一步快速檢測(cè)甜瓜多種病毒的試劑盒及其快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種快速檢測(cè)甜瓜病毒病的試劑盒及其快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜瓜病毒病一直是限制甜瓜生產(chǎn)的主要因素，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有一種有效的方法可 W防治甜瓜病毒病。病毒病在瓜產(chǎn)區(qū)復(fù)合感病的情況比較普遍。目前檢測(cè)甜瓜病毒病病毒 種類的方法有雙抗體夾屯、法（DAS-ELISA)和硝酸纖維素膜法（NCM-ELISA)法、血清抗原檢 測(cè)等方法；但運(yùn)些方法操作復(fù)雜、費(fèi)用高、需要時(shí)間較長(zhǎng)。
[0003] 多重RT-PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)幾種致病菌，大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間和流程，節(jié)省了供 試材料，尤其適合一些難分離，難獲取的種質(zhì)材料或病源分離物的快速檢測(cè)。但是，由于多 重RT-PCR體系中存在多對(duì)引物，因此各引物對(duì)必須保持高度的特異性（W避免非特異性的 擴(kuò)增）；而且各對(duì)引物所擴(kuò)增出的目的片段的大小差異性要大，可W通過(guò)電泳或其他方法 區(qū)分（避免條帶重疊或誤判）；還要避免所用引物間的相互作用；各引物對(duì)須保持相對(duì)一致 的擴(kuò)增效率等要求。并且，不同長(zhǎng)度的模板核酸片段、不同引物對(duì)所要求的退火溫度也不一 樣。加之其他限制因素，多重RT-PCR技術(shù)難W在甜瓜病毒病的實(shí)際檢測(cè)中有優(yōu)異的表現(xiàn)， 可同時(shí)檢測(cè)的甜瓜病毒病種類極少。引物對(duì)越多擴(kuò)增難度就越大，因此，目前所知植物病毒 多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)最多只能一次同時(shí)檢測(cè)5種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有甜瓜病毒病多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)的甜瓜病毒 病種類少的問(wèn)題，而提供的一種一步快速檢測(cè)甜瓜多種病毒的試劑盒及其快速檢測(cè)方法。 陽(yáng)0化]一步快速檢測(cè)甜瓜多種病毒的試劑盒中含有7對(duì)RT-PCR引物；
[0006] 用于擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物WMV1F的核巧酸 序列為5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列為 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3'; W07] 用于擴(kuò)增黃瓜花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物CMV1F的核巧酸序列為 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列為 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ； W08] 用于擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列為5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列為 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ;
[0009] 用于擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對(duì)：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列為5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列為 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3> ;
[0010] 用于擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物TMV-F的核巧酸序列為 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列為 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； W11] 用于擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對(duì)：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列為5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列為 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3'; 陽(yáng)01引用于擴(kuò)增甜瓜黃斑病毒的引物對(duì)：上游引物MYSVF的核巧酸序 列為5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列為 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3'。
[0013] 用上述一步快速檢測(cè)甜瓜多種病毒的試劑盒快速檢測(cè)的方法：
[0014] 一、提取被感染病毒葉片的總RNA; 陽(yáng)〇1引二、反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0016] Ξ、用試劑盒中的7對(duì)RT-PCR引物進(jìn)行多重RT-PCR，即可確定葉片是否感染了西 瓜花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西葫蘆黃花葉病毒病、南瓜花葉病毒、煙草花葉病毒病、 番木瓜環(huán)斑病毒和甜瓜黃斑病毒，W及病毒類型； 陽(yáng)017] 步驟Ξ中7對(duì)RT-PCR引物為用于擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物WMV1 F的核巧酸序列為5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列為 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3';
[001引用于擴(kuò)增黃瓜花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物CMV1F的核巧酸序列為 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列為 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ；
[0019] 用于擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列為5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列為 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ;
