谷氨酰胺和青霉素/ 鏈霉素抗生素(都購自Sigma，St Quentin Fallavier, France)的RPMI-IMO培養(yǎng)基中。 用Hoechst33258染色(Sigma)常規(guī)檢測細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染。減毒的 MVSchwarz 疫苗株獲自 F. Tangy (Pasteur Institut，F(xiàn)rance)。Schwarz MV從pTM-MVSchw (SEQ ID NO 1) cDNA,通過使用基于輔助細(xì)胞的營救系統(tǒng)(報(bào)道 于 Radecke 等人(1995)EMBO J. 14 :5773_5784，并被 Parks 等人(1999)J. Virol. 73 3560-3566 改進(jìn))營救。簡而言之，用 5 μ g pTM-MVSchw 和 0. 02 μ g 表達(dá) SchwarzMV-L 基 因的 pEMC-Lschw(Combredet 等人.(2003) J. Virol. 77 11546-11554) (SEQ ID NO 2)轉(zhuǎn)然 293-3-46輔助細(xì)胞。37°C過夜溫育后，于43°C熱激2小時(shí)，并將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Vero細(xì) 胞單層上。將共培養(yǎng)15天后出現(xiàn)的合胞體轉(zhuǎn)移到35mm孔中，然后在75cm2和150cm2 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)展，所述Vero細(xì)胞在5% FCS DMEM中培養(yǎng)。當(dāng)合胞體達(dá)到80 90%匯合 時(shí)，將細(xì)胞刮到小體積的OptiMEM中，并立即凍結(jié)。在低速離心成片狀細(xì)胞殘骸后，-80°C保 存含有病毒的上清液。通過對Vero細(xì)胞的端點(diǎn)有限稀釋測定來測定重組MV儲存液的滴度。 用KSrber方法計(jì)算出 TCID50 (Karber (1931) Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 480-483)。以MOI = 1. 0、37°C溫育2小時(shí)來進(jìn)行間皮瘤細(xì)胞系的病毒感染。MV感染三天后， 觀測到MV感染的細(xì)胞有典型的形態(tài)學(xué)變化，和非癌Met5A細(xì)胞相比，這是對大部分腫瘤MPM 細(xì)胞系(4/5)的重要的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)生(圖1)。通過發(fā)生或多或少重要的合 胞體證實(shí)了 CPE，這最終導(dǎo)致死腫瘤細(xì)胞的胞漿包含體流入培養(yǎng)上清液中(圖1)。這些多 核巨合胞體的發(fā)生是麻疹感染的特征，產(chǎn)生于HA+感染的細(xì)胞和鄰近的CD46+培養(yǎng)細(xì)胞的融合 O可證實(shí)間皮瘤細(xì)胞上MV的減毒活株的受體⑶46有顯著的上調(diào)表達(dá)(圖2 3)。為了量化MV感染的敏感性，Met5A和M13細(xì)胞系被eGFP-重組的MV儲存液感染 (Combredet 等人.(2003) J. Virol. 77 :11546_11554)。將該 GFP-轉(zhuǎn)基因的表達(dá)作為病毒 感染的標(biāo)記，因此允許用流式細(xì)胞儀檢測感染細(xì)胞的百分率。兩種培養(yǎng)細(xì)胞中的MV感染量 都是劑量依賴的(Μ0Ι為0. 01 5. 0)，表示eGFP信號的特異性。然而Met5A被MV株感染 (Μ0Ι為0.5 )，M13也明顯被MV感染，但總是以最低的MOI (Μ0Ι為0. 1 )。也觀測到和 正常細(xì)胞相比(Μ0Ι 1.0)，感染后48小時(shí)，在兩種細(xì)胞分別培養(yǎng)(圖4)和共培養(yǎng)(圖5)系 統(tǒng)(1 3的比例)中，腫瘤細(xì)胞顯著增加的感染量。此外，病毒感染也可通過觀測到感染 的細(xì)胞培養(yǎng)物中CD46表面表達(dá)的下調(diào)來證實(shí)。因此，根據(jù)這些體外研究結(jié)果，和間皮組織相比，間皮瘤表現(xiàn)出對MV-介導(dǎo)的感染 和MV-相關(guān)的細(xì)胞裂解活性有更明顯的易感性。