本發(fā)明涉及生物傳感分析及食品和飼料安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

許多食品和飼料在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、加工和流通過程中易遭受真菌污染，產(chǎn)生有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物真菌毒素。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織估算，全球每年約有1/4的糧食因受真菌毒素污染而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，較為常見的真菌毒素種類有赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、t-2毒素、黃曲霉毒素和伏馬毒素等，其中部分種類已被證實(shí)具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用。中國(guó)(gb2761-2017)及世界各地已普遍制定了真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，明確了真菌毒素防控在食品和飼料安全監(jiān)管中的重要性。

目前真菌毒素的檢測(cè)方法主要包括生物鑒定法、化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫分析法，但上述傳統(tǒng)檢測(cè)方法普遍存在高效識(shí)別機(jī)制匱乏、批次差異大、檢測(cè)成本高及大型儀器依賴性大等缺點(diǎn)。目前主導(dǎo)仲裁判定依據(jù)的儀器分析法雖準(zhǔn)確度高、定量限低，但操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備要求高，并不適于真菌毒素的快速分析。已成功商業(yè)化推廣的免疫分析法雖實(shí)現(xiàn)了便捷的檢測(cè)需求，但在實(shí)際研究及應(yīng)用中仍面臨著抗體和抗原批次差異大，交叉反應(yīng)普遍，存在一定假陽性等問題。近年，核酸適體代替抗體作為新型識(shí)別分子的生物傳感技術(shù)為真菌毒素的高精準(zhǔn)、便攜式檢測(cè)提供了新思路。但適體生物傳感器檢測(cè)多結(jié)合生物納米材料，前期需要合成步驟或信號(hào)分子的標(biāo)記及修飾，不僅操作復(fù)雜、增加成本，易對(duì)實(shí)際樣本造成二次污染，而且體系中的納米材料還可能發(fā)生復(fù)雜對(duì)象的非特異性吸附，造成靶向信號(hào)淬滅或非靶向信號(hào)放大。

因此，需要提供一種快速、便攜、廉價(jià)、免標(biāo)記檢測(cè)不同類型真菌毒素的方法，且該方法能有效提高檢測(cè)的精準(zhǔn)性、靈敏度、選擇性及通用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的快速、簡(jiǎn)便、免標(biāo)記、高精準(zhǔn)、高靈敏分析方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的試劑盒。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的方法，包括如下步驟：

1)真菌毒素與核酸適體的結(jié)合作用：使真菌毒素核酸適體及其互補(bǔ)序列反應(yīng)，形成雜交雙鏈后，加入待測(cè)樣品，使其與核酸適體結(jié)合，雙鏈解旋，釋放互補(bǔ)序列，得到混合液a；

2)酶切輔助信號(hào)放大：混合液a與限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，雜交雙鏈被剪切，暴露出3'-oh，而真菌毒素與適體的結(jié)合產(chǎn)物及互補(bǔ)序列單鏈dna不發(fā)生酶切，得到混合液b；

3)鳥嘌呤四聚體結(jié)構(gòu)的制備：混合液b與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)和脫氧核苷三磷酸(dntps)反應(yīng)，被剪切的雜交雙鏈3'-oh端可隨機(jī)聚合富含鳥嘌呤的長(zhǎng)鏈dna，形成多個(gè)連續(xù)的鳥嘌呤四聚體結(jié)構(gòu)(g4結(jié)構(gòu))，之后與配體分子作用，構(gòu)成具有過氧化物酶活性的脫氧核酶(dnazyme)，得到混合液c；

4)檢測(cè)體系：混合液c與不同底物作用發(fā)生催化氧化反應(yīng)，產(chǎn)生紫外、熒光和化學(xué)發(fā)光信號(hào)，根據(jù)各信號(hào)的響應(yīng)強(qiáng)度與真菌毒素濃度的關(guān)系計(jì)算待測(cè)樣品中真菌毒素的含量。

本發(fā)明所述真菌毒素包括但不限于赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)、t-2毒素、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、伏馬毒素b1和伏馬毒素b2。

