專利名稱：血清結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測試劑及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測血清結(jié)核分枝桿菌抗體的檢測試劑及檢測方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉砀髌鞴?，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，其傳播和傳染呈全球性加劇的態(tài)勢。對結(jié)核病流行的國家和地區(qū)來說，加強(qiáng)對結(jié)核病人特別是傳染性結(jié)核病人的管理和治療，是最重要的防治措施。由于多種耐藥結(jié)核菌的增多、HIV/AIDS的流行、移民、以及不少國家和地區(qū)對結(jié)核病控制的忽視等因素，20世紀(jì)90年代以來，全球結(jié)核病死灰復(fù)燃而且發(fā)病率迅速回升。結(jié)核病已成為緊迫的全球公共衛(wèi)生問題。我國結(jié)核病的流行十分嚴(yán)重，在全球仍屬高發(fā)地區(qū)。 主要表現(xiàn)為三高一低患病率高、死亡率高、耐藥率高、年遞降率低。傳染性肺結(jié)核疫情居高不下。據(jù)2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查揭示，全國活動性肺結(jié)核患病率為367/10 萬，涂陽肺結(jié)核患病率為122/10萬，推算全國有451萬活動性肺結(jié)核病人，其中150多萬為涂陽肺結(jié)核病人，即結(jié)核病傳染源。15 59歲其活動性、涂陽和菌陽肺結(jié)核病例占各類病例人數(shù)的53%、61. 6%和56. %。我國結(jié)核病死亡居各種死因順位的第9位，全國結(jié)核病死亡專率為9. 8/10萬，每年死于結(jié)核病者達(dá)12萬余人，相當(dāng)于各種其他傳染病和寄生蟲病死總和的兩倍。近年來，我國報告HIV感染和艾滋病呈急劇上升趨勢，HIV和結(jié)核菌雙重感染必將對我國結(jié)核病流行帶來不可忽視的影響。隨著我國加入世界貿(mào)易組織后，進(jìn)出口貿(mào)易的迅速發(fā)展，交通工具、人員、貨物的往來日益頻繁，急劇增加的流動人口對于結(jié)核病流行和控制帶來復(fù)雜和負(fù)面影響。增加了肺結(jié)核傳播和擴(kuò)散的機(jī)會，對社會造成極大的危害。因此我國結(jié)核病流行形勢仍十分嚴(yán)峻。鑒于目前我國對結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要通過痰涂片和病原分離培養(yǎng)，而痰涂片和病原分離培養(yǎng)受實(shí)驗(yàn)室條件、檢驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)和鏡檢技術(shù)水平的影響較大，靈敏度和特異度都達(dá)不到要求，陽性率低，檢驗(yàn)時間長，不能滿足進(jìn)行結(jié)核病快速檢測和診斷的要求。 大量結(jié)核病患者未能被及時診斷而延誤了治療時機(jī)，這也是目前結(jié)核病流行日趨嚴(yán)重、死亡率急劇增高的重要原因之一。因此，迫切需要特異、靈敏、快速、簡便易行的肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)篩查、診斷方法和試劑。目前的研究表明結(jié)核桿菌菌體抗原能刺激B淋巴細(xì)胞分化增殖成漿細(xì)胞，并由漿細(xì)胞分泌特異性抗體。如Mcholls等用全細(xì)胞抗原作凝集反應(yīng)，Nassau用固相放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，以及Mahfonz以聚合結(jié)核菌素抗原作免疫熒光技術(shù)等研究，均證明活動性或某些類型的結(jié)核病人體內(nèi)出現(xiàn)一定量的抗體。雖然抗體難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對胞內(nèi)寄生的結(jié)核菌免疫作用不顯著，但利用體內(nèi)抗體的測定，作為疾病的輔助診斷和觀察化療療效的指標(biāo)是有意義的。Grange等進(jìn)一步研究證明活動性結(jié)核病人體內(nèi)升高的特異性抗體主要為IgG類。上述研究為免疫學(xué)診斷結(jié)核病開辟了新的途徑。