因此，MPM看起來是和基于麻疹病毒施用 的病毒治療法有關(guān)的候選物。實(shí)施例2 =MV和UV治療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡在證明MV能夠感染間皮瘤細(xì)胞之后，本發(fā)明人證明是否病毒感染也可導(dǎo)致凋亡 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。亞匯合單層M13細(xì)胞培養(yǎng)物或者經(jīng)MV-感染(Μ0Ι 1.0)，或者用UV Stratalinker2400(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)進(jìn) 行 UV-B-照 身寸 (312nm 5kJ/m2)，作為凋亡的陽性對照。在處理后的不同時(shí)間收集細(xì)胞，根據(jù)伴隨 物磷脂酰絲氨酸和膜聯(lián)蛋白-V染色定量細(xì)胞的死亡，這報(bào)道于Ebstein等人.(2004)Am. J. Respir. Crit. Care Med. 169 :1322-1330。如圖6所示，暴露于UV-B照射24小時(shí)的M13細(xì)胞和經(jīng)MV感染72小時(shí)的M13細(xì) 胞表現(xiàn)出相等的腫瘤細(xì)胞死亡率(含有70% 80%之間的膜聯(lián)蛋白-V陽性細(xì)胞)，這表示 MV誘導(dǎo)感染的腫瘤細(xì)胞凋亡。由此定義的M13細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的條件被用于下列實(shí)驗(yàn)中。此外，通過觀測到明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)也證實(shí)了病毒涉及的細(xì)胞殺死，導(dǎo)致感染 后72 96小時(shí)M13細(xì)胞層完全錯(cuò)位(圖1)。_仿丨丨3 :MV趣_中_胞輔_雜瞧為了跟蹤病毒在感染的M13細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長動(dòng)力學(xué)(Μ0Ι = 1. 0)，進(jìn)行特異于 病毒dsRNA潛在受體(Mda-5、TLR-3、RIG-I和PKR)的RT-PCR。β -肌動(dòng)蛋白基因的特異引 物作為內(nèi)部實(shí)驗(yàn)對照。簡而言之，Μ13細(xì)胞或者與聚肌苷酸聚胞苷酸配體(10yg/ml)溫育，或者 與MV(M0I = 1.0)溫育，并在不同時(shí)間收集細(xì)胞沉淀。然后用RNeasy試劑盒(Qiagen， Courtaboeuf，F(xiàn)rance)根據(jù)產(chǎn)品說明提取細(xì)胞的總細(xì)胞RNA，并用RTase (Invitrogen， Paisley, UK)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的cDNA作為PCR擴(kuò)增的模版，該P(yáng)CR使用特異于Mda_5、 TLR-3、RIG-I、PKR、IFN3，和β-激動(dòng)蛋白的引物。PCR引物序列列在表1中。PCR產(chǎn)物通
過瓊脂糖凝膠電泳觀察。 表1:引物序列因此這可證明病毒復(fù)制峰出現(xiàn)在感染間皮瘤Μ13細(xì)胞后的第一天到第四天之間。 另外，也可證實(shí)相應(yīng)于病毒dsRNA潛在受體(Mda-5、TLR-3、RIG-I和PKR)的PCR產(chǎn)物。
t施徹丨4 未成孰DC對凋亡件間皮瘤細(xì)胞效攝入然后研究樹突細(xì)胞(DC)對MV-感染(72小時(shí))所致的凋亡小體的攝入，并與其對 UV-照射(24小時(shí))的M13腫瘤細(xì)胞的攝入進(jìn)行比較。
樹突細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，在獲得知情同意后，從HLA-A0201健康供體(EFS， Nantes, France)的白細(xì)胞采集收獲物產(chǎn)生所述單核細(xì)胞。富含單核細(xì)胞的級分(>85% ^iS ) Ficoll WiS^iSi^^^ (PAA Laboratories, Les Mureaux, France)
