專利名稱：一種快速檢測豬細小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬細小病毒的試劑盒，尤其涉及一種快速檢測豬細小病毒的 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，屬于豬細小病毒的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)感染是引起初產(chǎn)母豬繁殖障礙的主要原 因之一。該病以初產(chǎn)母豬產(chǎn)出死胎，畸形胎，木乃伊胎以及病弱仔豬為特征，病原基因變異， 毒力越來越強，造成持續(xù)感染的流行趨勢，廣泛分布于世界各地，給我國乃至世界各國養(yǎng)豬 業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。為了便于對PPV做出準確的診斷，已經(jīng)建立多種實驗室診斷方法，如ELISA， RT-PCR，免疫熒光，原位雜交，病毒分離等，但這些診斷方法需要借助一些特殊儀器的輔助 才能完成，穩(wěn)定性較差、操作麻煩、效率低、需低溫保存、儲運不方便，限制了這些方法在基 層單位的廣泛使用。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediatedIsothermal Amplification，LAMP)技術(shù)具有特 異性強、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點，其特點是對靶基因的6個部位設(shè)定4種引物，利用 鏈置換反應(yīng)在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應(yīng)是多種引物共同啟動，使得反應(yīng)結(jié)果 比PCR更特異，另外，由于實行的是等溫擴增，反應(yīng)在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成，不僅節(jié)約儀 器成本，而且操作方法更簡單，適于現(xiàn)場快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測豬細小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)試劑 盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的需要借助一些特殊儀器的輔助才能完成檢測，穩(wěn)定性較差、操作 麻煩、效率低、需低溫保存、儲運不方便的問題。一種快速檢測PPV的LAMP試劑盒，包括以下各組分等溫反應(yīng)緩沖液，DNA聚合 酶，dNTP，硫酸鎂，由3對引物所組成的混合物，甜菜堿，蒸餾水和熒光染料；其中，第1對引 物序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，第2對引物序列為SEQID NO :3和SEQ ID N0: 4所示，第3對引物序列為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。優(yōu)選的，所述3對引物所組成的混合物是由各引物按照等摩爾的比例混合在一起 組成；優(yōu)選的，所述等溫反應(yīng)緩沖液為10X等溫反應(yīng)緩沖液，其中含有200mM三羚基甲 基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通；所述的DNA聚合酶優(yōu)選為Bst DNA聚合酶；所述的甜菜堿優(yōu)選為5M甜菜堿；
所述的硫酸鎂優(yōu)選為IOOmM硫酸鎂；所述的dNTP 優(yōu)選為 IOmM dNTP ；所述的蒸餾水優(yōu)選為三蒸處理水；
所述的熒光染料優(yōu)選為1000 X的熒光染料Gel-red。本發(fā)明試劑盒在檢測PPV的使用方法，包括(1)提取待檢樣品DNA;(2)建立擴增反應(yīng)體系2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩沖液、1. Oul DNA聚合酶(5U/ul)、1. 5ul IOmM dNTP、1.5ul IOOmM 硫酸鎂、2. Oul 3 對引物的混合物、5. Oul 5M 甜菜堿，6. 5ul 三蒸處理水，2ul待檢樣品DNA ；于60-65°C恒溫水浴箱中放置65min ；(3)擴增產(chǎn)物的顯色檢測在上述反應(yīng)管中加入Iul熒光染料，直接用肉眼觀察顏 色變化，如顏色變?yōu)榧t色，則說明樣品中含有PPV ；如果顏色為無色，說明待檢樣品不含有 PPV。(4)擴增產(chǎn)物的電泳檢測電泳檢測可以降低檢測成本，在2%瓊脂糖進行電泳， 陽性結(jié)果出現(xiàn)LAMP特異的階梯狀條帶，而陰性結(jié)果無階梯狀電泳條帶。本發(fā)明建立了 PPV LAMP檢測試劑盒，本試劑盒根據(jù)PPV的基因保守區(qū)的六個序列 設(shè)計了引物，該保守基因序列為PPV所共有。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴 的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴箱即可，可以使用熒光染料來觀察，簡單而快速。也可 以用電泳的方法檢驗檢測結(jié)果，可用于PPV的檢測，特別適合于基層現(xiàn)場應(yīng)用。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測PPV的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高、現(xiàn)場 應(yīng)用困難等缺陷，提供的PPV的檢測試劑盒，對PPV進行LAMP檢測，快速、準確性高、靈敏性 好、現(xiàn)場應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)、食品、出入境檢疫等領(lǐng)域。