本發(fā)明所述真菌毒素核酸適體為可與真菌毒素發(fā)生結(jié)合作用的dna，不同真菌毒素種類對(duì)應(yīng)不同dna序列。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，不同真菌毒素適體序列可以為但不限于：所述赭曲霉毒素a核酸適體如序列表seqidno.1所示；所述玉米赤霉烯酮核酸適體如序列表seqidno.2所示；所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體如序列表seqidno.3所示；所述t-2毒素核酸適體如序列表seqidno.4所示；所述黃曲霉毒素m1核酸適體如序列表seqidno.5所示；所述黃曲霉毒素b1核酸適體如序列表seqidno.6所示；所述黃曲霉毒素b2核酸適體如序列表seqidno.7所示；所述伏馬毒素b1核酸適體如序列表seqidno.8所示；所述伏馬毒素b2核酸適體如序列表seqidno.9所示。

所述核酸適體互補(bǔ)序列為與上述真菌毒素核酸適體dna堿基互補(bǔ)的單鏈dna，互補(bǔ)比例大于適體長(zhǎng)度的1/3。

所述的真菌毒素核酸適體與其互補(bǔ)序列的3'端均用磷酸化進(jìn)行封閉處理。

進(jìn)一步，所述互補(bǔ)序列濃度大于真菌毒素適體濃度。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟1)中所述反應(yīng)是在tris-hcl緩沖液(20mmtris-hcl,ph7.5)中反應(yīng)1-10min。

進(jìn)一步，所述限制性內(nèi)切酶為可切刻相應(yīng)雜交雙鏈的酶類，包括但不限于hpy188i、msei或baegi。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟2)中所述反應(yīng)是混合液a與2-10個(gè)單位的限制性內(nèi)切酶于反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)中孵育40-120min后，加熱至65-80℃，保持20min終止反應(yīng)。

進(jìn)一步，dntps中各組分的摩爾濃度比為dgtp50％-100％，datp0％-50％，dttp0％-50％。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟3)中所述反應(yīng)是混合液b與2-10個(gè)單位tdt和1mmdntps于反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)中37℃下孵育40-120min，之后于70℃水浴10min終止反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述配體分子為血紅素。

進(jìn)一步，本發(fā)明產(chǎn)生信號(hào)的不同，所述底物有所不同：

當(dāng)產(chǎn)生紫外信號(hào)時(shí)，所述底物為過氧化酶比色底物，所述過氧化酶比色底物包括但不限于2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(abts^2-)、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)、鄰苯二胺(opd)或氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)；

當(dāng)產(chǎn)生熒光信號(hào)時(shí)，所述底物為熒光有機(jī)染料或過氧化酶熒光底物，所述熒光有機(jī)染料可與g4結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，包括但不限于硫磺素t、結(jié)晶紫或噻唑橙，所述過氧化酶熒光底物包括但不限于amplexred；

當(dāng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)時(shí)，所述底物為過氧化酶化學(xué)發(fā)光底物，所述過氧化酶化學(xué)發(fā)光底物包括但不限于魯米諾(luminol)、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、吖啶酰胺類或過氧化草酸酯類。

進(jìn)一步，所述的催化氧化反應(yīng)利用雙氧水(h2o2)觸發(fā)。

本發(fā)明還公開了一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的試劑盒，包括：真菌毒素核酸適體，真菌毒素核酸適體互補(bǔ)序列，酶切輔助信號(hào)放大體系，g4結(jié)構(gòu)制備體系，比色、熒光及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系。

本發(fā)明所述真菌毒素包括但不限于赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、t-2毒素、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、伏馬毒素b1和伏馬毒素b2。

本發(fā)明所述真菌毒素核酸適體為可與真菌毒素發(fā)生結(jié)合作用的dna，不同真菌毒素種類對(duì)應(yīng)不同dna序列。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，不同真菌毒素適體序列可以為但不限于：所述赭曲霉毒素a核酸適體如序列表seqidno.1所示；所述玉米赤霉烯酮核酸適體如序列表seqidno.2所示；所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體如序列表seqidno.3所示；所述t-2毒素核酸適體如序列表seqidno.4所示；所述黃曲霉毒素m1核酸適體如序列表seqidno.5所示；所述黃曲霉毒素b1核酸適體如序列表seqidno.6所示；所述黃曲霉毒素b2核酸適體如序列表seqidno.7所示；所述伏馬毒素b1核酸適體如序列表seqidno.8所示；所述伏馬毒素b2核酸適體如序列表seqidno.9所示。

