L經(jīng)磷酸鋁吸附的失活EV71-E59病毒原液進(jìn) 行肌肉內(nèi)注射強(qiáng)化免疫。在強(qiáng)化免疫一周之后對(duì)免疫的動(dòng)物進(jìn)行采血，且收集血清以便分 析病毒中和能力。
[0050] 8.通過穿透式電子顯微鏡（TEM)檢測(cè)EV71-E59病毒粒子
[0051] 將失活的EV71-E59病毒原液滴于涂布福爾瓦膜（formvar)且經(jīng)碳蒸 (carbon-vaporized)的200網(wǎng)目銅網(wǎng)上。在室溫下將樣品（20 μ L)滴在銅網(wǎng)上保持15分 鐘，且接著以一片濾紙移除過量樣品。以CldH2O洗滌一次后，以2%鎢磷酸溶液對(duì)銅網(wǎng)進(jìn)行 染色2分鐘且隨后以一片濾紙移除溶液。染色的銅網(wǎng)經(jīng)干燥3天以上。在Hitachi H-7650 電子顯微鏡下觀察銅網(wǎng)。
[0052] 9.抗EV71-E59血清的中和試驗(yàn)
[0053] 在56°C下使自免疫小鼠收集的血清失活30分鐘。將各血清樣品添加至微管中且 使用新鮮VP-SFM培養(yǎng)基以兩倍連續(xù)稀釋度稀釋。將 400 μL體積含 200TCID5(lEV71-E59 病毒的懸浮液添加至含有400 μ L連續(xù)稀釋血清的各管中。在4°C下培育18-24小時(shí)后，將 100 μ L連續(xù)稀釋樣品添加至含Vero細(xì)胞的96孔盤中。在37°C下培育96孔盤中的培養(yǎng)物 七天，且通過計(jì)數(shù)受感染Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)來獲得TCID 5tl值。使用Reed-Muench法 獲得50%中和抑制劑量（ID5tl)，其為使病毒效價(jià)減小50%的血清稀釋度的幾何倒數(shù)。
[0054] 10.合成肽的設(shè)計(jì)及合成
[0055] EV71病毒株TW/2086/98 VP1、VP2及VP3衣殼蛋白的重疊合成肽在科羅耐國際科 技公司（Kelowna International Scientific Inc.，臺(tái)北縣，臺(tái)灣）合成，包括涵蓋VPl衣 殼蛋白的完整序列的一組57種重疊合成肽、涵蓋VP2衣殼蛋白之完整序列的一組49種重 疊合成肽，及涵蓋VP3衣殼蛋白之完整序列的一組47種重疊合成肽。各肽含有15個(gè)氨基 酸殘基，其中10個(gè)殘基與相鄰肽重疊。
[0056] 11.通過ELISA檢測(cè)抗體
[0057] 通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)測(cè)量抗體對(duì)各合成肽的親和力。在4°C下以50 μ L 在涂布緩沖液（〇. IM NaHCO3, pH = 9. 5)中稀釋至10 μ g/mL的個(gè)別合成肽或經(jīng)純化的病毒 涂布96孔盤（COSTAR)的各孔過夜。以0. 5微克/孔失活EV71-E59病毒原液用作陽性對(duì) 照組。各合成肽或純化病毒有二重復(fù)孔。以IXPBST(含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩 沖鹽水）洗滌一次后，以200 μ L阻斷緩沖液（5%脫脂奶的PBS溶液）阻斷各孔且在室溫 下培育2小時(shí)。將以1 : 200稀釋于1% BSA/PBS中的一抗添加至各孔（每孔100 μ L)中 且培育2小時(shí)。在移除一抗溶液之后，以IXPBST洗滌各孔六次。向經(jīng)洗滌的各孔中添加 100 μ L 以 1 : 5000 稀釋于 1% BSA/PBS 中的辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase)標(biāo) 記的二抗，且培育2小時(shí)。在移除二抗溶液之后，以IXPBST洗滌各孔六次。通過添加 TMB 底物溶液（KPL)使反應(yīng)顯色且在室溫下培育15分鐘。通過添加 H2SO4(IN)來停止反應(yīng)且通 過ELISA讀取器在450nm下量測(cè)吸光度。
[0058] 12.序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)同源性預(yù)測(cè)
[0059] 所有相關(guān) EV71 病毒株均自 NCBI PubMed 網(wǎng)站（www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed) 搜尋。使用稱為 ClustalW2 的計(jì)算機(jī)軟件（www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html) 對(duì)EV71VP2蛋白的基因組序列進(jìn)行比對(duì)。
