專(zhuān)利名稱(chēng)：：多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及了一種定性和半定量檢測(cè)人血清中過(guò)敏原特異性抗體IgE含量的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：過(guò)敏性疾病是現(xiàn)代社會(huì)中最常見(jiàn)的一種疾病，它是由廣泛存在的過(guò)敏原弓I發(fā)的，我國(guó)大約5-10%、美國(guó)和歐洲約有5-25%的人受過(guò)敏性疾病侵?jǐn)_，其中幼兒和青少年的病癥尤為明顯，威脅較嚴(yán)重。過(guò)敏反應(yīng)(allergicreaction)又稱(chēng)變態(tài)反應(yīng)；過(guò)敏原(allergen)又稱(chēng)變應(yīng)原。根據(jù)歐洲過(guò)敏和臨床免疫學(xué)學(xué)會(huì)(EuropeanAcademyofAllergyandClinicalImmunology,EAACI)發(fā)表的觀點(diǎn)，免疫介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)有兩種類(lèi)型IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)和非IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)(JohanssonSGO.etal，2001，Allergy,56:813-824)。IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)是過(guò)敏原刺激抗體的淋巴結(jié)、肝、脾等器官的單核吞噬系統(tǒng)，觸發(fā)漿細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性IgE(slgE)抗體。IgE分子的Fc端附著在肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞的IgE受體上，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再受同類(lèi)型過(guò)敏原剌激時(shí)，過(guò)敏原使IgE分子交聯(lián)，引起肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒化，釋放出組胺、白三烯及細(xì)胞因子等化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、導(dǎo)致機(jī)體的毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫、平滑肌痙攣、內(nèi)分泌活動(dòng)亢進(jìn)，引發(fā)過(guò)敏性疾病的臨床癥狀，如花粉癥、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性休克、蕁麻疹、濕疹、血管性水腫、關(guān)節(jié)炎、頭痛、腸胃功能失調(diào)及其它慢性癥狀(周光炎等譯，2002，免疫學(xué)，PP323-369,人民衛(wèi)生出版社；SampsonHA，1999，F(xiàn)oodallergy,parti，JAllergyClinImmunol,103:717-728)。過(guò)敏原致敏傳遞方式分三類(lèi)食物型，通過(guò)口腔攝入食物過(guò)敏原致敏；吸入型，通過(guò)鼻腔等吸入花粉、粉塵等環(huán)境過(guò)敏原致敏；接觸型，通過(guò)接觸皮膚，經(jīng)毛孔傳遞引發(fā)過(guò)敏，如鎳、鉻制品，橡膠制品等。本試劑盒涉及的過(guò)敏原為食物型和吸入型的大分子過(guò)敏原蛋白或多肽。吸入型物質(zhì)的過(guò)敏原是以Betvl為代表的樹(shù)花粉蛋白，以Phlp2為代表的草花粉蛋白，以Fddl為代表的動(dòng)物皮屑蛋白，以Penc3為代表的霉菌類(lèi)蛋白，以Derpl為代表的螨蟲(chóng)蛋白和以Blagl為代表的蟑螂蛋白等(HillerRetal，2002，F(xiàn)ASEBJ，16:414-418)。IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的致敏過(guò)敏原檢測(cè)在臨床上可以通過(guò)皮膚試驗(yàn)及各種體外檢測(cè)方法，如放射性過(guò)敏原吸附檢測(cè)(RAST)、免疫印跡(IS)及酶免疫分析(EIA)等，結(jié)合病史、病癥的問(wèn)診來(lái)確定致敏的過(guò)敏原。體外檢測(cè)是測(cè)定血液樣本中的IgE，特別是過(guò)敏原特異性IgE(slgE)抗體濃度。酶免疫分析中有多種檢測(cè)結(jié)合酶的方法，即熒光法，化學(xué)發(fā)光法和免疫層析法等，且均有產(chǎn)品被美國(guó)FDA批準(zhǔn)(ChapmanJAetal，2006，F(xiàn)oodallergy:apracticeparameter,AnnAllergyAsthmaImmunol,96:Sl-S68)。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)專(zhuān)門(mén)制定了人IgE抗體免疫分析方法評(píng)價(jià)的綱要(I/LA20—A,NCCLS,1997，17(20))。使用多通道免疫層析法，僅用少量樣品就可以簡(jiǎn)便、快速地同時(shí)檢測(cè)幾種至數(shù)十種過(guò)敏原，目測(cè)可定性判斷陽(yáng)性或陰性結(jié)果，使用比色卡可半定量分級(jí)，試劑操作方便，既可用于醫(yī)院床邊快速診斷，也可用于社區(qū)診所或鄉(xiāng)村醫(yī)院甚至家庭。