PBST洗滌3次后，紅外成像儀采集圖像分析。
[0036] 含有⑶40L的漢坦病毒樣顆粒的免疫學特性研宄： 將48只C57BL/6小鼠隨機分為4組，每組12只。按下表1所示的分組及劑量，采用皮 下注射方式進行免疫，14 d后加強免疫一次，28 d后再加強免疫一次，共免疫3次，各組的 免疫劑量如表1所示。⑶40L+VLP表示以重組鼠⑶40L與漢坦病毒VLP聯(lián)合免疫。
1、體液免疫反應檢測： (1)小鼠血清中特異性抗體的檢測：將經(jīng)純化的HTNV GP和NP全長肽稀釋至0. 15 μ g/ ml，分別包被96孔聚苯乙烯微板，4 °C過夜，PBST洗滌三次后加入含1% BSA的PBS緩沖液， 37 °C孵育I h。PBST洗滌三次，加入倍比稀釋的各組小鼠血清和正常小鼠血清，37 °C孵 育I h。PBST洗滌三次，加入1:1000稀釋的HRP標記羊抗小鼠 IgG，37 ° C孵育I h。PBST 洗滌三次，拍干后加入TMB顯示液，室溫避光靜置20 min后加入2 M H2SOjS止反應，多功 能酶標儀讀取450 nm吸光度值。以正常小鼠血清檢測結果為陰性，實驗組小鼠血清檢測數(shù) 值與陰性比值大于2. 1判定結果為陽性。
[0038] (2)小鼠血清中中和抗體檢測：前一日將Vero E6細胞以胰蛋白酶消化，1000 rpm 離心5 min，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調整濃度至I X IO5個/ml，加入96孔 細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。將各組小鼠血清用〇. 22ym濾器過濾除菌，加 RPMI-1640按 1:80、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 稀釋，與 100 TCID50 的 HTNV 病毒 1:1 體積混合， 37 °C，CO2培養(yǎng)箱中孵育I h。將96孔板中培養(yǎng)液棄去，PBS洗2次，將病毒與血清混合液 依次加入孔板，每個樣品加4個復孔，每孔200 μ 1，同時設置不加病毒的孔。將3G1 mAb按 相同方法稀釋后與100 TCID50的HTNV病毒1:1混合，孵育后加入孔板作為對照。37 °C， CO2培養(yǎng)箱孵育12 d后將孔板室溫/-80 ° C反復凍融3次，1000 rpm離心10 min后吸出 孔板中上清待用。
[0039] 1A8 mAb包被96孔聚苯乙烯微板，4 °C過夜。PBST洗滌三次，加入上述上清，37°C 孵育I h。PBST洗滌三次，加入1:400稀釋的HRP-1A8, 37° C孵育I h。PBST洗滌三次，拍 干后加入TMB顯色液，室溫避光靜置20 min，多功能酶標儀讀取450 nm吸光度值，以正常細 胞孔檢測值為陰性，實驗孔讀值與陰性比值小于2. 1認為病毒被中和，4個復孔中有三個或 全部四個孔比值小于2. 1則認為該稀釋比例的血清有中和作用。
[0040] 2、細胞免疫反應檢測： (1)小鼠脾細胞細胞因子分泌水平的檢測：處死小鼠，75%酒精浸泡3 min后，置于超凈 工作臺內剪開小鼠腹部皮膚和腹膜，取出脾臟，200目篩網(wǎng)研磨后加2 ml紅細胞裂解液，室 溫靜置2 min，加含2% FBS的RPMI-1640并輕柔混勻，室溫靜置5 min終止裂解，1000 rpm 離心5 min，棄去上清并加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞重懸，置37°C，C02細胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前一日將ELISP0T孔板按照說明書要求預處理并包被IL-2、IL-4、IL-10抗 體（IFN-γ檢測試劑盒提供預包被板)，4 °C過夜。棄去孔板中液體，PBS洗滌5次，加入含 10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液4 °C封閉6 h。將各組小鼠脾細胞分為三部分，用含5% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液調整濃度至2 X IO7個/ml，分別加入ELISP0T孔板中，每孔50 μ 1，再 分別加入20 μ g/ml的Gn肽池、Gc肽池及NP肽池，每孔50 μ 1。同時設置加入相同濃度 ConA、只加入脾細胞、只加入培養(yǎng)液的孔作為對照，孔板置于37 °C C02培養(yǎng)箱孵育24 h。 棄去孔板中液體，PBS洗滌5次，分別加入試劑盒提供的生物素標記抗IFN- γ、IL-2、IL-10、 IL-4單克隆抗體，4 °C孵育過夜。棄去孔板中液體，PBS洗滌5次，加入試劑盒提供的HRP 標記抗生物素抗體，室溫靜置4 h。棄去孔板中液體，PBS洗滌5次，加入TMB顯色液，置于 37 °C恒溫箱，待孔板底部有斑點形成后，去離子水沖洗以終止反應。避光待孔板干燥后， ELISP0T檢測儀讀取每孔斑點數(shù)，計算斑點形成細胞數(shù)（Spot-forming cells，SFC)。
[0041] (2)免疫小鼠脾細胞CTL殺傷活性的檢測：將各組小鼠脾細胞分為三部分，分別加 入10 μ g/ml的GP肽池及NP肽池，并同時與25 U/ml的IL-2混合。37 °C 0)2細胞培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24 h，將各肽池刺激的小鼠脾細胞均稀釋成2 X IO7個/ml、I X 107個/ml、0. 5 X 107 個/ml、0. 25X IO7個/ml的濃度，作為殺傷實驗的效應細胞。將HTNV感染的小鼠腹腔巨噬 細胞胰蛋白酶消化，1000 rpm離心5 min，加含10% FBS的RPMI-1640重懸細胞，并調整濃 度至2X IO5個/ml，作為殺傷實驗的靶細胞。將各濃度的效應細胞和靶細胞1:1混合，形成 100:1、50:1、25:1、12. 5:1的效靶比。將效應細胞-靶細胞混合液加入到U底96孔細胞培 養(yǎng)板中，每孔100 μ 1。同時設置乳酸脫氫酶（LDH)孔作為陽性對照，靶細胞與裂解液混合 (靶細胞LDH最大釋放)、只加入效應細胞(效應細胞自發(fā)釋放LDH)、只加入靶細胞(靶細胞自 發(fā)釋放LDH)和只加入培養(yǎng)液的孔（陰性對照)，37 ° C CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。1000 rpm離 心孔板10 min，將上清轉移至新96孔微板中，加入試劑盒提供的底物，每孔50 μ 1，加入I M H2SOjS止反應。室溫避光靜置20 min，多功能酶標儀讀取490 nm吸光度值，按以下公式計 算殺傷效率：