[0060] 結(jié)果
[0061] 1.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液
[0062] Vero細(xì)胞在37°C下于含200mL VP-SFM培養(yǎng)基的850cm2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì) 胞密度達(dá)到1. 5-2 X IO8個(gè)細(xì)胞時(shí)，置換培養(yǎng)基且用EV71-E59病毒以10 _5的MOI感染Vero 細(xì)胞。如圖1中所示，病毒效價(jià)在第3DPI達(dá)到2-4. 5X IO6TCID5ciAiL且病毒效價(jià)維持穩(wěn)定 產(chǎn)量。當(dāng)使用200mL或400mL培養(yǎng)基時(shí)，EV71-E59病毒的生成動(dòng)力學(xué)為類似。
[0063] 2.在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液
[0064] 使用VP-SFM培養(yǎng)基中的微載體細(xì)胞培養(yǎng)來產(chǎn)生EV71-E59病毒原液。在37°C下，在 批次、半批次或灌注生物反應(yīng)器中，使Vero細(xì)胞于載體濃度為5g/L的Cytodex微載體上生 長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2-2. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，用新鮮VP-SFM培養(yǎng)基置換70 %培養(yǎng)基，且 在生物反應(yīng)器中在32°C下用EV71-E59病毒以KT5的MOI感染Vero細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在1. 4L批次 生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中最大病毒效價(jià)為在第6DPI達(dá)到2. 7X 105TCID5(l/mL。病毒效價(jià)在I. 4L 半批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12DPI在0. 8至7 X IO6TCID5ciAiL的范圍內(nèi)。病毒效 價(jià)在I. 4L灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12DPI在0. 5至2X IO6TCID5tZmL的范圍內(nèi) (圖2)。在5L批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中最大病毒效價(jià)為在第6DPI達(dá)到I X 106TCID5Q/mL。 病毒效價(jià)在5L半批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12DPI在0. 7至13 X IO6TCID5ciAiL的 范圍內(nèi)。病毒效價(jià)在5L灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第7至第13DPI在1至2X IO7TCID5tl/ mL的范圍內(nèi)（圖3)。與批次培養(yǎng)法相比，半批次及灌注培養(yǎng)法可將收集產(chǎn)率提高3-5倍。
[0065] 3.通過液相層析純化EV71-E59病毒原液
[0066] 將濃縮的EV71-E59病毒原液（20mL)裝載至Sepharose Fast Flow 6凝膠管柱 或Sephacryl S-500,且進(jìn)行液相層析?；赪estern印跡分析，EV71-E59病毒主要收集 于分離液區(qū)段3及4中（圖4A及4B)。或者，將濃縮的病毒原液（20mL)裝載至S印hacryl S-500凝膠管柱。EV71-E59病毒的主要分離液區(qū)段見于分離液區(qū)段7及8中（圖4C)。濃 縮匯集的分離液區(qū)段。透濾經(jīng)純化的病毒原液且以PBS再懸浮。
[0067] 4.通過連續(xù)蔗糖梯度超速離心來純化EV71-E59病毒原液