所述核酸適體互補(bǔ)序列為與上述真菌毒素核酸適體dna堿基互補(bǔ)的單鏈dna，互補(bǔ)比例大于適體長(zhǎng)度的1/3。

所述的真菌毒素核酸適體與其互補(bǔ)序列的3'端均用磷酸化進(jìn)行封閉處理。

進(jìn)一步，所述酶切輔助信號(hào)放大體系包括限制性內(nèi)切酶和反應(yīng)緩沖液，所述的限制性內(nèi)切酶為可切刻雜交雙鏈的酶類，包括但不限于hpy188i、msei或baegi；優(yōu)選的，所述的緩沖液為20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9。

進(jìn)一步，所述的g4結(jié)構(gòu)制備體系包括tdt、dntps、反應(yīng)緩沖液及配體分子，所述的dntps中各組分的濃度比為dgtp50％-100％，datp0％-50％，dttp0％-50％，優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液為1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2，所述配體分子為血紅素。

進(jìn)一步，所述的比色檢測(cè)體系包括過氧化酶比色底物和h2o2，所述的過氧化酶比色底物包括但不限于2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(abts^2-)、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)、鄰苯二胺(opd)及氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)，利用h2o2可觸發(fā)催化氧化反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述的熒光檢測(cè)體系包括熒光有機(jī)染料分子或過氧化酶熒光底物及h2o2，所述的熒光染料包括但不限于硫磺素t、結(jié)晶紫或噻唑橙，所述的過氧化酶熒光底物包括但不限于amplexred，利用h2o2可觸發(fā)催化氧化反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系包括過氧化酶化學(xué)發(fā)光底物和h2o2，所述的過氧化酶化學(xué)發(fā)光底物包括但不限于魯米諾(luminol)或異魯米諾及其衍生物、吖啶酯和吖啶酰胺類或過氧化草酸酯類，利用h2o2可觸發(fā)催化氧化反應(yīng)。

本發(fā)明檢測(cè)的原理為：檢測(cè)系統(tǒng)由兩條dna構(gòu)成，一條為真菌毒素的核酸適體，一條為與其互補(bǔ)的序列單鏈dna。上述兩條dna的3'末端均用磷酸化進(jìn)行封閉處理，雜交成雙鏈后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切刻，從而將3'-oh暴露出來。接下來，利用tdt調(diào)配底物池dntps的組成及比例，在3'-oh末端聚合獲得隨機(jī)排列的富含鳥嘌呤dna長(zhǎng)鏈，從而構(gòu)成連續(xù)多個(gè)g4結(jié)構(gòu)，利用其高效的脫氧核酶(dnazyme)活性和特異性結(jié)合熒光染料的性質(zhì)，同時(shí)輸出比色可視、熒光和化學(xué)發(fā)光等多重信號(hào)。當(dāng)有真菌毒素存在時(shí)，由于其與核酸適體的高親和作用，雜交雙鏈解旋，沒有3'-oh產(chǎn)生，導(dǎo)致tdt隨機(jī)合成鳥嘌呤序列受阻，無法形成g4結(jié)構(gòu)而信號(hào)降低，以此建立紫外、熒光和化學(xué)發(fā)光多元響應(yīng)的真菌毒素傳感檢測(cè)方法。

本發(fā)明合理利用核酸適體與真菌毒素結(jié)合前后的dna雜交行為、適體誘導(dǎo)變構(gòu)作用等，不僅無需標(biāo)記修飾、操作簡(jiǎn)單，而且還可極大地豐富真菌毒素識(shí)別方法及信號(hào)轉(zhuǎn)化與放大模式，顯著提升分析的精準(zhǔn)性、特異性、靈敏性及選擇性，另外，該策略更適用于具有較長(zhǎng)適體的底物類型，對(duì)多種不同真菌毒素均具有通用性及普適性。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明中構(gòu)建的這種多信號(hào)輸出體系，首次利用tdt無模板隨機(jī)聚合生成g4結(jié)構(gòu)對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)分析，與傳統(tǒng)方法相比，具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

第一，該策略無模板隨機(jī)生成，無需合成納米材料，且不受傳統(tǒng)g4結(jié)構(gòu)對(duì)于序列的精確要求限制，免標(biāo)記、過程簡(jiǎn)單、快速，有效降低檢測(cè)成本；

