GGGGGAGCAGGTAGAGGGGC 擴(kuò)增序列 用重疊 PCR方法，以如如功模板，以引物序列5' CCGGAATTCATGGACGA CCAAACGTTGTTTGCCC 和 5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC 擴(kuò)增得到耐熱超氧化物 歧化酶基因/^/75·〇￡/。
[0016] 以pET_28a ( + )為出發(fā)載體構(gòu)建的含有超氧化物歧化酶基因重組表達(dá) 載體為pET-28a/r々7S0D。重組表達(dá)載體pET-28a/r々7S0D可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
[0017] 培養(yǎng)含有本發(fā)明的耐熱超氧化物歧化酶編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時(shí)加入 誘導(dǎo)劑IPTG，所加入的IPTG的濃度為0. 1-lmM，優(yōu)選為0. 2mM，誘導(dǎo)溫度為25-37°C，優(yōu)選 30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為3-5小時(shí)。所述對(duì)表達(dá)產(chǎn)物耐熱超氧化物歧化酶進(jìn)行純化的方法優(yōu)選為 Ni柱親和層析法。
[0018] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了耐熱超氧化物歧化酶在制備耐高溫SOD酶方面的應(yīng)用。本 發(fā)明通過(guò)基因工程改造中的天然嗜熱Fe/Mn-SOD得到一種新的超氧化物 歧化酶基因其編碼的超氧化物歧化酶r々?S0D最適溫度為70°C，最適pH為7,100°C 半衰期為11. 5h，具有極高的熱穩(wěn)定性，酸堿、有機(jī)溶劑、清潔劑、蛋白變性劑和抑制劑耐受 性，可應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生保健、食品或化妝品加工。
[0019] 本發(fā)明公開(kāi)的一種新的、耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因所具有的積極效 果在于： (1)利用基因工程改造所獲得的SOD酶是一種耐高溫酶，可在高溫條件下保持極好的 穩(wěn)定性，克服了中溫酶（20°C ~50°C )及低溫酶（2°C ~20°C )在應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì) 不穩(wěn)定現(xiàn)象，有利于其在食品、化妝品、藥品及保健品領(lǐng)域的工業(yè)應(yīng)用。
[0020] (2)本專利中的SOD酶具有良好的抗逆性，可耐受酸堿、有機(jī)溶劑、清潔劑、蛋白抑 制劑和變性劑，更有利于SOD酶制劑在成分復(fù)雜的產(chǎn)品中的添加與應(yīng)用。
[0021] (3)本專利中的SOD酶具有良好的穩(wěn)定性，重組表達(dá)方法簡(jiǎn)單，不僅可以使添加了 SOD酶制劑的產(chǎn)品運(yùn)用更加多樣的加工工藝，而且可以延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)存、運(yùn)輸銷售周期，操 作簡(jiǎn)便、可行性強(qiáng)、適應(yīng)性好，成本低廉，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景和實(shí)際意義。
[0022] 【附圖說(shuō)明】：

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。以下各實(shí)施例僅 僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。需要特別說(shuō)明的是實(shí)施例中所用到的試劑均由市售，嗜 熱脫氮芽胞桿菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)已保藏在國(guó)家菌種保藏中心，如SOD基因序列 由金唯智生物科技(北京）有限公司合成并克隆到載體pET-28a ( + )。
[0024] 實(shí)施例1 構(gòu)建編碼的Fe/Mn-SOD全序列基因（的克隆，并且構(gòu)建編碼 重組SOD (S0D-GTNG_2215的N端序列和JeroAFr腫的Fe/Mn-SOD的重組結(jié)合成重 組S0D)全序列基因的克隆。并且測(cè)定表達(dá)蛋白的酶活性及抗逆性。
[0025] L嗜熱脫氮芽胞桿菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)總DNA的提取 在本實(shí)施例中，采用從中國(guó)天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱 脫氮芽胞桿菌NG80-2 ((SfeoAaciBw1S iAerffioofefli iri/Yca/75·該菌株已保藏在中國(guó)微生物 菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCC No. 1228)，取其過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮培 養(yǎng)物3mL，離心收集菌體，菌體懸于250 yL50mMTris緩沖液中（pH8. 0)，加入IOyLO. 4M EDTA (pH8. 0)，混勻后37°C保溫20min，之后加入30 μ L20mg/L溶菌酶，混勻后37°C再保溫 20min，再加入5 μ L20mg/L蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20 μ L10%SDS，50°C保溫至溶液澄 清，分別用等體積酚：氯仿：異戊醇抽提兩次，氯仿：異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶 液，加入2. 5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100 μ LTE緩沖液 (ρΗ8· 0, lOmMTris，ImMEDTA)，加入 10mg/L RNase 2 yL，65°C保溫 30min，分別用酚：氯仿： 異戊醇、氯仿：異戊醇各抽提一次，上清液加入2. 5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用 70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50 μ LTE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果為 A260/A280=l. 95, Α260=0. 73。
