一種基因工程改造的耐熱抗逆sod及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種耐熱超氧化物歧化酶及其編碼 基因與其在耐熱沖氧化物歧化酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase.簡(jiǎn)稱S0D)是美國(guó)科學(xué)家Mccord和 Fridovichl969從牛血紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種含有金屬離子的酶。該酶能專一的清除生物氧 化過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，是機(jī)體對(duì)抗自由基的第一道防線，在維護(hù)生物機(jī)體內(nèi) 自由基產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中起著極其重要的作用。基于結(jié)合金屬輔基的不同，可 以將SOD分為四大類：Cu/Zn-S0D、Mn_S0D、Fe-S0D和Ni-SOD。SOD具有抗炎，抗輻射，抗腫 瘤，抗衰老等作用，并用于病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和再灌流綜合癥、老年 性白內(nèi)障、心血管疾病、輻射病和癌癥的臨床治療；在食品工業(yè)中可添加作為保健食品的功 效因子；在化妝品中可添加用于防曬、抗氧化及防止皮膚衰老、防止瘢痕形成等。
[0003] 由于SOD的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了許多SOD產(chǎn)品，如含有SOD 的啤酒，水果，大米，口服液等等，產(chǎn)品加工中大多涉及加熱、有機(jī)提取等步驟，常溫SOD在 此過(guò)程有半衰期短，遇高溫、變性劑、有機(jī)溶劑易失活等不利因素。這不僅使含SOD的產(chǎn)品 開(kāi)發(fā)增加了困難，限制了產(chǎn)品的加工工藝，而且使含SOD的產(chǎn)品有效期大大縮短，迫使產(chǎn)品 的存儲(chǔ)、運(yùn)輸銷售周期變短，增大了經(jīng)營(yíng)困難。因此對(duì)天然SOD進(jìn)行修飾改造，增加其對(duì)高 溫、酸堿、有機(jī)溶劑、清潔劑、蛋白變性劑和抑制劑等的抗逆性就顯得十分必要。目前對(duì)SOD 的改造方法主要有基因工程方法、化學(xué)修飾、酶固定化以及研宄SOD模擬物。
[0004] 本發(fā)明涉及一種基因工程改造的耐熱抗逆SOD及其編碼基因。如SOD是來(lái)自嚴(yán)格 需氧極端嗜熱古生菌的一種天然嗜熱S0D,具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。利 用基因工程在其N端添加一段氨基酸序列，重組表達(dá)得到一種具有更強(qiáng)的耐高溫、酸堿、有 機(jī)溶劑、清潔劑、蛋白抑制劑和變性劑的高穩(wěn)定性S0D，有利于在保健食品、化妝品、啤酒飲 料等產(chǎn)品中的應(yīng)用，是理想的生化功能添加劑，具有廣闊市場(chǎng)和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的、耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明的超氧化物歧化酶S0D，名稱為r々7S0D，是具有下述氨基酸殘基序列之一 的蛋白質(zhì)： 1) 序列表中的SEQ ID NO. 1; 2) 將序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸的取代、缺失或添 加且具有平衡機(jī)體內(nèi)氧自由基作用的蛋白質(zhì)。
[0007] 序列表中的SEQ ID NO. 1由455個(gè)氨基酸殘基組成。
[0008] MDDQTLFAQYAAEVNEWGEQVKQVLELRGASIDGASTLLQFIAEHDGKWTEEAVRELTRLVDDVYAA ALRHYAIEAAEffGKQVEHALSMRGAAEDIGLSSLLARIEEHGDEffTEEEIHELQLLVDDVYARAIRLVEPLSDGQ EEDLTRQEEVSALPEQEGGNREQMSKGTERSGEHK⑶SEQEPVVAAERAEPFIASSTDSPDGEQLHEGDTMDEEW RHNADMTDKERLPEEGVTDGERQRAVSFKRYELPPLPYNYNALEPYIIEEIMKLHHQKHHNTYVKGANAALEKIE KHLKGEIQIDVRAVMRDFSFNYAGHIMHTIFWPNMAPPGKGGGTPGGRVADLIEKQFGGFEKFKALFSAAAKTVE GVGWGVLAFDPLTEELRILQVEKHNVLMTAGLVPILVIDVWEHAYYLQYKNDRGSYVENffffNVVNWDDVEKRLEQ ALNNAKPLYLLPQ 上述耐熱超氧化物歧化酶的編碼基因是具有下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID NO. 2的DNA序列； 2) 編碼序列中SEQ ID NO. 