第二，該方法實(shí)現(xiàn)了在同一探針單元中的多元信號(hào)提取，通過紫外、熒光和化學(xué)發(fā)光多重信號(hào)的協(xié)同比照分析，可顯著提升檢測(cè)的可靠性與精準(zhǔn)性，降低假陽性信號(hào)的產(chǎn)生；

第三，隨機(jī)合成的連續(xù)g4結(jié)構(gòu)，構(gòu)成多個(gè)信號(hào)分子，可級(jí)聯(lián)放大響應(yīng)信號(hào)值，另外本體系最開始沒有已存在的dnazyme序列，信號(hào)背景很低，因此可顯著提高靈敏度、選擇性與檢測(cè)范圍，從發(fā)明效果來看，最低檢測(cè)限顯著低于國(guó)標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)；

第四，通過引入內(nèi)切酶切刻磷酸根保護(hù)的3'末端雙鏈dna，可對(duì)適體較長(zhǎng)的真菌毒素種類進(jìn)行有效分析，因此該方法對(duì)多種不同真菌毒素的檢測(cè)具有普適性與通用性，僅通過改變不同真菌毒素與之親和的引物適體，即可實(shí)現(xiàn)不同毒素分析；

第五，該比色體系可實(shí)現(xiàn)真菌毒素不同濃度的可視化半定量分析，為裸眼檢測(cè)真菌毒素提供了有力手段。

因此，本發(fā)明方法操作處理快速簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短，具有免標(biāo)記、低成本、高精準(zhǔn)、高靈敏等特點(diǎn)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出本發(fā)明檢測(cè)真菌毒素的方法步驟示意圖。

圖2比色法檢測(cè)ota?；趖dt延伸產(chǎn)生的g4結(jié)構(gòu)加入1ppbota前后的吸收光譜(a)與在415nm處吸收值的歸一化柱狀圖(b)。檢測(cè)不同濃度ota(0-2ppb)的可視化成像圖(c)。

圖3示出熒光法檢測(cè)ota?；趖dt延伸產(chǎn)生的g4結(jié)構(gòu)加入0.1ppbota前后的熒光光譜(a)與在485nm處熒光發(fā)射值的歸一化柱狀圖(b)。檢測(cè)不同濃度ota(0-0.5ppb)的熒光成像圖(c)。激發(fā)波長(zhǎng)為425nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為460-520nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。

圖4示出化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ota。基于tdt延伸產(chǎn)生的g4結(jié)構(gòu)加入1ppbota前后的在425nm處化學(xué)發(fā)光響應(yīng)值的歸一化柱狀圖。

圖5示出比色法、熒光法及化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)zen?；趖dt延伸產(chǎn)生的g4結(jié)構(gòu)加入1ppbzen前后在450nm處吸收值(a)、在590nm處熒光發(fā)射值(b)及在445nm處化學(xué)發(fā)光響應(yīng)值(c)的歸一化柱狀圖。激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為570-700，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。

圖6示出比色法、熒光法及化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)don?；趖dt延伸產(chǎn)生的g4結(jié)構(gòu)加入2ppbdon前后在492nm處吸收值(a)與在630nm處熒光發(fā)射值(b)及在425nm處化學(xué)發(fā)光響應(yīng)值(c)的歸一化柱狀圖。激發(fā)波長(zhǎng)為580nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為600-680nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部分以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明不同真菌毒素種類對(duì)應(yīng)不同核酸適體，其中，所述真菌毒素核酸適體序列如表1：

表1不同真菌毒素的核酸適體

實(shí)施例1一種多信號(hào)檢測(cè)赭曲霉毒素a(ota)的方法

一種多信號(hào)檢測(cè)ota的方法，具體操作步驟過程如下(具體步驟如圖1所示)：

將100nm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的ota核酸適體(5′-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-po4^3--3′)與1μm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列(5′-tgtccgatgctccctttacgccacccacac-po4^3--3′)及0-200ppbota于tris-hcl緩沖液(20mmtris-hcl,ph7.5)的中反應(yīng)2min。

將上述溶液與8單位的hpy188i加入于反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)中孵育60min，隨后溶液加熱至65℃，保持20min終止反應(yīng)。