離。然后單核細(xì)胞通過用Beckman Avanti J20離心機(jī)(配備有JE5. O轉(zhuǎn)子)和40ml淘洗 室進(jìn)行淘洗(逆流離心)來富集。如基于CD14標(biāo)記物檢測的流式細(xì)胞儀檢測所評估，經(jīng)淘 洗的單核細(xì)胞的純度通常超過80%。用500IU/ml GM-CSF和200IU/ml IL-4 (Cell Genix Technology, Freiburg, Germany)以2 X IO8細(xì)胞/ml培養(yǎng)單核細(xì)胞。然后使細(xì)胞分化6天。在第6天，從培養(yǎng)物上清液中收集單核細(xì)胞衍生的DC，并接種于用于隨后裝載的 培養(yǎng)物中。使未成熟的DC和2X IO8細(xì)胞/ml的凋亡物(來自UV-處理的或MV-感染的同 種異體M13腫瘤細(xì)胞)溫育共培養(yǎng)(比列1 1)另外的24小時(shí)。DC吞噬量的分析通過用 流式細(xì)胞儀檢測和激光共聚焦顯微鏡檢測來評估，如先前報(bào)道(Mass6等人.(2002) Cancer Research 32 1050-1056)。簡而言之，使用PKH-26膜染料著色劑，根據(jù)產(chǎn)品說明(Sigma，St Quentin FalIavier，F(xiàn)rance)標(biāo)記經(jīng)UV-或MV-處理的M13細(xì)胞。共溫育24小時(shí)后，用綴 合 FITC 的抗 HLA-DR 抗體(Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)染色 DC。用 PBS 洗滌后，收獲 細(xì)胞，并用 FACSCalibur (BD Biosciences, Grenoble, France)或者用 TCS NT 顯微鏡(Leica Instruments, Heidelberg, Germany)分析。已攝入凋亡細(xì)胞的 DC 被鑒定為 HLA-DR/PKH-26 雙陽性細(xì)胞(圖7)。如圖8所示，能夠證明DC以相同的速率有效吞入經(jīng)UV-和MV-處理的間皮瘤細(xì) 胞，如基于HLA-DR表達(dá)選通的PKH26-陽性DC的相似百分率所示(對于分別裝載經(jīng)UV-或 MV-處理的M13細(xì)胞的DC分別為65%和74% )。激光共聚焦掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)凋亡的M13細(xì)胞在共培養(yǎng)24小時(shí)內(nèi)被未 成熟的DC有效攝入，無關(guān)于所使用的死亡誘導(dǎo)策略(MV-感染或UV-照射)。實(shí)施例5 相比用UV照射誘導(dǎo)的凋亡性M13細(xì)胞，MV感染的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)DC自發(fā) 成熟接下來本發(fā)明人檢驗(yàn)了是否來自MV感染的M13腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞物質(zhì)可有效刺激 DC成熟。在被暴露于照射或病毒介導(dǎo)的細(xì)胞裂解活性殺死的腫瘤細(xì)胞攝入后的24小時(shí)內(nèi) 評估DC成熟狀態(tài)?；頓C(基于T0PR0-3陽性染色排除選通)的表型用Class I和II MHC分子(圖 9)和成熟標(biāo)記物⑶80、⑶86、⑶83和⑶40(圖10)的表面表達(dá)來研究，通過對共培養(yǎng)上清 液進(jìn)行細(xì)胞因子分泌模式分析來完成(圖11)。作為對照，DC未經(jīng)處理，或者組合TLR3配 體和一種促炎癥細(xì)胞因子(聚肌苷酸聚胞苷酸/IFNα，作為病毒感染的模擬物)而成熟， 或者直接通過接觸麻疹病毒(MV)來致敏。簡而言之，用特異于HLA-ABC (克隆 Β9. 12. 1)、HLA-DR(克隆 Β8. 12. 2)、CD80 (克 隆 ΜΑΒ104)、CD83 (克隆 HB15a)、CD86 (克隆 ΗΑ5· 2B7)、和 CD40 (克隆 MAB89)的單克隆抗體 (均購自Immunotech，Marseilles，F(xiàn)rance)進(jìn)行免疫染色。在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測前，DC與上述各抗體α μ g/ml)在4°C溫育30分鐘。測定吞入后24小時(shí)收集的上清液中的細(xì)胞 因子的分泌模式。