尤其適合我國(guó)當(dāng)前的國(guó)情。多通道免疫層析法，采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)來(lái)定性和半定量檢測(cè)血清中的特異性IgE抗體。當(dāng)固化于硝酸纖維膜載體表面的致敏性抗原與病人血清在一起反應(yīng)后，血清中特異性IgE就會(huì)特異地結(jié)合到抗原上，此特異結(jié)合的抗體被標(biāo)記的抗人IgE抗體所識(shí)別，顏色的強(qiáng)度與血清中特異性IgE含量成比例;根據(jù)人血清中特異性IgE的濃度建立的分級(jí)比色卡，評(píng)判的過(guò)敏原的致敏程度。免疫層析法應(yīng)用的多種技術(shù)，如過(guò)敏原蛋白的提取純化方法，人IgE抗體和抗人IgE抗體的制備、純化，膠體金標(biāo)記抗人IgE抗體的制取純化等均己成熟，為多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑的商品化生產(chǎn)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法，每一個(gè)通道可快速檢測(cè)10—20種過(guò)敏原，多個(gè)通道可同時(shí)檢測(cè)60—IOO種不同的過(guò)敏原，多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，使用方便、快速，既可定性也可半定量檢測(cè)人血清過(guò)敏原特異性抗體IgE的含量，用以篩査和確診兩級(jí)試劑檢測(cè)患者致敏的過(guò)敏原并確定患者致敏反應(yīng)的程度。本發(fā)明的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒，其組成包括已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)、動(dòng)物皮屑類(lèi)、鳥(niǎo)羽絨類(lèi)、花粉類(lèi)、蟑螂類(lèi)、霉菌類(lèi)過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標(biāo)記的抗體，緩沖液，分級(jí)比色卡；其中已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括塵螨、粉螨、屋塵；已固化的吸入型動(dòng)物皮屑類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括貓、狗、馬、牛、羊；己固化的吸入型鳥(niǎo)羽絨類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括雞、鴨、鵝、鴿；已固化的吸入型花粉類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括樺樹(shù)、楓樹(shù)、榿樹(shù)、構(gòu)樹(shù)、棕櫚、葵樹(shù)、榛樹(shù)、柏樹(shù)、松樹(shù)、杉木、栗樹(shù)、櫟樹(shù)、梧桐、楊樹(shù)、柳樹(shù)、桑樹(shù)、榆樹(shù)、艾蒿、豚草、藜草、車(chē)前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、蘆葦、萚草、蒼耳、香蒲、莎車(chē)、芨芨草、向日葵；已固化的吸入型蟑螂類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜玻片包括德國(guó)小蠊、美、已固化的吸入型霉菌類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括點(diǎn)青霉菌、多主枝孢霉菌、煙曲霉菌、交鏈孢霉菌、黑根霉菌、釀酒酵母菌、小麥黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；膠體金標(biāo)記抗體膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體；多通道加樣槽由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造的多通道加樣槽；緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2。/。胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；分級(jí)比色卡根據(jù)國(guó)際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，制作的分級(jí)比色卡(顏色的強(qiáng)度與血清中特異性IgE含量成比例，隨特異性IgE濃度的升高，顏色逐漸變深)。上述的固化的吸入型過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條置于多通道加樣槽中。