上述溶液中加入5個(gè)單位的tdt和1mmdntps(dgtp50％，datp40％，dttp10％)，于反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)中37℃下孵育2h，之后于70℃水浴10min終止反應(yīng)，作為混合液①。

將混合液①中加入0.125□m血紅素，于mes緩沖液(20mmmes-tris,40mmkcl,and0.05％tritonx-100,ph5.5)中反應(yīng)，之后再加入20mmabts^2-與20mmh2o2引發(fā)變色，在波長(zhǎng)范圍為400nm到700nm進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)。

將混合液①中加入2□m硫磺素t，于tris-hcl緩沖液(10mmtris-hcl,50mmkcl,ph7.2)中反應(yīng)后，檢測(cè)熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為425nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為460-520nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。

將混合液①中加入0.125□m血紅素，于hepes緩沖液(25mmhepes,20mmkcland50mmnacl,ph9.0)反應(yīng)，之后再加入10mmluminol和20mmh2o2，在波長(zhǎng)范圍為300nm到600nm進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值的檢測(cè)。

結(jié)果顯示：利用新型隨機(jī)排列富含鳥嘌呤序列的無模板制備策略及酶切輔助信號(hào)放大方法，可形成g4結(jié)構(gòu)，構(gòu)成比色可視化、熒光及化學(xué)發(fā)光響應(yīng)體系(圖2a、圖3a和圖4，g4)。當(dāng)1ppb的ota存在時(shí)，比色、熒光及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)信號(hào)均有明顯下降(圖2a、圖3a和圖4，g4-ota)。在比色體系中，與g4相比，415nm處信號(hào)下降約6.8倍(圖2b)，最低檢測(cè)限為0.005ppb，裸眼可視化區(qū)分最低濃度為0.01ppb，線性范圍為0.01-2ppb(圖2c)；在熒光體系中，與g4相比，波長(zhǎng)425nm激發(fā)后，在485nm處信號(hào)下降約12倍(圖3b)，最低檢測(cè)限為0.001ppb，線性范圍為0.005-0.5ppb(圖3c)；在化學(xué)發(fā)光體系中，最低檢測(cè)限為0.008ppb，線性范圍為0.01-2ppb(圖4)。通過紫外、熒光及化學(xué)發(fā)光多信號(hào)的比照分析，誤差在2％以內(nèi)；利用競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)s＝y(tǒng)/z×100％(s：交叉反應(yīng)率；y：ota的ic50；z：其它真菌毒素及ota結(jié)構(gòu)類似物等小分子的ic50；ic50：半抑制濃度)計(jì)算交叉反應(yīng)1％以內(nèi)，該方法對(duì)ota檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性、選擇性，對(duì)其它物質(zhì)有較好的抗干擾能力。

實(shí)施例2一種多信號(hào)檢測(cè)ota的試劑盒

一種多信號(hào)檢測(cè)ota的試劑盒，包括：

ota核酸適體，適體互補(bǔ)序列，酶切輔助信號(hào)放大體系，g4結(jié)構(gòu)制備體系，比色、熒光及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的ota核酸適體為5′-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-po4^3--3′。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列為5′-tgtccgatgctccctttacgccacccacac-po4^3--3′。

酶切輔助信號(hào)放大體系包括hpy188i及反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)。

g4結(jié)構(gòu)制備體系包括tdt、dntps(gtp50％，datp40％，dttp10％)、反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)。

比色檢測(cè)體系包括血紅素、abts^2-、h2o2及mes緩沖液(20mmmes-tris,40mmkcl,and0.05％tritonx-100,ph5.5)。

熒光檢測(cè)體系包括硫磺素t及tris-hcl緩沖液(10mmtris-hcl,50mmkcl,ph7.2)。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系包括血紅素、luminol、h2o2及hepes緩沖液(25mmhepes20mmkcland50mmnacl,ph9.0)。

實(shí)施例3一種多信號(hào)檢測(cè)玉米赤霉烯酮(zen)的方法

一種多信號(hào)檢測(cè)zen的方法，具體操作步驟過程如下：

將10nm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的zen核酸適體(5′-gcatcactacagtcattacgcatcgtggggatgggaggttgttacgcaggagatgttaatcgtgtgaagtgc-po4^3--3′)與100nm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列(5′-gcacttcacacgattaacatctcctgcgta-po4^3--3′)及0-500ppbzen于tris-hcl緩沖液(20mmtris-hcl,ph7.5)的中反應(yīng)5min。