圖1本發(fā)明試劑盒檢測PPV的特異性試驗結(jié)果；1. PPV-BQ ；2. PPV-ZJ ；3. PCVl ； 4. PCV2 ；5. PRV ；6. CSFV ；7. PRRS ；8 陰性對照。圖2本發(fā)明試劑盒檢測PPV的敏感性試驗結(jié)果；1 :lX107copy/ul ；2 :1 X IO6Copy/ ull ；3 1X105copy/ul ；4 1X104copy/ul ；5 1X103copy/ul ；6 1X102copy/ul ；7 1X lO'copy/ul ；8 1X10°copy/ul。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1本發(fā)明試劑盒的組裝及具體應(yīng)用方法(1)試劑盒組成及組分LAMP反應(yīng)液A 含有10 X等溫反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶(購自紐英倫生物技 術(shù)(北京)有限公司)5u/ul、10mM dNTP、IOOmM硫酸鎂、20uM3對引物混合物和5M甜菜堿， 其中10X等溫反應(yīng)緩沖液含有200mM甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、 20mM硫酸鎂和曲拉通。反應(yīng)液B:1000X的熒光染料Gel-red(購自北京美萊博醫(yī)學科 技有限公司)。
LAMP反應(yīng)液A每管20uL的最佳組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩沖液、1. Oul Bst DNA 聚合酶(5U/ul)、1. 5ul IOmM dNTP、1.5ul IOOmM硫酸鎂、2. Oul 3 對引物混合物、5. Oul 5M甜菜堿和6. 5ul三蒸處理水。(2)試劑盒反應(yīng)條件PPV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在裝有20ul反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入2ul待檢DNA，于60-65°C恒溫水浴箱中放置65min(3)試劑盒擴增產(chǎn)物的顯色檢測在上述反應(yīng)管中加入Iul反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榧t色， 則說明樣品中含有PPV病毒；如果顏色為無色，說明待檢樣品不含有PPV。也可以采用電泳 的方法進行檢測，電泳檢測可以降低檢測成本，在2%瓊脂糖進行電泳，陽性結(jié)果出現(xiàn)LAMP 特異的階梯狀條帶，而陰性結(jié)果無階梯狀電泳條帶。試驗例1本發(fā)明試劑盒在檢測PPV中的實驗室應(yīng)用結(jié)果(敏感性和特異性試驗)一、特異性試驗1. 1 毒株豬細小病毒 PPV-BQ 和 PPV-ZJ，PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRS 等(購自中 國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)；1. 2提取待檢測組織樣品的DNA ；1. 3檢測體系各組分配比如下反應(yīng)液A每管20uL的最佳組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩沖液、1. Oul BstDNA聚 合酶(5U/ul)、1. 5ul IOmM dNTP、1.5ul IOOmM硫酸鎂、2. Oul 3 對引物混合物、5. Oul 5M甜 菜堿和6. 5ul三蒸處理水。試劑盒反應(yīng)條件PPV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在裝有20ul反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入 2ul待檢DNA，于60-65°C恒溫水浴箱中放置65min。試劑盒擴增產(chǎn)物的顯色檢測在上述反應(yīng)管中加入Iul反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察 顏色變化，如顏色變?yōu)榧t色，則說明樣品中含有PPV病毒；如果顏色為無色，說明待檢樣品 不含有PPV。也可以采用電泳的方法進行檢測，電泳檢測可以降低檢測成本，在2%瓊脂糖 進行電泳，陽性結(jié)果出現(xiàn)LAMP特異的階梯狀條帶，而陰性結(jié)果無階梯狀電泳條帶。2、試驗結(jié)果實驗結(jié)果見圖1.試驗結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒可以特異性檢出豬細小病毒 PPV-BQ和PPV-ZJ，檢測結(jié)果均為陽性，出現(xiàn)特異性紅色熒光；而PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRS 檢測結(jié)果為陰性，無特異性紅色熒光。表明本發(fā)明試劑盒具有很高的特異性。二、敏感性試驗1. 1樣本PPV-PMD18T-NS1等(購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)；1. 2樣品的處理1 X 107copy/ul PPV-PMD18T-NS1按照十倍逐步遞減稀釋。1. 3檢測體系各組分配比如下反應(yīng)液A每管20uL的最佳組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩沖液、1. Oul BstDNA聚 合酶(5U/ul)、1. 5ul IOmM dNTP、1.5ul IOOmM硫酸鎂、2. Oul 3 對引物混合物、5. Oul 5M甜 菜堿和6. 5ul三蒸處理水。試劑盒反應(yīng)條件PPV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在裝有20ul反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入 2ul待檢DNA，于60-65°C恒溫水浴箱中放置65min。試劑盒擴增產(chǎn)物的顯色檢測在上述反應(yīng)管中加入Iul反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榧t色，則說明樣品中含有PPV病毒；如果顏色為無色，說明待檢樣品 不含有PPV。也可以采用電泳的方法進行檢測，電泳檢測可以降低檢測成本，在2%瓊脂糖 進行電泳，陽性結(jié)果出現(xiàn)LAMP特異的階梯狀條帶，而陰性結(jié)果無階梯狀電泳條帶。