而運(yùn)用ELISA檢測特異性結(jié)核抗體對結(jié)核病的診斷和鑒別有重要價值?？贵w滴度愈高者，則患結(jié)核病的可能性愈大。結(jié)核病的血清抗體滴度與臨床經(jīng)過呈正相關(guān)。對結(jié)核病患病期抗體水平的動態(tài)觀察結(jié)果顯示隨著治療好轉(zhuǎn)患者血清抗體水平平行降低。這可作為病情轉(zhuǎn)歸的一項(xiàng)參考指標(biāo)。當(dāng)早期抗體呈陰性反應(yīng)，以后抗體反應(yīng)陽轉(zhuǎn)對診斷有意義；當(dāng)抗體維持在陽性反應(yīng)范圍，其病狀可視為穩(wěn)定期；抗體水平持續(xù)在較高水平，一般認(rèn)為病情遷延、療效較差。肺結(jié)核，尤其是肺外結(jié)核，臨床表現(xiàn)的多邊性和不典型性，早期診斷較為困難。如采用特異抗原進(jìn)行特異性IgG抗體的檢測，在診斷上具有較高的敏感性和特異性，同時測定血清與腹水或腦脊液中的抗體，二者同時增高則具有極為重要的診斷價值。因此，許多學(xué)者致力于從結(jié)核桿菌中分離和鑒定特異性抗原用作診斷試劑。已有如結(jié)核菌38kDa蛋白等抗原用分別于ELISA、EIA等方法，進(jìn)行結(jié)核病的診斷，但是目前的這些抗原的檢測準(zhǔn)確率還是較低。因此研究建立完善、快速、簡便易行的血清結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)診斷方法，進(jìn)行特異、靈敏、快速診斷試劑的研究、應(yīng)用是本領(lǐng)域亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是本領(lǐng)域難以快速、較為準(zhǔn)確地檢測血清中結(jié)核分枝桿菌抗體的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種用于檢測離體血清中分支結(jié)核桿菌的上述細(xì)菌的試劑及快速檢測方法。本發(fā)明的血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑包含混合的三種結(jié)核桿菌抗原蛋白 38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。本發(fā)明還提供了結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒。該試劑盒以結(jié)核桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白混合物作為檢測抗原。其中，上述的結(jié)核桿菌抗體檢測試劑盒是免疫檢測試劑盒。其中，上述的免疫檢測試劑盒是ELISA試劑盒、層析金標(biāo)法試劑盒或IFA法試劑盒中的任意一種。其中，上述的免疫檢測試劑盒是膠體金標(biāo)記雙抗原夾心法試劑盒。進(jìn)一步的，上述膠體金標(biāo)記雙抗原夾心法試劑盒是雙抗原夾心法膠體金試紙卡； 試紙卡的硝酸纖維素膜混合固定有結(jié)核桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白三種抗原于檢測線上，質(zhì)控線上固定羊抗兔IgG抗體。本發(fā)明提供的血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測方法包括以下步驟將離體血清與同時含有結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的試劑接觸，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的檢測，根據(jù)是否檢測到了產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，判斷離體血清中是否存在結(jié)核桿菌抗體。其中，上述方法中所述的抗原抗體反應(yīng)的檢測是靠ELISA法、膠體金標(biāo)記法或IFA 法中的任意一種進(jìn)行。其中，上述方法中所述的膠體金標(biāo)記法為膠體金雙抗原夾心法。本發(fā)明通過大量工作，創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)，將三種結(jié)核桿菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白共同用于血清結(jié)核桿菌抗體的檢測具有很好的效果， 甚至好于更多種抗原蛋白的組合。并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了檢測試劑和檢測方法。將本發(fā)明的膠體金免疫層析法試紙卡內(nèi)部應(yīng)用到四家省級結(jié)核病院，得到的結(jié)果證實(shí)了這種試劑具有快速(10 15分鐘出結(jié)果)、敏感(以細(xì)菌學(xué)檢測方法為金標(biāo)準(zhǔn)，敏感度為80. 4% )、特異(特異性為86.3%)、簡便等特點(diǎn)。可用于離體血清樣本中結(jié)核桿菌抗體的快速篩查，適于各級實(shí)驗(yàn)室使用，具有很好的應(yīng)用前景