將上述溶液與2個(gè)單位的msei加入反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)中孵育45min，隨后溶液加熱至65℃，保持20min終止反應(yīng)。

上述溶液中加入2個(gè)單位的tdt和1mmdntps(dgtp60％，datp40％，)，于反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)中，37℃下孵育60min，之后于70℃水浴10min終止反應(yīng)，作為混合液①。

將混合液①中加入0.1□m血紅素，于緩沖液(100mm檸檬酸,200mmnaac,ph5.4)中反應(yīng)，之后再加入20mmtmb與20mmh2o2引發(fā)變色，在波長(zhǎng)范圍為300nm到600nm進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)。

將混合液①中加入0.1□m血紅素，于tris-ac緩沖液(10mmtris-ac,20mmkcl,and0.05％tritonx-100,ph7.4)中反應(yīng)，再加入1mmamplexred和20mmh2o2后，檢測(cè)熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為570-700nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。

將混合液①中加入0.1□m血紅素，于緩沖液(20mmmes-tris,20mmkcl,ph5.0)中反應(yīng)，之后再加10mm吖啶酯和20mmh2o2，在波長(zhǎng)范圍為300nm到600nm進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值的檢測(cè)。

結(jié)果顯示：檢測(cè)zen時(shí)，比色體系中，最低檢測(cè)限為0.008ppb，線性范圍為0.08-8ppb(圖5a)；熒光體系中，最低檢測(cè)限為0.005ppb，線性范圍為0.01-2ppb(圖5b)；化學(xué)發(fā)光體系中，最低檢測(cè)限為0.008ppb，線性范圍為0.02-4ppb(圖5c)；誤差在2％以內(nèi)，交叉反應(yīng)1％以內(nèi)。

實(shí)施例4一種多信號(hào)檢測(cè)zen的試劑盒

一種多信號(hào)檢測(cè)zen的試劑盒，包括：

zen核酸適體，適體互補(bǔ)序列，酶切輔助信號(hào)放大體系，g4結(jié)構(gòu)制備體系，比色、熒光及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的zen核酸適體為5′-gcatcactacagtcattacgcatcgtggggatgggaggttgttacgcaggagatgttaatcgtgtgaagtgc-po4^3--3′。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列為5′-gcacttcacacgattaacatctcctgcgta-po4^3--3′。

酶切輔助信號(hào)放大體系包括msei及反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)。

g4結(jié)構(gòu)制備體系包括tdt、dntps(gtp60％，datp40％)及反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)。

比色檢測(cè)體系包括血紅素、tmb、h2o2及緩沖液(100mm檸檬酸,200mmnaac,ph5.4)。

熒光檢測(cè)體系包括血紅素、amplexred、h2o2及tris-ac緩沖液(10mmtris-ac,20mmkcl,and0.05％tritonx-100,ph7.4)。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系包括血紅素、吖啶酯、h2o2及緩沖液(20mmmes-tris,20mmkcl,ph5.0)。

實(shí)施例5一種多信號(hào)檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)方法

一種多信號(hào)檢測(cè)don方法，具體操作步驟過程如下：

將1μm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的don核酸適體(5′-gcatcactacagtcattacgcatcgtaggggggatcgttaaggaagtgcccggaggcggtatcgtgtgaagtgc-po4^3--3′)與10μm磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列(5′-gcacttcacacgataccgcctccgggcact-po4^3--3′)及0-1000ppbdon于tris-hcl緩沖液(20mmtris-hcl,ph7.5)的中反應(yīng)10min。

將上述溶液與10個(gè)單位的baegi加入于反應(yīng)緩沖液(20mmtris-hcl,10mmmgcl2,50mmnacl,ph7.9)中孵育120min，隨后溶液加熱至80℃，保持20min終止反應(yīng)。

上述溶液中加入10個(gè)單位的tdt和1mmdntps(dgtp70％，datp30％)于反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)中，37℃下孵育45min，之后于70℃水浴10min終止反應(yīng)，作為混合液①。