3、疫苗對病毒感染動物的保護作用： 在第二次加強免疫后第14 d，以100LD50的HTNV病毒感染各組小鼠，每組感染4只， 腹腔注射，100 μL/只。注射后第3 d，頸脫白處死小鼠，取各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺 臟、腎臟及腦進行檢測。
[0042] (1)小鼠臟器組織中病毒抗原的檢測： 將小鼠各臟器組織加入RPMI-1640并充分研磨，室溫/-80°C反復凍融三次，10, 000 rpm 4 °C離心30 min，0.45 μm濾器過濾徹底去除組織碎塊后BCA法測定各組總蛋白濃 度，加 RPMI-1640統(tǒng)一稀釋成I mg/ml。采用2. 1. 5中ELISA方法檢測HTNV抗原。
[0043] (2)小鼠臟器中病毒核酸的檢測： HTNV S基因及小鼠 GAPDH引物序列如下：
取各組小鼠臟器加入液氮后研碎，加入組織總RNA提取試劑盒提供的裂解液，重復研 磨后按照試劑盒要求提取組織總RNA。以提取的總RNA為模板，使用RT-PCR試劑盒將其反 轉錄為cDNA。將獲得的cDNA分為兩部分，以HTNV Forward/Reverse為引物進行實時定量 PCR檢測HTNV特異性核酸，同時使用小鼠 GAPDH Forward/Reverse為引物進行實時定量PCR 檢測作為對照。
[0044] 本發(fā)明的內容不限于實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發(fā)明說明書 而對本發(fā)明技術方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 基于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能夠正確折疊、組裝和翻譯后修飾蛋白的特點，通過構建 真核表達載體，共轉染dhff CHO細胞，組裝含有⑶40L的漢坦病毒樣顆粒。2. 根據(jù)權利要求1所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 所述制備方法由以下步驟實現(xiàn)： 步驟一：載體構建： 將漢坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，構建S基因表 達載體； 將漢坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，⑶40L基因克 隆入SV40啟動子下，構建M基因和⑶40L基因的共表達載體； 步驟二：包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒的制備： 將步驟一得到的兩種載體各10 U g共轉染dhfr_ CHO細胞，于培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去 培養(yǎng)基，PBS洗滌三次后加入無血清篩選培養(yǎng)基，48 h后收集含有VLP的培養(yǎng)上清；離心去 除細胞碎片及大的蛋白聚集體后，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，低溫保存。3. 根據(jù)權利要求2所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 步驟二中，培養(yǎng)基為含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黃嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的頂DM 培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權利要求3所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 步驟二中，無血清篩選培養(yǎng)基為含500 nM MTX、800 y g/ml G418的Hycell培養(yǎng)基。5. 如權利要求4所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法制得的病毒樣顆粒。6. 如權利要求5所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒在制備腎綜合征出血熱預防疫苗 方面的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法和應用。對于多個蛋白組成的VLP，基于昆蟲細胞表達系統(tǒng)需要制備表達各個蛋白的桿狀病毒，再以不同的比例共同感染昆蟲細胞，需要大量工作摸索共感染比例，并且產品中混合的桿狀病毒為后期純化帶來一定的困難。本發(fā)明基于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，通過構建真核表達載體，共轉染dhfr- CHO細胞，組裝含有CD40L的漢坦病毒樣顆粒。本發(fā)明使病毒樣顆粒的各個組分均能表達，構建的真核表達載體上含有多個篩選標記，通過篩選可以建立穩(wěn)定表達病毒樣顆粒的細胞株，便于大規(guī)模生產和制備，可用于漢坦病毒感染引起的腎綜合征出血熱的預防。
【IPC分類】C12N7/04, C12N15/85, C12R1/93, A61K39/12, C12N15/40, A61P31/14
【公開號】CN104946605
【申請?zhí)枴緾N201510386204
【發(fā)明人】王芳, 吳興安, 張曉曉, 應旗康, 劉梓諭, 張芳琳, 程林峰, 于瀾, 張亮, 徐志凱
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月6日