[0026] 2.超氧化物歧化酶基因的克隆和篩選 2. I JeroAm/ffijDeraijr的Fe/Mn-S0D全序列基因（也5〇〇0由金唯智生物科技(北京）有 限公司合成并克隆到載體pET-28a ( + )上，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-々7S0D。
[0027] 2. 2擴(kuò)增重組SOD的DNA序列 2. 2. 1擴(kuò)增NG80-2 Fe/Mn-S0D的N端序列基因（Ν-τ々Λ5〇?/)，取前面所述的總DNA溶液 0. 5 μ L (約long)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù) 進(jìn)行25個(gè)循環(huán)PCR。
[0028] 設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下： 95〇C, 3min ；95〇C , 30s ；55〇C, 45s ；72〇C, 2min ；72〇C, IOmin ；4°C, 2hr 上游引物：5' CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC3' 下游引物：5' CGTACCTCTTAAACGAAACCGCCCGT3' 2· 2· 2 擴(kuò)增 的 Fe/Mn-SOD 全序列基因（々75·〇〇0,取 pET-々?S0D (約 l〇ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行25個(gè)循 環(huán) PCR0
[0029] 設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下： 95〇C, 3min ；95〇C , 30s ；55〇C, 45s ；72〇C, 2min ；72〇C, IOmin ；4°C, 2hr 上游引物：5'ACGGGCGGTTTCG TTTAAGAGGTACG3' 下游引物：5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC3' 2· 2· 3 擴(kuò)增重組 SOD 的 DNA 序列（Γ々7·5〇?/)，Ν-τ々7·5〇?#Ρ 各取 0· 25 μ L(約 IOng) 作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行25個(gè)循環(huán) PCR0
[0030] 設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下： 95〇C, 3min ；95〇C , 30s ；55〇C, 45s ；72〇C, 2min ；72〇C, IOmin ；4°C, 2hr 上游引物：5'CCGGAATTCATGGACGACCAAACGTTGTTTGCCC 3' 下游引物：5' CCCAAGCTTCTACTGGGGGAGCAGGTAGAGGGGC 3' !如如難]PCR產(chǎn)物純化后用EcoRI/ HindIII雙酶切，以上酶切產(chǎn)物分別與經(jīng)同樣 限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a (+)連接，得到重組質(zhì)粒pET-r如SOD。將 pET-々7S0D與pET-r々7S0D轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α (本實(shí)驗(yàn)室保存）后，涂于含50 μ g/ mL Kan(卡拉霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37°C培養(yǎng)16~18小時(shí)，挑取單克隆菌落鑒定。采 用Sanger雙脫氧法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入的DNA序列正確。將上述 重組質(zhì)粒pET-々?S0D與pET-r々7S0D轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，此大腸桿菌BL21分別命名為 BLOl 與 BL02。
[0031] 3.重組超氧化物歧化酶的純化和特性 將上述重組菌BLOl和BL02單克隆分別接入20mL含50 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基中， 37°C，180rpm/min培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1% (V/V)接種量接入200mL含50 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基(共2個(gè)搖瓶)，37 °C，220rpm/min培養(yǎng)A600為(λ 6時(shí)，加入IPTG至終濃 度為0. 2mM, 30°C，180rpm/min誘導(dǎo)3小時(shí)。誘導(dǎo)完后離心收集菌體，懸于50mMTris_Cl (pH8. 0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組超氧化物歧化酶的粗提液。此 上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠（Chelating Sepharose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在 SDS-PAGE上顯示一條帶。理論上推算々7S0D和r々?S0D的分子量分別為24. 6kD和51. 6 kD， 與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果一致。
[0032] 4.重組超氧化物歧化酶活性測(cè)定 3mL反應(yīng)混合液中14. 5mML-甲硫氨酸加入2. 7mL，30 μ L EDTA-Na2加入10 μ L，2. 25mM NBT加入100 μ L，60 μ M核黃素加入100 μ L，PBS (ρΗ7· 8)加入90 μ L，加入10 μ L的樣品酶 液。各試劑加完后充分混勻，取1管置于暗處，560nm比色時(shí)調(diào)零。另取1管不加蛋白酶，用 磷酸鈉緩沖液代替作為空白對(duì)照。其余幾管待測(cè)樣品置于25°C光