本發(fā)明的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步1)過(guò)敏原蛋白的制備將含過(guò)敏原蛋白的材料經(jīng)粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；2)膠體金標(biāo)記抗體的制備用膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體；3)用過(guò)敏原蛋白固化硝酸纖維膜條，并封閉；4)將過(guò)敏原蛋白固化硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中；5)配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HC1中含2%胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6)根據(jù)國(guó)際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，制作分級(jí)比色卡。(顏色的強(qiáng)度與血清中特異性IgE含量成比例，隨特異性IgE濃度的升高，顏色逐漸變深)。上述的多通道加樣槽由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造。本發(fā)明的試劑盒的使用方法，包括如下操作步驟(1)加入樣品液到加樣孔中，樣品液中的過(guò)敏原特異性IgE抗體各自與相應(yīng)的固相過(guò)敏原蛋白結(jié)合，過(guò)敏原特異性IgE抗體再與膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體結(jié)合，膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體同時(shí)也與質(zhì)控區(qū)中人IgE相結(jié)合。(2)加入緩沖液加樣孔中，加快血清標(biāo)本遷移速度，被結(jié)合區(qū)域顯色；(3)20—30分鐘后，用分級(jí)比色卡觀察結(jié)果；顏色的強(qiáng)度與血清中特異性IgE含量成比例。固化在硝酸纖維膜條表面上的抗原捕獲樣品血清中的特異性IgE抗體，波體金標(biāo)記抗人IgE抗體識(shí)別特異性IgE并與之結(jié)合，形成抗原—特異性IgE一膠體金標(biāo)記抗人IgE抗體的復(fù)合物，顏色的強(qiáng)度與血清中特異性IgE含量成比例，目測(cè)可定性判斷結(jié)果，使用比色卡可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分級(jí)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明建立了多通道免疫層析法測(cè)定樣品液中的過(guò)敏原特異性IgE抗體含量，定性和半定量篩查致敏過(guò)敏原，檢測(cè)靈敏度小于0.3IU/ml,使用比色卡可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分級(jí)，目測(cè)可定性判斷結(jié)果。臨床檢測(cè)中可以一次加樣，每一個(gè)通道可快速檢測(cè)10—20種過(guò)敏原，多個(gè)通道可同時(shí)檢測(cè)60—IOO種不同的過(guò)敏原，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為體外輔助診斷確定使患者致敏的過(guò)敏原及過(guò)敏反應(yīng)程度提供了有效的手段。既可用于醫(yī)院床邊快速診斷，也可用于社區(qū)診所或鄉(xiāng)村醫(yī)院甚至家庭。圖1是一塊多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑板的俯視圖2是三種螨蟲(chóng)主要過(guò)敏原蛋白Derpl、Derfl、Eurml的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)；'圖3是三種螨蟲(chóng)主要過(guò)敏原蛋白Derp2、Derf2、Eurm2的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)；圖4是過(guò)敏原蛋白chea2、phlpll及Olee2Betv2的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)。具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒，其組成包括已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)、動(dòng)物皮屑類(lèi)、鳥(niǎo)羽絨類(lèi)、花粉類(lèi)、蟑螂類(lèi)、霉菌類(lèi)過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，多通道加樣槽，膠體金標(biāo)記抗人IgE抗體、緩沖液、分級(jí)比色卡。本發(fā)明的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒的制備方法-l.過(guò)敏原蛋白的制備l.l過(guò)敏原蛋白的粗浸提液l丄l吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)蛋白提取液取50g詞養(yǎng)的螨蟲(chóng)，加入80ml丙酮或無(wú)水乙醇清洗滅活后用多層紗布過(guò)濾除去溶劑，風(fēng)干、研細(xì)，再加入100ml乙醚，反復(fù)振搖l小時(shí)脫脂；揮凈乙醚的脫脂粉以l:100(w/v)的量加入0.125mol/lNH4HCO3緩沖液(H8.3)，內(nèi)含0.1。/。NaN3溶液室溫提取3小時(shí)，期間經(jīng)常攪拌；10000g離心20分鐘，上清液-2(TC下貯存。1.1.2吸入型動(dòng)物皮屑和鳥(niǎo)羽絨類(lèi)蛋白提取液采集的皮屑和剪碎的羽絨用2倍以上苯、丙酮等溶劑浸泡L5小時(shí)，不斷振搖脫脂，倒掉溶劑、揮凈殘余溶劑后用5%(W/V)的0.125mol/lNH4HCO3緩沖液(pH8.3)4t:下提取20小時(shí)，不斷振搖，然后13000g4。