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 序列表中的SEQ ID NO. 2由1368個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5'端第1到第1268位 堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0009] 具體的堿基組成如下： ATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCCAGTATGCGGCTGAAGTGAACGAATGGGGAGAACAAGTCAAGCAGGT GCTGGAACTGCGCGGGGCAAGCATTGATGGCGCTTCTACACTGTTGCAGTTTATCGCCGAACATGACGGGAAGTGG ACGGAAGAGGCAGTCCGTGAGCTCACGCGCCTTGTTGATGACGTGTACGCTGCTGCGCTTCGTCACTATGCCATCGA AGCGGCTGAGTGGGGGAAACAAGTAGAACACGCTCTATCCATGCGCGGAGCAGCGGAGGACATCGGGCTTTCTTCTT TATTGGCGCGCATTGAAGAACACGGCGACGAGTGGACGGAGGAAGAAATTCATGAACTGCAACTCCTTGTCGACGAC GTGTACGCTCGAGCCATCCGCCTTGTCGAACCGCTATCCGACGGGCAGGAGGAAGACTTGACGCGGCAGGAAGAAGT CTCGGCTTTGCCTGAACAGGAGGGCGGCAACAGAGAGCAAATGAGCAAGGGAACTGAACGGTCAGGCGAACACAAGG GGGATAGCGAACAAGAGCCGGTCGTTGCAGCTGAACGGGCGGAGCCGTTCATAGCCTCATCAACGGATTCTCCTGAT GGCGAACAGCTGCATGAGGGAGATACGATGGACGAAGAATGGCGGCACAATGCAGACATGACAGATAAGGAGCGGCT GCCGGAGGAAGGTGTGACCGATGGTGAGCGGCAACGGGCGGTTTCGTTTAAGAGGTACGAGCTCCCCCCGCTACCCT ACAACTACAACGCCCTGGAGCCCTACATTATAGAGGAGATAATGAAGCTGCACCACCAGAAGCATCACAACACGTAT GTCAAAGGGGCTAACGCCGCACTCGAGAAGATAGAGAAGCATCTCAAGGGCGAGATACAGATAGACGTTAGGGCTGT CATGAGGGACTTCAGCTTCAACTACGCAGGCCACATAATGCACACCATATTCTGGCCCAACATGGCCCCGCCCGGCA AGGGCGGTGGAACACCTGGCGGCAGGGTGGCTGACCTCATAGAGAAGCAGTTCGGCGGCTTCGAGAAGTTCAAGGCC CTCTTCAGCGCCGCTGCGAAGACGGTGGAGGGCGTCGGGTGGGGCGTGCTCGCGTTCGACCCTCTGACAGAGGAGCT CAGGATACTGCAGGTGGAGAAGCACAACGTCCTCATGACGGCGGGCCTTGTGCCCATACTAGTTATTGACGTGTGGG AGCACGCCTACTACCTCCAGTACAAGAACGACAGGGGCAGCTACGTCGAGAACTGGTGGAACGTGGTCAACTGGGAC GACGTTGAGAAGAGGCTGGAGCAGGCTCTAAACAACGCGAAGCCCCTCTACCTGCTCCCCCAGTAG 含有本發(fā)明的表達(dá)載體及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 擴(kuò)增沖任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述耐熱超氧化物歧化酶的方法。
[0012] 本發(fā)明所提供的表達(dá)上述耐熱超氧化物歧化酶的方法，是構(gòu)建含有耐熱超氧化物 歧化酶基因的重組表達(dá)載體，將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使耐熱 超氧化物歧化酶基因表達(dá)。
[0013] 所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為 大腸桿菌。所述大腸桿菌可為凡cWiBL21 (DE3)。
[0014] 用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá) 載體，優(yōu)選為可表達(dá)His6-Tag結(jié)構(gòu)的pET-28a ( + )。
[0015] 用于基因工程改造的N端基因序列（Ν-/·々75·〇〇0來(lái)源于 ri/YcaflsNGSCd/^/ifo-soi/ (GTNG_2215)的 N 端 l_732bp 喊基。提取 efliiri/YcaflsNGSO-Z 基因組為模板， 以引物序列 5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC 和 5' CGTACCTCTTAAACGAAACCGCCCGT擴(kuò)增序列N-M^Oi/;天然嗜熱々?SOD基因序列來(lái)源于 Yamano et al，J Biochem 126:218-225,并由金唯智生物科技(北京）有限公司合成并 克隆到載體pET-28a ( + )。以含々7S0D基因序列的pET-28a ( + )為模板，以引物序列 5' ACGGGCGGTTTCGTTTAAGAGGTACG 和 5' CCCAAGCTTCTACT