將混合液①中加入0.5□m血紅素，于緩沖液(100mm檸檬酸,200mmna2hpo4,ph5.0)中反應(yīng)，再加入20mmopd與20mmh2o2引發(fā)變色，之后利用1mh2so4終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)范圍為400nm到700nm進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)。

將混合液①中加入2□m結(jié)晶紫，于tris-hcl緩沖液(10mmtris-hcl,20mmkcl,20mmkcl，ph7.2)中反應(yīng)后，檢測(cè)熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為580nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為600-680nm，激發(fā)及發(fā)射狹縫均為5nm。

將混合液①中加入0.5□m血紅素，于hepes緩沖液(25mmhepes,20mmkcland50mmnacl,ph9.0)反應(yīng)，之后再加10mmluminol和20mmh2o2，在波長(zhǎng)范圍為300nm到600nm進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值的檢測(cè)。

結(jié)果顯示：檢測(cè)don時(shí)，比色體系中，最低檢測(cè)限為0.01ppb，線性范圍為0.05-10ppb(圖6a)；熒光體系中，最低檢測(cè)限為0.005ppb，線性范圍為0.01-1ppb(圖6b)；化學(xué)發(fā)光體系中，最低檢測(cè)限為0.01ppb，線性范圍為0.05-5ppb(圖6c)；誤差在2％以內(nèi)，交叉反應(yīng)1％以內(nèi)。

實(shí)施例6一種多信號(hào)檢測(cè)don的試劑盒

一種多信號(hào)檢測(cè)don的試劑盒，包括：

don核酸適體，適體互補(bǔ)序列，酶切輔助信號(hào)放大體系，g4結(jié)構(gòu)制備體系，比色、熒光及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的don核酸適體為5′-gcatcactacagtcattacgcatcgtaggggggatcgttaaggaagtgcccggaggcggtatcgtgtgaagtgc-po4^3--3′。

磷酸化進(jìn)行封閉處理后的適體互補(bǔ)序列為5′-gcacttcacacgataccgcctccgggcact-po4^3--3′。

酶切輔助信號(hào)放大體系包括baegi及反應(yīng)緩沖液(20mmtris-ac,10mmmg(ac)2,50mmkac,ph7.9)。

g4結(jié)構(gòu)制備體系包括tdt、dntps(gtp70％，datp30％)、反應(yīng)緩沖液(1m二甲胂酸鉀,125mmtris,0.05％tritonx-100,5mmcocl2,ph7.2)。

比色檢測(cè)體系包括血紅素、opd、h2o2、h2so4及緩沖液(100mm檸檬酸,200mmna2hpo4,ph5.0)。

熒光檢測(cè)體系包括結(jié)晶紫及tris-hcl緩沖液(10mmtris-hcl,20mmkcl,20mmkcl，ph7.2)。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系包括血紅素、luminol、h2o2及hepes緩沖液(25mmhepes,20mmkcland50mmnacl,ph9.0)。

從上述實(shí)施例中看出：ota、zen及don最低檢測(cè)限均顯著低于我國(guó)gb2761-2017《食品中真菌毒素限量》中的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此本發(fā)明構(gòu)建的新型隨機(jī)排列鳥嘌呤四聚體的紫外、熒光及化學(xué)發(fā)光多重響應(yīng)信號(hào)檢測(cè)策略，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的快速、便捷、免標(biāo)記分析，同時(shí)顯著提升檢測(cè)的可靠性、精準(zhǔn)度和靈敏性。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

sequencelisting

<110>國(guó)家糧食局科學(xué)研究院

<120>一種多信號(hào)檢測(cè)真菌毒素的方法及試劑盒

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<213>人工合成赭曲霉毒素a核酸適體序列

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<213>人工合成玉米赤霉烯酮核酸適體序列

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<213>人工合成脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體序列

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<213>人工合成t-2毒素核酸適體序列

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<213>人工合成黃曲霉毒素m1核酸適體序列

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<213>人工合成黃曲霉毒素b1核酸適體序列

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<213>人工合成黃曲霉毒素b2核酸適體序列

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<213>人工合成伏馬毒素b1核酸適體序列

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<213>人工合成伏馬毒素b2核酸適體序列

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gcatcactacagtcattacgcatctacgtgacgagggtgactatggcggtggcgtctgtg60

agcacgtgtgaagtgctgtccc82