[0068] 將濃縮的EV71-E59病毒原液裝載至10-50 %連續(xù)蔗糖梯度以便在32, OOORPM下 超速離心3小時(shí)。當(dāng)自培養(yǎng)基分離EV71-E59病毒時(shí)，通過Western印跡分析檢測(cè)到兩種 EV71-E59病毒粒子（圖5)。在具有25至28%蔗糖的分離液區(qū)段中檢測(cè)到EV71-E59次粒 子，而在具有35至38%蔗糖的分離液區(qū)段中檢測(cè)到EV71-E59全粒子。EV71-E59全粒子比 EV71-E59次粒子更具感染性。分別透濾此兩種EV71-E59病毒粒子且以PBS再懸浮。
[0069] 5. EV71病毒粒子的特征
[0070] 通過組合純化與液相層析及蔗糖梯度超速離心來獲得超純EV71-E59病毒原 液。將樣品裝載于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上且用考馬斯藍(lán)（Coomassie Blue)染色。 EV71-E59次粒子與全粒子顯示不同蛋白質(zhì)圖譜（圖6)。EV71-E59病毒抗原的預(yù)測(cè)分子量 及觀測(cè)分子量列于表1A-1C中。
[0071] 表1A.完全切割的病毒抗原

[0078] 如圖6中所示，EV71-E59次粒子具有較多抗原，主要包括VPO (VP2+VP4)、VPl及 VP3。EV71-E59全粒子具有基本病毒組成：VP1、VP2、VP3及VP4。
[0079] 6.制備失活的EV71-E59病毒原液
[0080] 將EV71-E59病毒原液（I X 107PFU/mL)與37%甲醛溶液以4000 : 1的體積比混 合，且在37°C、25°C或4°C下培育以使病毒失活。在37°C下，EV71-E59病毒在24小時(shí)內(nèi)失 活，而EV71-E59病毒在25°C下失活需要3天（圖7)。若使病毒在4°C下失活，則EV71-E59 病毒效價(jià)在3天內(nèi)仍較高。發(fā)現(xiàn)升高溫度顯著提高失活速率。在37°C下，EV71-E59病毒效 價(jià)耗時(shí)2. 16天降至l(T12PFU/mL (表2) 〇
[0081] 表2.EV71-E59病毒的失活時(shí)間
[0082]
[0083] 為確保疫苗接種的安全性，在37°C下進(jìn)行EV71-E59病毒的失活維持5-6天。
[0084] 7.通過TEM檢測(cè)EV71-E59病毒粒子
[0085] 以2%鎢磷酸溶液染色失活的EV71-E59原液且在穿透式電子顯微鏡下觀測(cè)。發(fā)現(xiàn) EV71-E59病毒在失活后仍保持為完整病毒粒子。EV71-E59病毒粒子的尺寸在直徑30±5nm 的范圍內(nèi)（圖8)。次粒子與全粒子樣品均經(jīng)檢測(cè)具有完整病毒粒子。
[0086] 8.失活的EV71-E59病毒的免疫原性研宄
[0087] 為進(jìn)一步測(cè)定EV71-E59病毒的免疫原性，以甲醛溶液處理來自液相層析及來自 連續(xù)蔗糖梯度超速離心的經(jīng)純化的病毒原液以使病毒失活。按照兩周免疫時(shí)程，以吸附于 磷酸鋁上的失活的EV71-E59病毒免疫小鼠、兔及猴。在小鼠模型中，結(jié)果顯示自液相層析 或自連續(xù)蔗糖梯度超速離心制備的失活的EV71-E59病毒均引發(fā)中和抗體并具顯著效價(jià) (表 3)。
[0088] 表3.小鼠模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。
[0090] 使用相同免疫時(shí)程時(shí)，EV71-E59全粒子引發(fā)高于次粒子的中和抗體效價(jià)。在兔及 猴模型中，從已用液相層析純化的病毒原液制備的失活的EV71-E59病毒亦誘導(dǎo)較高中和 效價(jià)（表4及表5)。
[0091] 表4.兔模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。
[0092]
[0096] 使用這些抗血清進(jìn)行交叉中和檢定，且結(jié)果展示這些抗血清亦能對(duì)抗EV71病毒 的C5及B5亞基因型（subgenotype)(表6)。
[0097] 表6.不同血清對(duì)抗EV71病毒的遺傳組（genogroup)C5及B5的中和抗體效價(jià)。
[0098] 表 6
[0099]
[0100] 明顯地，化學(xué)失活的EV71-E59病毒亦誘導(dǎo)出對(duì)抗其它EV71病毒株的中和抗體 (表 6)。
[0101] 9.使用對(duì)抗EV71疫苗候選物產(chǎn)生的抗血清來鑒別EV71的線性免疫顯性抗原決定 基（linear immunodominant epi