一類二硫橋二酮哌嗪類化合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及用一株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生 物研究所，100101保藏編號：CGMCC9429保藏日期：2014年7月9日）生產(chǎn)含二硫橋二酮 哌嗪類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在抗腫瘤方面的用途。
【背景技術(shù)】：
[0002] 本發(fā)明人從菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏編號是：CGMCC9429)液 體發(fā)酵產(chǎn)物中分離出一類含二硫橋二酮哌嗪類化合物。研究發(fā)現(xiàn)所示化合物具有抗腫瘤活 性，目前尚未見該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有 與此有關(guān)的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0003] 本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)新穎的具有高抗腫瘤活性的新化合物。其結(jié)構(gòu)式是
[0004]
[0005] 本發(fā)明的式I和II化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取含有該類化合物的發(fā)酵 物，然后從發(fā)酵物中采用S印hadexLH20凝膠柱層析，中壓MPLC，半制備HPLC等方法分離 純化得到。本發(fā)明的下述實(shí)施例中列舉了利用青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏編號 是：CGMCC9429)制備本發(fā)明式I和II化合物的實(shí)例。
【具體實(shí)施方式】：
[0006] 在如下的實(shí)施例中所指的化合物I和II的化學(xué)結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是 化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位）是：
[0007]
[0008]
[0009] 實(shí)施例1化合物I和II的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
[0010] 1發(fā)酵生產(chǎn)
[0011] 生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取菌株青霉Penicillium sp.HDN13-309 (保藏編號是：CGMCC9426)適量，接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏 度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
[0012] 取斜面培養(yǎng)5天的菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309適量，接種到裝有300mL 培養(yǎng)基[培養(yǎng)基組成（克/升）：麥芽糖20. 0,葡萄糖10. 0,甘露醇20. 0,味精10. 0,酵母 膏3.0，玉米漿1.0，腿2?040 . 5，]\%504.71120 0.3，口11調(diào)節(jié)至6.5]的 10001^錐型瓶中，在28 攝氏度條件下靜置培養(yǎng)30天，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。
[0013] 2浸膏的獲得
[0014] 用紗布將發(fā)酵液和菌絲體分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至無丙酮，所 得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。發(fā)酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相， 減壓濃縮，得粗浸膏，共8克。
[0015] 3化合物的分離精制
[0016] 浸膏（8克）用甲醇溶解后，以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑進(jìn)行正相硅膠分離，分為 6個組分，然后組分4以甲醇為溶劑進(jìn)行LH20柱層析，分為5個流份。組分5先以C-180DS 中壓柱層析，以甲醇-水為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，最后經(jīng)反相半制備高效液相色譜（甲醇：水 =55 : 45)得化合物I(10mg)和II(4mg)。
[0017]化合物I白色固體，分子式C19H16N205S2,HR-ESI-MSm/z:417. 0582[M+H]+，計(jì)算值 417. 0573。IR(KBr)vnax 3512,1661，1625,1606,1426,1384,1098,1030, 709,670,652cmi。4 和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。
[0018]化合物II白色固體，分子式C19H16N206S2,HR-ESI-MSm/z:433. 0535 [M+H]+，計(jì)算值 433. 0523。IR(KBr)vnax 3520,1667,1630,1601，1438,1383,1095,1035, 709,677,655cmmi。 蟲和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1
[0019]表 1 化合物I(inCD30D)和II(ind6-DMS0)的1H和13CNMR數(shù)據(jù)（500 和 125MHz) a
[0020]
[0021] a)本表信號歸屬基于DEPT、HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用 DEPT方法確定并分別用s(單重峰）、d(二重峰）、t(三重峰）和q(四重峰）表示。
[0022] 實(shí)施例2化合物的抗腫瘤活性測試
[0023] 1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法
[0024] 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實(shí)施例1中分離精制的化合物I和II純品。 精密稱取適量樣品，用DMS0配制成所需濃度的溶液，供測活性。
[0025] SRB法：取對數(shù)生長期的Hela、HCT116、H0-8910和MGC803細(xì)胞用新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2X105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200微升接種于 96孔板中，每孔加入2yL不同濃度的樣品或空白溶液，37°C下培養(yǎng)72小時。取藥物作用下 培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細(xì)胞周期 抑制，細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征。每孔細(xì)胞中加入80 %三氯醋酸50yL，置于4°C 固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0. 4%SRB的醋酸溶液50yL并在室溫靜 置30分鐘。用1 %醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150yLTris 緩沖液（10mm〇l/L，pH10. 5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶 標(biāo)儀測定每孔在520nm處的光密度（0D)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三 孔，另設(shè)三孔空白對照和無細(xì)胞調(diào)零孔（如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零）。 各孔0D值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取三孔平均0D值按IR% = (0D空自對-0D樣) /0D空白對 X100%式計(jì)算每個濃度下的細(xì)胞增殖抑制率（IR% )，并采用bliss法計(jì)算出半數(shù)抑制 率IC50。
[0026] MTT法：取對數(shù)生長期的HL-60和K562腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升2X105 個細(xì)胞，按每孔200yL加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C通入5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。 樣品分別設(shè)定5個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個平行樣，同時設(shè)陽性、陰性對照，每孔加樣品液 或空白液各2yL，培養(yǎng)72h，然后每孔加MTT液10yL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37°C、2000轉(zhuǎn)/分 鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100yL，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶 完全溶解后，酶標(biāo)儀測定每孔570nm處的吸光值（0D值）。取三孔平均0D值按IR% = (0D 空白對照-0D樣品）/0D空白對照X100%式計(jì)算樣品對細(xì)胞增殖的抑制率（IR% )，并采用bliss法 計(jì)算出半數(shù)抑制率IC5。。
[0027] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0028] 表2化合物I和II對多種腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性
[0029]
[0030] 3 結(jié)論
[0031] 化合物I和II具有較好的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細(xì)胞模型均有抑制活性，這為 開發(fā)新型抗癌藥提供了化合物基礎(chǔ)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 化合物結(jié)構(gòu)如下式所示化合物IR=H化合物IIR=OH2. 權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)青霉Penici11ium sp.HDN13-309(保藏編號是：CGMCC9429)獲取含有上述化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中 分離純化出該類化合物。3. 權(quán)利要求2所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)SephadexLH20凝膠柱層析，甲醇 為溶劑，再經(jīng)反相中壓MPLC及反相半制備HPLC分離純化得該類化合物。4. 權(quán)利要求1所述化合物在抗腫瘤方面的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類二硫橋二酮哌嗪類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明從菌株青霉Penicillium？sp.HDN13-309中生產(chǎn)出一類新的二硫橋二酮哌嗪類化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。CGMCC No.942920140709
【IPC分類】A61P35/00, C12R1/80, C07D513/20, C12P17/18
【公開號】CN105037396
【申請?zhí)枴緾N201510063693
【發(fā)明人】李德海, 朱美林, 顧謙群, 朱天驕, 李靜, 車茜
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年2月5日