圖1、不同濃度的38kDa抗原蛋白包被酶標(biāo)板ELISA結(jié)果。圖2、不同稀釋度的結(jié)核病病人血清與陰性血清的ELISA檢測結(jié)果圖3、38kDa抗原檢測的ROC曲線Wouden指數(shù)為0. 51)圖4、38kDa+CFP10抗原聯(lián)合檢測的ROC曲線Wouden指數(shù)為0. 549)圖5、38kDa+MPT64抗原聯(lián)合檢測的ROC曲線Wouden指數(shù)為0. 5)圖6、38kDa+CFP10+Ag85B抗原聯(lián)合檢測的ROC曲線Wouden指數(shù)為0. 52)圖 7、38kDa+CFP10+MPT64 抗原聯(lián)合檢測的 ROC 曲線(Youden 指數(shù)為 0. 557)圖8、膠體金快速檢測卡用于結(jié)核抗體檢測結(jié)果。左邊3個位陽性結(jié)果，右邊3個為陰性結(jié)果，質(zhì)控線均可見。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖通過實(shí)施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例一結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的篩選1特異抗原的篩選、確定采用蛋白質(zhì)組分析、Western blot等技術(shù)，分析了結(jié)核分枝桿菌的蛋白抗原譜，確定6種特異性抗原成分38KD、Ag85B、MPT64、16KD、CFP10和IOKD蛋白抗原。2特異蛋白抗原編碼基因的克隆、表達(dá)和純化采用分子克隆技術(shù)，對確定的38KD、Ag85B、MPT64、16KD、CFPlO和IOKD蛋白抗原成分進(jìn)行克隆、表達(dá)，并采用分子篩和離子交換柱層析獲得了純化抗原，經(jīng)驗(yàn)證所獲產(chǎn)物的序列正確后，將其用于后繼試驗(yàn)。當(dāng)然，使用其他方式獲得的結(jié)核分枝桿菌的上述抗原蛋白也能用于下述試驗(yàn)并取得相一致的結(jié)果。實(shí)施例二結(jié)核抗原的診斷效能分析和抗原組合方式的篩選試驗(yàn)方法1、確定各抗原最佳ELISA條件1)蛋白濃度的測定蛋白測量儀測得重組蛋白在沈此?。?！和^Onm波長的OD值，依據(jù)公式蛋白含量=0D280X1. 45+0D260X0. 74(mg/ml)計(jì)算出蛋白含量。2)最佳抗原包被濃度的確定用碳酸鹽包被液(PH9.6)稀釋純化的蛋白抗原至不同的濃度(10ug/ml、8ug/ml、6ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml、0. 75ug/ml、0. 5ug/ml、 0. 25ug/ml、0. lug/ml、0· 075ug/ml、0. 05ug/ml)，酶標(biāo)板中每孔加入 0. lml，4°C 過夜；取出， 空干，每孔加入O.aiil 30%小牛血清，4°C過夜；分別加入稀釋好的結(jié)核病陽性血清和陰性血清，并作空白對照，37°C孵育2小時；加入羊抗人IgG-HRPd 2000)，37°C孵育1小時； 加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液顯色15分鐘，而后用2M硫酸終止反應(yīng)，在495nm波長條件下測OD值；根據(jù)測定OD值和蛋白濃度繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定適合的抗原濃度；3)血清抗體稀釋度的確定根據(jù)已確定的抗原的合適濃度用包被緩沖液稀釋抗原， 包被酶標(biāo)板，4°C過夜；封閉同上步；加待測血清，用結(jié)核病病人血清和健康人血清，按一定濃度稀釋(1 20、1 50、1 75、1 100,1 125,1 150,1 175,1 200,1 225、 1 250,1 300,1 500)，37°C孵育 2 小時；加入羊抗人 IgG-HRP(l 2000)，37°C孵育 1小時；顯色檢測OD值同上步；根據(jù)檢測0D450值，選擇0D450值高且穩(wěn)定的血清最高稀釋倍數(shù)為合適稀釋度；2、利用上述確定的各抗原最佳ELISA條件，檢測同樣的105份陽性血清和100份陰性血清。3、繪制受試者工作特征曲線法(Receiver Operating Characteristic，ROC)利用 SPSS軟件繪制各種抗原診斷的ROC曲線，用ROC曲線來描述該抗原檢測的靈敏度和特異度之間的關(guān)系，并以^uden指數(shù)最大的切點(diǎn)對應(yīng)的OD值就是該抗原檢測的Cut-off值；采用該Cut-off值去判斷105份陽性血清和100份陰性血清的陽陰性，待測標(biāo)本OD >該Cut-off 值為陽性，待測標(biāo)本OD <該Cut-off值為陰性；4、總結(jié)計(jì)算出不同抗原組合的靈敏度和特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，采用 Youden指數(shù)評價得出最適的抗原組合方式；5、用SPSS軟件對^uden指數(shù)較高的幾種組合進(jìn)行具體分析，并對篩選出的最佳組合進(jìn)行綜合性評價；實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、蛋白的濃度測量純化得到的CFP1 OkDa、38kDa、MPT64蛋白和本實(shí)驗(yàn)室保存的Ag85B的濃度，各種重組蛋白的濃度分別為 38kDa 2. 53mg/ml、CFP10 1. 24mg/ml, Ag85B 0.41mg/ml、 MPT641. 28mg/ml。2、最佳ELISA反應(yīng)體系的確定(以38kDa為例)重組蛋白38kDa分別以一系列濃度包被酶標(biāo)板，結(jié)核病病人的血清和健康人的血清按1 50稀釋，ELISA檢測A值顯示2ug/ml為純化蛋白適宜的包被濃度(參見圖1)。重組蛋白38kDa按檢測得到的最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，封閉。加入稀釋結(jié)核病病人血清和健康人血清。結(jié)果顯示血清為1 225(見圖幻適宜稀釋度；其他三種的蛋白的ELISA最佳條件摸索實(shí)驗(yàn)方法同38kDa，結(jié)果見表1 :表1 3種重組蛋白ELISA檢測的最佳蛋白包被濃度和血清稀釋度