C離心15分鐘，上清液過(guò)三層紗布過(guò)濾，濾液-2(TC下貯存。1.1.3吸入型花粉類(lèi)蛋白提取液采集的花粉過(guò)篩去除雜質(zhì)，加入3倍乙醚浸泡振搖脫脂2小時(shí)，棄去溶劑，揮凈殘余乙醚。取脫脂后的花粉lg在40ml0.125mol/lNH4HC03緩沖液(pH8.3)4。C下攪拌過(guò)夜(20小時(shí)以上)，然后15000g離心15分鐘除去不溶物。該提取上清液每5(Hil加入400nl冷甲醇，4。C靜置過(guò)夜沉淀蛋白，離心，N2氣下干燥后的沉淀溶于含SDS的緩沖鹽溶液(pH7.0)中，待用。1.1.4吸入型蟑螂類(lèi)蛋白提取液蟑螂放冰箱冷凍滅活，加入無(wú)水乙醇浸泡半小時(shí)、洗去蟲(chóng)體表面微生物后風(fēng)干，在粉碎機(jī)中以2400rpm打成粉末；加入3倍體積的乙醚+乙酸乙酯(1+1，V/V)浸泡振搖脫脂2小時(shí)，棄去帶脂溶劑，殘余乙醚揮干后，30g粉末加入200ml含6mmol/l卩-巰基乙醇和1/1000體積的蛋白酶抑制劑的PBS(pH7.4)溶液，緩緩攪拌4'C下過(guò)夜，且每毫升加入lmg的1-苯基-3-(2-硫腙基)-2-硫脲防止溶液黑褐化；然后將提取液在4"C下以10000g離心30分鐘，上清液過(guò)0.45nm濾膜后-20'C下貯存。1.1.5吸入型霉菌類(lèi)蛋白提取液干燥的霉菌塊狀固體，用高速種籽粉碎機(jī)打成粉末，過(guò)4號(hào)篩；取適量粉末加入3倍體積的乙醚浸泡振搖2小時(shí)，棄去乙醚并將樣品中殘余乙醚揮盡，再加入2倍體積的甲醇浸泡振搖1小時(shí)，離心除去甲醇，N2氣下干燥；5g菌粉中加入100ml含2mmo1/1EDTA和8mmo1/1的P-巰基乙醇的PBS溶液4'C下攪拌提取過(guò)夜，然后15000g4-C離心30分鐘，上清液-2(TC下貯存。1.2過(guò)敏原蛋白的提取過(guò)敏原蛋白的粗提取液需經(jīng)透析、SDS-PAGE電泳免疫印跡確認(rèn)、割膠、離心提取的較純的過(guò)敏原蛋白組分。(1)將浸提液在透析袋(MWCO10000)中對(duì)10mmol/LPBS(pH7.2)透析48小時(shí)，期間緩緩攪動(dòng)PBS溶液，并更換PBS液4次；(2)透析后的過(guò)敏原蛋白溶液過(guò)0.45pm濾膜，并稀釋成4mg/ml的蛋白溶液；(3)過(guò)敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的膠柱，電泳分離；在分子量10-100kD的區(qū)域用病人陽(yáng)性血清在一個(gè)電泳膠柱進(jìn)行免疫印跡，顯色；(4)切割下其余膠柱過(guò)敏原蛋白定位的相應(yīng)條帶，加入適量PBS溶液后，室溫2000g離心IO分鐘；(5)測(cè)出過(guò)敏原蛋白溶液的濃度，加入適量防腐劑，-20°(:下冷凍貯存。2.膠體金標(biāo)記抗體的制備2.1膠體金制備膠體金的制備多采用還原法。氯金酸(HAuCU)是主要被還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類(lèi)型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下a.將HAuCl4先配制成0.01X水溶液，取100ml加熱至沸；b.攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1%檸檬酸三鈉(Na3C6H507'2H20)水溶液；c.繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約23min;冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法可制備16147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。2.2膠體金標(biāo)記抗人IgE抗體用膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)，就是指蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面。膠體金表面帶有負(fù)電荷，能與蛋白質(zhì)的正電荷靜電吸引而形成牢固的結(jié)合。由于這種結(jié)合主要是物理作用，所以不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性的改變。標(biāo)記前，需確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)的比例和將pH值調(diào)節(jié)到標(biāo)記蛋白質(zhì)IgG的等電點(diǎn)或略高(pH8.2)。標(biāo)記時(shí)，將待標(biāo)記抗人IgE抗體lmg加15ml膠體金溶液(IOD)，混合，室溫?cái)嚢?5分鐘，在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，混合5分鐘，離心，再通過(guò)離心法或凝膠層析法純化標(biāo)記的抗人IgE抗體。放在4'C達(dá)2年半仍然保持良好性能。3.用過(guò)敏原蛋白固化硝酸纖維膜條3.1材料和儀器(1)活化處理過(guò)的硝酸纖維素膜(Millipore，MDI，S&S，whatman等國(guó)外公司的硝酸纖維素膜)，能與蛋白質(zhì)分子中的氨基基團(tuán)反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。