免疫原性組合物及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年8月17日，申請(qǐng)?zhí)枮?01110242398. 6,發(fā)明名稱為"免 疫原性組合物及其用途"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明是關(guān)于制備經(jīng)純化EV71病毒抗原的方法。本發(fā)明亦相關(guān)于利用本發(fā)明的 經(jīng)純化EV71病毒以制備免疫原性組合物及其免疫方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 病毒感染引起各種病癥。舉例而言，腸病毒71 (Enterovirus 71/EV-71)為引起手 足口?。╤and，foot and mouth disease)的主要病原體之一，且與嚴(yán)重神經(jīng)疾病相關(guān)。由 于對(duì)宿主的EV71感染反應(yīng)的分子機(jī)制了解極少，所以尚無對(duì)抗EV71感染的有效抗病毒制 劑。故仍有需要發(fā)展有效對(duì)抗EV71感染的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明系關(guān)于對(duì)抗EV71感染的免疫原性組合物（例如疫苗）及相關(guān)方法。
[0005] 因此，本發(fā)明一方面的特征在于一種制備經(jīng)純化EV71病毒抗原的方法，該EV71病 毒抗原可用以制備對(duì)抗EV71感染的免疫原性組合物（例如疫苗）。該方法包括在培養(yǎng)基 中培養(yǎng)產(chǎn)生EV71病毒的細(xì)胞、自細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化EV71病毒（全粒子或次粒子），及使 經(jīng)純化的EV71病毒失活以獲得經(jīng)純化的EV71病毒抗原。培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基。純 化步驟可通過液相層析純化、蔗糖梯度超速離心純化或兩者來進(jìn)行。失活步驟可如下進(jìn)行： 在含有甲醛的溶液中在20-45°C下培養(yǎng)EV71病毒2至20天，例如在20-40°C下培養(yǎng)2至10 天，或在約37°C下培養(yǎng)2至5天。培養(yǎng)步驟可在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶或微載體生物反應(yīng)器中進(jìn)行。 在一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定經(jīng)純化的EV71病毒抗原量的步驟。此測(cè)定步驟可通 過定量ELISA來進(jìn)行。在以上方法中，EV71病毒抗原可為經(jīng)分離的EV71病毒全粒子、經(jīng)分 離的EV71病毒次粒子，或經(jīng)分離的EV71病毒蛋白。此等抗原可用于免疫原性組合物中。因 此，在另一方面，本發(fā)明的特征為一種含有經(jīng)純化的EV71病毒抗原的免疫原性組合物。
[0006] 經(jīng)分離的病毒粒子、蛋白質(zhì)、多肽或肽是指實(shí)質(zhì)上不含天然結(jié)合分子的病毒粒子、 蛋白質(zhì)、多肽或肽，亦即以干重計(jì)為至少75% (亦即包括75%至100%在內(nèi)的任何數(shù)值） 純度。純度可通過任何適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方法（例如通過管柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分 析）量測(cè)。經(jīng)分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可純化自天然來源、通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)方法產(chǎn) 生。術(shù)語「蛋白質(zhì)」與「多肽」可互換使用以描述任何氨基酸鏈，而不論長(zhǎng)度或轉(zhuǎn)譯后修飾 (例如糖基化或磷酸化）如何。因此，術(shù)語「本發(fā)明的多肽」包括：本發(fā)明的全長(zhǎng)、天然產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)；對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的全長(zhǎng)天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的重組或合成產(chǎn)生的多肽；或天然產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)的特定域或部分。該術(shù)語亦包涵具有附加的氨基端甲硫胺酸（適用于在原核細(xì)胞 中表現(xiàn)）的成熟多肽。肽是指足夠短而能由氨基酸組成成分人工制備的鏈。一般而言，肽 為50個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)或更短（例如50、40、30、20、15、10或5個(gè)殘基長(zhǎng)）。病毒全粒子或 完整病毒粒子是指由核酸（其基因組）經(jīng)蛋白質(zhì)保護(hù)殼（亦即衣殼）包圍組成的病毒粒子 (virion)。次粒子系指含有衣殼，但含有不完整基因組或不含核酸的粒子。例如參看Kinpe DM.及 Howley PM. (2001)Fundamental Virology，第 4 版，第 18 章。