用可商購的Cytometric Beads Array試劑盒(BD Biosciences, Le Pont de Claix,France)根據(jù)產(chǎn)品說明測定了 IL-10、IL-12、IL-6、IL-1 β 和 TNF α 濃度。IFNa 的定量用 ELISA 檢測(Biosource，Camarillo, USA)進(jìn)行。自發(fā)成熟程序只在裝載有來自MV感染的間皮瘤細(xì)胞的凋亡小體的DC中觀測到， 以與實(shí)驗(yàn)中所用的陽性對照的成熟混合物(聚I:C/IFNa)基本相等的水平。通過共刺激 分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40和HLA-ABC)表達(dá)的顯著上調(diào)和許多促炎細(xì)胞因子(IL-6、 IL-I β、TNF α、和IFNa)的生成證實(shí)了自發(fā)成熟。 然而，與先前的報(bào)道一致，用經(jīng)UV-照射的凋亡性腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC，和用麻疹病毒 (MV)直接感染DC不能誘發(fā)此效果。所有這些數(shù)據(jù)都強(qiáng)烈證實(shí)，與UV-照射的腫瘤細(xì)胞相比，MV感染的腫瘤細(xì)胞的免 疫原性升高。實(shí)施例6 :MSLN特異件⑶8 T細(xì)胞應(yīng)答的交叉致敏最后，本發(fā)明人檢測是否裝載有來自MV感染的間皮瘤細(xì)胞的凋亡小體的DC可刺 激特異于MPM-相關(guān)的腫瘤抗原(例如間皮素(MSLN))的效應(yīng)子CD8應(yīng)答。為了評估這個(gè)問題，對⑶8 T-淋巴細(xì)胞進(jìn)行四聚物免疫染色，所述⑶8T-淋巴 細(xì)胞與裝載來自經(jīng)UV-或MV-處理的M13細(xì)胞的凋亡物質(zhì)的自身DC致敏一周。作為對 照，類似的實(shí)驗(yàn)用Jurkat淋巴瘤T細(xì)胞系進(jìn)行，基于其對MV的易感性和其MSLN-陰性表 達(dá)特征來選擇(圖12)。作為內(nèi)部實(shí)驗(yàn)對照，完成了 MelanA/Mart-Ι-特異性四聚物染色 (MelanA26-35L)，以補(bǔ)充特異于兩個(gè)選定的MSLN-衍生的CTL表位的那些。這些肽(MSLN 531 539和MSLN 541 550)通過使用兩種計(jì)算算法BIMAS和SYFPEITHI掃描匹配對于 HLA-A0201結(jié)合共有的基序的MSLN氨基酸序列(GenP印t NP005814)來鑒定(表2)
HLA-A0201結(jié)合分值
四聚物名稱 位置序列SYFPEITHI BIMAS
531 ~VLPLTVAEV
HLA-A2 VLP929/30 272/285
539 ( SEQ ID NO: 13 )
541 ~ KLLGPHVEGL HLA-A2 KLL1030/31 312/312
550 (SEQ ID NO: 14)表2:四聚物特征簡而言之，通過使用CD8多重分選試劑盒(Miltenyi Biotec, Paris, France)用 MACS柱系統(tǒng)陽性篩選來從HLA-A0201健康供體的PBMC制備⑶8 T淋巴細(xì)胞。純化的幼稚 ⑶8 T細(xì)胞(> 90%純度)用裝載有各凋亡制劑的自身DC或未裝載的DC(作為對照)刺 激。在圓底的96孔平板(BD Falcon)中，通過將2X IO4成熟的DC與2X IO5應(yīng)答T細(xì)胞 在 200μ1 8%人血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基(頭三天補(bǔ)加 10ng/ml IL_12(AbCys SA, Paris,France)，以后補(bǔ)加 10U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Therapeutics, USA))中混和(比列 1 10)來進(jìn)行共培養(yǎng)。每三天加一次IL-2，允許常規(guī)的培養(yǎng)基更新。在培養(yǎng)7 8天后， 收獲T細(xì)胞，并如下用MSLN-特異性四聚物染色。 將所選定的CD8表位肽(由Eurogentec，Liege, Belgium合成)用于如先前報(bào)道 于(LabarriSre等人.