(2)過(guò)敏原蛋白；(3)0.05mol/LTris—HC1緩沖液(pH8.0)或活化增強(qiáng)劑；(4)0.01mol/LPBS溶液；(5)3。/。BSA封閉液；(6)納米芯片噴點(diǎn)系統(tǒng)；(7)金屬箔袋及真空封口機(jī)等。3.2步驟(1)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維素膜條制備采用Millipore，MDI，S&S，whatman中等流速的硝酸纖維素濾膜。試劑墊、樣本墊、吸收墊采用Millipore公司產(chǎn)品，與玻片相比，膜的優(yōu)點(diǎn)是與蛋白親和力強(qiáng)，檢測(cè)技術(shù)成熟，通常無(wú)需另外修飾。硝酸纖維素膜、尼龍膜、PvDF膜等都是帶有微孔的濾膜，其孔徑一般在0.45pm左右，在顯微鏡下這種膜就是一個(gè)立體的纖維網(wǎng)絡(luò)，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)探針，使檢測(cè)更加靈敏。同時(shí)，這種多孔結(jié)構(gòu)可使液體在其中進(jìn)行自由擴(kuò)散，當(dāng)在膜的一端給以液體擴(kuò)散壓力時(shí)，液體將沿一定方向擴(kuò)散，是層析的良好材料，是制作層析過(guò)敏原蛋白的非常理想的載體。(2)點(diǎn)樣具體采用0.05mol/L碳酸緩沖液，pH9.6或根據(jù)過(guò)敏原蛋白的特性選擇的緩沖液適當(dāng)稀釋過(guò)敏原蛋白溶液成0.05pg/ml-l(nig/ml的濃度。稀釋后將過(guò)敏原蛋白(100pl)加到噴樣儲(chǔ)液瓶?jī)?nèi)，應(yīng)用微量連續(xù)型點(diǎn)膜機(jī)(如BIO-DOT公司的產(chǎn)品)，將變應(yīng)原溶液噴線于膜的相應(yīng)的位點(diǎn)非接觸式連續(xù)點(diǎn)樣，即噴點(diǎn)，每次點(diǎn)樣lpl，連續(xù)3次；噴點(diǎn)后的硝酸纖維素膜放置2—8t:下反應(yīng)過(guò)夜。用3%BSA封閉液，37°C下保溫2小時(shí)。層析膜條一般25—30mm長(zhǎng)，可以噴線2—10條線或噴點(diǎn)2—30點(diǎn)，(3)固化人IgE陽(yáng)性的質(zhì)控區(qū)；a.材料人IgE抗體來(lái)源于人血漿中經(jīng)親和色譜純化，純度>95%的人IgE抗體(購(gòu)自美國(guó)Biodesign公司)。b.步驟用樣品稀釋液將人IgE抗體配制成濃度為50IU/ml，在過(guò)敏原蛋白硝酸纖維素膜條上端固化人IgE抗體即為陽(yáng)性質(zhì)控區(qū)。4.將過(guò)敏原蛋白固化硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中采用切割機(jī)將固化好的過(guò)敏原蛋白硝酸纖維素膜條切成所需的規(guī)格和形狀，放入相應(yīng)的多通道加樣槽中，再加入干燥劑裝入金屬箔袋內(nèi)密封，在2—8"C下貯存。多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒具有20塊多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑板，每塊試劑板如圖1所示，圖中1為樣品加樣窗，2為過(guò)敏原蛋白固化的硝酸纖維膜條，3為加樣槽微流通道，4為吸水墊出口窗。5.配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2°/。胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6.分級(jí)比色卡制作根據(jù)國(guó)際上特異性IgE抗體濃度和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，印制分級(jí)比色卡。本發(fā)明的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒的使用方法l.檢測(cè)步驟(1)將所有試劑平衡至室溫(20^25°C)。(2)測(cè)定時(shí)用加樣吸管向檢測(cè)板上標(biāo)本孔內(nèi)加入23滴血清(若使用定量加樣器，每孔加10015(HU血清)，血清標(biāo)本遷移至質(zhì)控區(qū)指示線時(shí)加入緩沖液1滴。(3)20—30分鐘觀察結(jié)果。2.結(jié)果判斷a.目測(cè):(1)陽(yáng)性結(jié)果在檢測(cè)板上質(zhì)控區(qū)和相應(yīng)的過(guò)敏原平行處的檢測(cè)線出現(xiàn)紅色反應(yīng)帶。(2)陰性僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶(3)無(wú)效質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紅色條帶b.使用分級(jí)比色卡可半定量分級(jí)判斷陽(yáng)性結(jié)果呈陽(yáng)性的指標(biāo)應(yīng)與分級(jí)比色卡級(jí)別應(yīng)基本一致，其分級(jí)結(jié)果只允許在相鄰兩個(gè)級(jí)別間變化。國(guó)際上過(guò)敏原特異性IgE濃度的分級(jí)方法國(guó)際分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)_過(guò)敏程度分級(jí)分級(jí)IgE濃度_0級(jí)<0.35IU/ml陰性1級(jí)0.35—0.70IU/ml弱陽(yáng)性2級(jí)0.71—3.50IU/ml陽(yáng)性實(shí)施例2篩查型多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒中共同固化過(guò)敏原蛋白的選擇在分子水平上通過(guò)細(xì)胞結(jié)合IgE反應(yīng)性的蛋白質(zhì)的IgE結(jié)合抗原決定簇的識(shí)別來(lái)推測(cè)蛋白質(zhì)的過(guò)敏反應(yīng)性。