[0007] EV71病毒蛋白的實(shí)例包括第一 EV71病毒多肽，其包括EV71VP1蛋白的片段或肽， 該EV71VP1蛋白具有選自下列組成的群的序列或由該序列組成：SEQ ID N0:5-7、ll-14、 16、20-24、39-41及44-46 (列于下文）；及第二EV71病毒多肽，其包括EV71VP2或VP3蛋 白的片段或肽。免疫原性組合物可進(jìn)一步包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的佐劑，諸如磷酸鋁。該第 一或第二EV71病毒多肽為至少15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。該第二EV71病毒多肽可包括選自由 以下組成的群的序列或由該序列組成：SEQ ID勵(lì)：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及 43 (列于下文）。
[0008] 上述抗原或組合物可用于誘發(fā)對(duì)腸病毒感染的免疫反應(yīng)。因此，可投予有效量的 抗原或組合物至有需要的個(gè)體?！?jìng)€(gè)體」是指人類及非人類動(dòng)物。非人類動(dòng)物的實(shí)例包括所 有脊椎動(dòng)物，例如哺乳類動(dòng)物，諸如非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物（尤其為較高等的靈長(zhǎng)類動(dòng)物）、 犬、嚙齒動(dòng)物（例如小鼠或大鼠）、天竺鼠、貓，及非哺乳動(dòng)物，諸如鳥類。在一較佳實(shí)施例 中，個(gè)體為人類，尤其為幼兒。在另一實(shí)施例中，個(gè)體為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或適用作疾病模型的動(dòng)物。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施將于附圖及下文的說明中詳述。本發(fā)明的其它特征、目 標(biāo)及優(yōu)勢(shì)可由說明書、附圖及權(quán)利要求書而顯而易見。
【附圖說明】
[0010] 圖1為展示在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。
[0011] 圖2為展示在I. 4L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。
[0012] 圖3為展示在5. OL生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。
[0013] 圖4A-4C為展示通過液相層析對(duì)EV71-E59病毒原液進(jìn)行純化的圖及相片。
[0014] 圖5為一組展示通過連續(xù)蔗糖梯度超速離心對(duì)EV71-E59病毒原液進(jìn)行純化的圖 及相片。
[0015] 圖6為一組展示EV71-E59病毒粒子的特征的相片。
[0016] 圖7為展示EV71-E59病毒的失活動(dòng)力學(xué)的圖。
[0017] 圖8為展示通過TEM檢測(cè)EV71-E59病毒粒子的相片。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明，至少部分，是基于EV71抗原可引發(fā)免疫反應(yīng)的意外發(fā)現(xiàn)及相關(guān)方法。 EV71為小核釀核酸病毒科（family Picornaviridae)腸病毒屬（genus Enterovirus)的不 具外套的RNA病毒。此科的特征包括這些病毒不具外套、具二十面對(duì)稱性、直徑30±5nm、含 有單分子正義ssRNA (7. 5-8. 5kb)，且其在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。病毒衣殼為對(duì)稱的二十面體（T = 1)且由60個(gè)相同單元構(gòu)成，各單元由以下四種結(jié)構(gòu)蛋白組成：VP1、VP2、VP3及VP4。EV71 病毒在1969年于美國(guó)首次分離。已測(cè)定EV71原型病毒株BrCr的完整核苷酸序列。
[0019] 如本文所述，本發(fā)明的特征在于一種制備經(jīng)純化的EV71病毒抗原的方法。該方法 包括培養(yǎng)產(chǎn)生EV71病毒的宿主細(xì)胞。可使用各種培養(yǎng)方法。實(shí)例包括基于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、微 載體-生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)器及細(xì)胞于微載體珠粒間轉(zhuǎn)移（Beads-to-Beads transfer)的方 法。
[0020] 可使用各種細(xì)胞作為產(chǎn)生上述EV71抗原的宿主。在一實(shí)例中，使用Vero細(xì)胞。 Vero細(xì)胞為人類疫苗制備的官方認(rèn)可細(xì)胞株且已用來制備人類小兒麻痹疫苗（polio) 及狂犬病疫苗。因?yàn)閂ero細(xì)胞具固著依賴性，所以可使用微載體技術(shù)來建立用于疫苗 制備的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法。為此，可使用微載體技術(shù)及無血清培養(yǎng)來克服使用高血清 蛋白質(zhì)含量進(jìn)行培養(yǎng)的缺點(diǎn)，包括復(fù)雜的下游純化過程及普里昂蛋白（prion)污染之風(fēng) 險(xiǎn)。在一較佳實(shí)施例中，VP-SFM培養(yǎng)基（GIBCO)為較佳。亦可使用其它培養(yǎng)基，諸如Plus Vero(CESCO)、Excell(SAFC)及 HyQ(HYCL0NE)。