權(quán)利要求
1.血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑，其特征在于包含混合的三種結(jié)核桿菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。
2.結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，其特征在于以結(jié)核桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白混合物作為檢測抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的結(jié)核桿菌抗體檢測試劑盒是免疫檢測試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的免疫檢測試劑盒是ELISA試劑盒、層析金標(biāo)法試劑盒或IFA法試劑盒中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的免疫檢測試劑盒是膠體金標(biāo)記雙抗原夾心法試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的膠體金標(biāo)記雙抗原夾心法試劑盒是雙抗原夾心法膠體金試紙卡；試紙卡的硝酸纖維素膜混合固定有結(jié)核桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白三種抗原于檢測線上，質(zhì)控線上固定羊抗兔IgG抗體。
7.血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測方法，其特征在于包括以下步驟將離體血清與同時含有結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的試劑接觸，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的檢測，根據(jù)是否檢測到了產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，判斷離體血清中是否存在結(jié)核桿菌抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述抗原抗體反應(yīng)的檢測方法是靠ELISA 法、膠體金標(biāo)記法或IFA法中的任意一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述膠體金標(biāo)記法為膠體金雙抗原夾心法。
全文摘要
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是本領(lǐng)域難以快速、較為準(zhǔn)確地檢測血清中結(jié)核分枝桿菌抗體。本發(fā)明技術(shù)方案是提供一種用于檢測離體血清中分支結(jié)核桿菌抗體的檢測試劑及快速檢測方法。本發(fā)明的血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑包含混合的三種結(jié)核桿菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFP10抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。本發(fā)明提供的血清結(jié)核分枝桿菌抗體檢測方法是將離體血清與同時含有結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原蛋白、CFP10抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的試劑接觸，根據(jù)是否檢測到了產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，判斷離體血清中是否存在結(jié)核桿菌抗體。將本發(fā)明試劑具有快速、敏感、特異、簡便等特點(diǎn)、可用于離體血清樣本中結(jié)核桿菌抗體的快速篩查，適于各級實(shí)驗(yàn)室使用，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/558GK102495206SQ20111043016
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者楊雨, 樊學(xué)軍, 田綠波, 石瑩, 陳肖瀟 申請人:楊雨, 樊學(xué)軍, 田綠波, 石瑩, 陳肖瀟