美國(guó)過(guò)敏、哮喘和免疫學(xué)學(xué)會(huì)(theAmericanAcademyofAllergy,AsthmaandImmunology(AAAAI))禾口美國(guó)過(guò)敏、哮喘禾口免疫學(xué)學(xué)院(theAmericancollegeofAllergy,AsthmaandImmunology(ACAAI))聯(lián)合接受的文件"食物過(guò)敏實(shí)用參數(shù)(Foodallergy:apracticeparameter)"中認(rèn)為，蛋白質(zhì)促發(fā)過(guò)敏反應(yīng)是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)存在的功能氨基酸序列，包括線性序列上或構(gòu)象上能與B細(xì)胞上特定的受體蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)，即抗原決定簇。如果兩種蛋白質(zhì)或多肽均含有的一個(gè)或幾個(gè)主要過(guò)敏原蛋白的氨基酸序列的等同性達(dá)70%或兩個(gè)蛋白質(zhì)或多肽共享8個(gè)或8個(gè)以上連續(xù)相同的氨基酸序列，就可認(rèn)為該兩個(gè)蛋白質(zhì)或多肽存在著相同過(guò)敏癥狀的抗原決定簇(ChapmanJAetal，2006，F(xiàn)oodallergy:apracticeparameter,AnnAllergyAsthmaImmunol,96:Sl-S68)。依據(jù)這一原則，從互聯(lián)網(wǎng)上的大型數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI、0.51—17.5IU/ml50.01—100IU/ml17.51—50.0IU/ml較強(qiáng)陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性特強(qiáng)陽(yáng)性超強(qiáng)陽(yáng)性PubMed、EBI或文獻(xiàn)中檢索比對(duì)同類(lèi)型致敏材料的主要過(guò)敏原蛋白的氨基酸序列，將符合該原則的材料的過(guò)敏原蛋白等量混合，共同固化在硝酸纖維素膜條的同一位點(diǎn)表面。將它們的過(guò)敏原蛋白共同固化在硝酸纖維素膜條的同一位點(diǎn)表面o普遍存在的吸入型過(guò)敏物質(zhì)螨蟲(chóng)，世界上主要有三種類(lèi)型Dermatophagoidespteronyssinus、Dermatophagoidesfarinae禾口Euroglyphusmaynei。從它們所含的過(guò)敏原蛋白的蛋白組學(xué)分子研究可知，主要過(guò)敏原蛋白Derpl、Derfl、Eurml及Derp2、Derf2、Eurm2的氨基酸序列有84-86%的等同性(見(jiàn)圖2，圖3)，將三種螨蟲(chóng)過(guò)敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纖維素膜條的同一位點(diǎn)表面，篩選螨蟲(chóng)致敏。吸入型過(guò)敏物質(zhì)花粉中也有很多符合該原理的例子，如藜科植物花粉的過(guò)敏原蛋白的Chea2與梯牧草花粉過(guò)敏原蛋白phlpll，橄欖及樺樹(shù)花粉過(guò)敏原蛋白的01ee2Betv2的氨基酸序列的等同性也達(dá)70%以上(圖4)。將Chea2與梯牧草花粉過(guò)敏原蛋白phlpll;橄欖及樺樹(shù)花粉過(guò)敏原蛋白的01ee2Betv2過(guò)敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纖維素膜條的同一位點(diǎn)表面。實(shí)施例3用多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑試驗(yàn)對(duì)103例過(guò)敏患者(2—18歲的30人，18—70歲的43人)，抽取血液制備血清定性篩査(屋塵螨、粉塵螨、貓毛、狗毛、樺樹(shù)、梧桐、艾蒿、豚草)過(guò)敏原。按上述多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒的使用方法測(cè)出患者血清在不同過(guò)敏原特異性IgE濃度，根據(jù)分級(jí)比色卡判斷為陽(yáng)性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如下表皮炎患者中致敏環(huán)境篩查結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>檢測(cè)結(jié)果表明，采用本發(fā)明的試劑盒能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出致敏過(guò)敏原，靈敏度達(dá)91.0%，特異性達(dá)83.0%，準(zhǔn)確性85.0%。