[0021] 為產(chǎn)生病毒抗原，一般可以10_2至10 _6(例如約10_5)的MOI感染宿主細(xì)胞。對(duì)于 收集，可使用批次、半批次或灌注技術(shù)。為純化病毒抗原，可使用液相層析（LC)或蔗糖梯度 超速離心純化?？稍?5°C至37°C下使用例如4000 :137%福爾馬林（formalin)進(jìn)行病毒 失活。為評(píng)估由此獲得的抗原及含有該抗原的疫苗的效能，可使用VP2抗原中的交叉中和 抗原決定基（例如SEQIDN0 :l-4、8-10、25-29、31-32、34-35及38之一）作為疫苗效能測(cè) 試的生物標(biāo)記。
[0022] 本發(fā)明的特征在于一種對(duì)抗病毒感染及/或其它相關(guān)病癥（包括手足口病，及相 關(guān)神經(jīng)疾?。┑拿庖咴越M合物，諸如疫苗。如上所述，該免疫原性組合物含有抗原，例如 EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或多肽。
[0023] 「抗原」是指含有一個(gè)或多個(gè)將刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液反應(yīng)和/或細(xì)胞抗 原特異性反應(yīng)的抗原決定基的粒子或分子。術(shù)語「抗原」可與「免疫原」互換使用。由于與 適當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行接觸，因此抗原誘導(dǎo)敏感狀態(tài)或免疫反應(yīng)且在活體內(nèi)或活體外以可呈現(xiàn)方式 與致敏個(gè)體的抗體或免疫細(xì)胞反應(yīng)。抗原可被生物體中的抗體特異性識(shí)別及結(jié)合。與主要 組織相容性復(fù)合體（MHC)結(jié)合的抗原亦可被T淋巴細(xì)胞（T-細(xì)胞）表面上的受體識(shí)別及結(jié) 合，導(dǎo)致T-細(xì)胞活化。如本文中所用，術(shù)語「抗原決定基」是指抗原上由特定抗體分子或 T-細(xì)胞受體所結(jié)合的位點(diǎn)。在本文中，該術(shù)語可與「抗原決定簇」或「抗原決定簇位點(diǎn)」互 換使用。
[0024] 術(shù)語「免疫反應(yīng)」或「免疫原性反應(yīng)」是指?jìng)€(gè)體中免疫系統(tǒng)響應(yīng)于抗原的任何反 應(yīng)。脊椎動(dòng)物免疫反應(yīng)的實(shí)例包括（但不限于）抗體產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性及補(bǔ)體 活化。對(duì)相同抗原后續(xù)刺激的免疫反應(yīng)（亦稱為二次免疫反應(yīng)）快于初次免疫所產(chǎn)生之反 應(yīng)。術(shù)語「免疫原性」系指在宿主動(dòng)物中針對(duì)抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。此免疫反應(yīng)形成 疫苗引發(fā)的針對(duì)特定感染生物體的保護(hù)性免疫力的基礎(chǔ)。
[0025] 「抗體」是指具有特定氨基酸序列且僅結(jié)合于一種抗原或密切相關(guān)的一組抗原的 免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的至少一個(gè)免疫活性部分。抗體實(shí)例包括IgG、IgM、IgA、 IgD及IgE。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括Fab及F(abV 2片段，其可通過用 諸如胃蛋白酶的酶處理抗體來產(chǎn)生?？贵w可為單克隆抗體或多克隆抗體?！竼慰寺】贵w」是 指僅含有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且能夠與特定抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)的一群抗體分子?！付?克隆抗體」是指含有一個(gè)以上抗原結(jié)合位點(diǎn)且能夠與多肽上一個(gè)以上抗原決定基發(fā)生免疫 反應(yīng)的一群抗體分子。
[0026] 抗原優(yōu)選可自宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)基表達(dá)及分離。其一致性及純度可經(jīng)由此項(xiàng)技術(shù) 中已知之方法（例如利用抗體的免疫印跡或質(zhì)譜分析）確定。由此制備的抗原可用以制備 免疫原性組合物（例如疫苗）以便在易染病毒的個(gè)體（例如人類個(gè)體）體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)EV71 病毒的抗體及免疫反應(yīng)。例如可用下文所述的方式或通過此項(xiàng)技術(shù)中已知的任何其它等效 方法制備這樣的組合物。
[0027] 此抗原可與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體（諸如磷酸鹽緩沖鹽水、碳酸氫鹽溶液）或 佐劑混合以制備醫(yī)藥組合物。載體在其與組合物的活性成分兼容且較佳能夠穩(wěn)定活性成 分且對(duì)待治療的個(gè)體無害的意義上須"可接受"。