(2002) Int. J. CancerlOl 280-286)的單體生產(chǎn)(重組蛋白生產(chǎn)平 臺，U601-IFR26，Nantes, France)。HLA-A2 VLP9 和 HLA-A2 KLLlO 單體用 PE-標(biāo)記的鏈霉 親和素(BD Biosciences)寡聚化。染色和洗滌在0. 1 % BSA-PBS中進(jìn)行。隨后將T細(xì)胞在 4°C下用10 μ g/ml的PE-標(biāo)記的pMHC多聚體染色30分鐘，然后再于4°C下用1 μ g/ml稀釋 的綴合PE_Cy5的抗-CD8抗體(克隆RPA-T8，BD Biosciences)染色30分鐘。洗滌細(xì)胞， 并立即在FACSCalibur上分析。有趣的是，觀測發(fā)現(xiàn)，與和裝載有來自UV-處理的M13細(xì)胞的凋亡物質(zhì)的DC的共 培養(yǎng)物相比，與裝載有來自MV-處理的M13細(xì)胞的凋亡物質(zhì)的DC的共培養(yǎng)物中，CD8-陽性 選通群中MSLN特異性T細(xì)胞的百分率顯著增加。
權(quán)利要求
減毒的麻疹病毒，其用于治療個(gè)體的惡性間皮瘤。
2.權(quán)利要求1的減毒的麻疹病毒，其中所述減毒的麻疹病毒是埃德蒙頓(Edmonston)株。
3.權(quán)利要求1或2的減毒的麻疹病毒，其中所述減毒的麻疹病毒選自施瓦茨 (Schwartz)株禾口 Moraten 株。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的減毒的麻疹病毒，其中所述惡性間皮瘤是惡性胸膜間皮瘤。
5.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)的減毒的麻疹病毒，其中所述個(gè)體已暴露于石棉。
6.制備用于治療個(gè)體癌癥的疫苗性樹突細(xì)胞的方法，包括下列步驟 用減毒的麻疹株體外感染取自所述個(gè)體的癌細(xì)胞，以產(chǎn)生細(xì)胞裂解物； 使樹突細(xì)胞與所述細(xì)胞裂解物接觸，以產(chǎn)生疫苗性樹突細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述樹突細(xì)胞源于所述個(gè)體。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述樹突細(xì)胞是單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6 8中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌是惡性間皮瘤。
10.權(quán)利要求6 9中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌是惡性胸膜間皮瘤。
11.權(quán)利要求6 10中任一項(xiàng)的方法，其中所述減毒的麻疹病毒是埃德蒙頓株。
12.權(quán)利要求6 11中任一項(xiàng)的方法，其中所述減毒的麻疹病毒選自施瓦茨株和 Moraten ^0
13.疫苗性樹突細(xì)胞，其能根據(jù)權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)的方法得到。
14.藥物組合物，其包含 能根據(jù)權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)的方法得到的疫苗性樹突細(xì)胞作為活性成分；及 藥學(xué)可接受的載體。
15.疫苗性樹突細(xì)胞，其能根據(jù)權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)的方法得到，其用于治療個(gè)體的癌。
16.權(quán)利要求15的疫苗性樹突細(xì)胞，其中所述癌是惡性間皮瘤。
17.權(quán)利要求15或16的疫苗性樹突細(xì)胞，其中所述癌是惡性胸膜間皮瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用至少一種減毒的麻疹病毒來制備旨在治療個(gè)體的惡性間皮瘤的藥物。
文檔編號A61K39/165GK101868249SQ200880116771
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日
發(fā)明者A·高弗里特, F·唐吉, M·格利高里 申請人:巴斯德研究所