權(quán)利要求1、多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒組成包括已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)、動(dòng)物皮屑類(lèi)、鳥(niǎo)羽絨類(lèi)、花粉類(lèi)、蟑螂類(lèi)、霉菌類(lèi)過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標(biāo)記的抗體，緩沖液，分級(jí)比色卡；其中已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括屋塵螨、粉塵螨；已固化的吸入型動(dòng)物皮屑類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括貓、狗、馬、牛、羊；已固化的吸入型鳥(niǎo)羽絨類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括雞、鴨、鵝、鴿；已固化的吸入型花粉類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括樺樹(shù)、楓樹(shù)、榿樹(shù)、構(gòu)樹(shù)、棕櫚、葵樹(shù)、榛樹(shù)、柏樹(shù)、松樹(shù)、杉木、栗樹(shù)、櫟樹(shù)、梧桐、楊樹(shù)、柳樹(shù)、桑樹(shù)、榆樹(shù)、艾蒿、豚草、藜草、車(chē)前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、蘆葦、葎草、蒼耳、香蒲、莎車(chē)、芨芨草、向日葵；已固化的吸入型蟑螂類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條片包括德國(guó)小蠊、美洲大蠊；已固化的吸入型霉菌類(lèi)過(guò)敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括點(diǎn)青霉菌、多主枝孢霉菌、煙曲霉菌、交鏈孢霉菌、黑根霉菌、釀酒酵母菌、小麥黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；膠體金標(biāo)記的抗體膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體；緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2％胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5％Tween-20和20mg/L慶大霉素；比色卡根據(jù)國(guó)際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，制作的分級(jí)比色卡。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于固化的吸入型過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條置于多通道加樣槽中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)過(guò)敏原蛋白的制備將含過(guò)敏原蛋白的材料經(jīng)粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；2)膠體金標(biāo)記抗體的制備用膠體金標(biāo)記的抗人IgE抗體；3)用過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體固化硝酸纖維膜條，構(gòu)成測(cè)試線和質(zhì)控區(qū)，并封閉；4)將固化處理過(guò)的硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中；5)配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清，0.15mol/LNacl,0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6)根據(jù)國(guó)際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，制作分級(jí)比色卡。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了多通道吸入型過(guò)敏原快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法，試劑盒組成包括已固化的吸入型螨蟲(chóng)類(lèi)、動(dòng)物皮屑類(lèi)、鳥(niǎo)羽絨類(lèi)、花粉類(lèi)、蟑螂類(lèi)、霉菌類(lèi)環(huán)境過(guò)敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標(biāo)記抗人IgE抗體、緩沖液和分級(jí)比色卡。采用該試劑盒，目測(cè)可定性判斷結(jié)果，使用比色卡可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分級(jí)，臨床檢測(cè)中可以一次加樣，每一個(gè)通道可快速檢測(cè)10-20種過(guò)敏原，多個(gè)通道可同時(shí)檢測(cè)30-60種不同的過(guò)敏原，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為體外輔助診斷確定使患者致敏的過(guò)敏原及過(guò)敏反應(yīng)程度提供了有效的手段。文檔編號(hào)G01N33/558GK101393215SQ20081012229公開(kāi)日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者吳善東申請(qǐng)人:杭州浙大生物基因工程有限公司