2、試驗結(jié)果見圖2 ；試驗結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒最低檢測1 X IO1c0PyAil的 質(zhì)粒濃度(PPV-PMD18T-NS1)，表明采用本發(fā)明試劑盒進行檢測具有很高的靈敏性。
權(quán)利要求
一種快速檢測豬細小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，包括等溫反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，dNTP，硫酸鎂，由3對引物所組成的混合物，甜菜堿，蒸餾水和熒光染料；其中，第1對引物序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，第2對引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，第3對引物序列為SEQ ID NO5和SEQID NO6所示。
2.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述等溫反應(yīng)緩沖液 為IOX等溫反應(yīng)緩沖液，其中含有200mM三羚基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM 硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通。
3.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述3對引物所組成 的混合物是由各引物按照等摩爾的比例組成。
4.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的DNA聚合酶為 Bst DNA聚合酶，其規(guī)格優(yōu)選為5U/ul。
5.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的甜菜堿為5M甜 菜堿。
6.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的硫酸鎂為IOOmM硫酸鎂。
7.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的dNTP為IOmM dNTP。
8.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的蒸餾水為三蒸 處理水。
9.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于所述的熒光染料為 1000X的熒光染料Gel-red。
10.按照權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述等溫反應(yīng)緩沖 液為IOX等溫反應(yīng)緩沖液，其體積大于或等于2. 5ul ；所述DNA聚合酶的規(guī)格為5U/ul，其 體積大于或等于1. Oul ；所述dNTP濃度為10mM，其體積大于或等于1. 5ul ；所述硫酸鎂為 IOOmM硫酸鎂，其體積大于或等于1. 5ul ；所述內(nèi)引物和外引物的混合物的體積大于或等于 2. Oul ；所述甜菜堿為5M甜菜堿，其體積大于或等于5. Oul ；所述蒸餾水為三蒸處理水，其 體積大于或等于6.5ul ；所述熒光染料為1000X的熒光染料Gel-red，其體積大于或等于 lul。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測豬細小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，包括等溫反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，dNTP，硫酸鎂，由3對引物所組成的混合物，甜菜堿，蒸餾水和熒光染料；其中，第1對引物序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，第2對引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，第3對引物序列為SEQ IDNO5和SEQ ID NO6所示。本發(fā)明根據(jù)豬細小病毒的基因保守區(qū)設(shè)計了引物，采用LAMP技術(shù)進行檢測，特異性強，靈敏度高，具有快速，準確性高、靈敏性好，現(xiàn)場應(yīng)用方便等優(yōu)點，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的周期長、靈敏度較低、成本高、現(xiàn)場應(yīng)用困難等缺陷。
文檔編號G01N21/64GK101818212SQ20101014635
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者崔尚金, 陳長木 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所