[0020] 用于擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對(duì)：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列為5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列為 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3>; W21] 用于擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對(duì)：上游引物TMV-F的核巧酸序列為 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列為 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； 陽(yáng)02引用于擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對(duì)：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列為5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列為 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3';
[002引用于擴(kuò)增甜瓜黃斑病毒的引物對(duì)：上游引物MYSVF的核巧酸序 列為5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列為 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3' ；
[0024] 步驟Ξ多重RT-PCR擴(kuò)增體系為25化，包括2μL的模板cDNA、2μL的引物對(duì)、濃 度為1.Ommol/L的dNTPs、酶活為1U的TaqDNA聚合酶和濃度為2.Ommol/L的Mg2+; 陽(yáng)0巧]步驟Ξ多重RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性40s、50°C退火復(fù)性353、72°(：延伸6〇3,35個(gè)循環(huán)；72°(：延伸7111111。
[0026] 西瓜花葉病毒?。╓MV)、黃瓜花葉病毒病化州mbermosaicviroicKCMV)、小西葫 蘆黃花葉病毒病狂YMV)、南瓜花葉病毒（SqMV)、煙草花葉病毒病燈MV)、番木瓜環(huán)斑病毒 (PRSV)和甜瓜黃斑病毒（MYSV)是甜瓜病毒病中常見(jiàn)的種類，而且在我國(guó)感染、發(fā)病率高。
[0027] 本發(fā)明一步快速檢測(cè)甜瓜多種病毒的試劑盒針對(duì)西瓜花葉病毒?。╓MV)、黃瓜花 葉病毒病化州mbermosaicviroid(CMV)、小西葫蘆黃花葉病毒病狂YMV)、南瓜花葉病毒 (SqMV)、煙草花葉病毒病燈MV)、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV)和甜瓜黃斑病毒（MYSV)設(shè)計(jì)了 7 對(duì)特異性引物。擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為1149bp，擴(kuò) 增黃瓜花葉病毒病的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為98化P，擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病 毒病的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為789bp，擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對(duì)所擴(kuò)增出 的核巧酸片段長(zhǎng)度為604bp，擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為 39化P，擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為3(K)bp，擴(kuò)增甜瓜黃斑 病毒的引物對(duì)所擴(kuò)增出的核巧酸片段長(zhǎng)度為25化P。7對(duì)特異性引物擴(kuò)增出的核巧酸片段 長(zhǎng)度迴異，長(zhǎng)度相近片段的最小差異為50bp，在凝膠電泳的過(guò)程中可W清楚地區(qū)分?jǐn)U增到 的核巧酸條帶。
[0028] 本發(fā)明通過(guò)一次PCR可W同時(shí)檢測(cè)出多達(dá)7種的甜瓜病毒病，可在田間采集、鑒定 甜瓜病毒病種類，具有鑒定過(guò)程簡(jiǎn)單、步驟少、設(shè)備要求低、費(fèi)用少、時(shí)間短和精確性高等優(yōu) 點(diǎn)。
[0029] 本發(fā)明檢測(cè)方法在甜瓜產(chǎn)區(qū)復(fù)合感染病毒的檢測(cè)中及甜瓜病毒病的發(fā)生規(guī)律研 究中，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、靈明度高，簡(jiǎn)便與效率高的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道中A標(biāo)樣為健康植株，圖中泳道CK 中標(biāo)樣為陰性對(duì)照，圖中泳道1~4中標(biāo)樣均為被7種甜瓜病毒病侵染的植株。
[0031] 圖2是實(shí)施例2檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道中A標(biāo)樣為健康植株，圖中泳道 1~7中標(biāo)樣依次為被西瓜花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西葫蘆黃花葉病毒病、南瓜花 葉病毒、煙草花葉病毒病、番木瓜環(huán)斑病毒和甜瓜黃斑病毒侵染的植株。
[0032] 圖3是實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖。
[0033] 圖4是實(shí)施例4檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò)增體 系中模板cDNA的體積依此為 0. 5μ^0. 75μ^1μ^Ι. 25μ^1. 5μ^1. 75μΙ和 2yL。
[0034] 圖5是實(shí)施例5檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò) 增體系中Mg2+的濃度依此為 1. 0mmol/L、l. 5mmol/L、2. 0mmol/L、2. 5mmol/L、3.Ommol/L、 3.5mmol/L和 4.Ommol/L。
[0035] 圖6是實(shí)施例6檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò) 增體系中dNTP的濃度依此為 0. 2mmol/X、0. 4mmo1 /1,.0. 6mmol/X、0.8mmol/1,、1.Ommol/L 1.2mmol/L和 1. 4mmol/L。
[0036] 圖7是實(shí)施例7檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中用于擴(kuò)增西瓜花葉 病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西