95%、96%、97%、98%、99%或100%的全長多肽活性。功能片段可包括例如全長多肽的 90 %或更少、80 %或更少、70 %或更少、60 %或更少、50 %或更少、40 %或更少、30 %或更少 或20 %或更少，以及可包括例如全長多肽的達約50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。所提供的￡(：編號使用國際生 物化學與分子生物學聯(lián)盟命名委員會（NomenclatureCommitteeoftheInternational UnionofBiochemistryandMolecularBiology)的酶命名法。
[0065] 步驟1-葡萄糖轉(zhuǎn)化（氧化或脫氫）為1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯?？捎酶鞣N酶進行此步 驟，諸如以下家族的那些酶：氧依賴性葡萄糖氧化酶（EC1. 1. 3. 4)或NAD(P)-依賴性葡萄 糖脫氫酶（EC1. 1. 1. 118、EC1. 1. 1. 119)。已顯不氧化葡糖桿菌（Gluconobacteroxydans) 當在發(fā)酵罐中生長時可有效地將葡萄糖氧化成葡萄糖酸和5-酮葡萄糖酸（5-KGA)?？墒?用在葡糖桿菌屬和其它氧化細菌中發(fā)現(xiàn)的可溶性和膜結合PQQ依賴性酶（EC1. 1. 99. 35和 EC1.1. 5. 2)家族的酶。醌蛋白葡萄糖是可用于進行此步驟的另一種酶。所選擇的特定酶 將取決于所需反應條件和反應中將存在的必需的輔助因子，它們都在表1中說明。
[0066] 步驟1A-1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化（例如水解）成葡萄糖酸。此步驟可在水性介 質(zhì)中以化學方式進行且水解率取決于pH(Shimahara，K，Takahashi，T.，Biochim.Biophys. Acta(1970)，201，410)。水解在堿性pH(例如pH7.5)下較快且在酸性pH下較慢。許多 微生物也含有特異性1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯水解酶，且它們中少數(shù)幾個已經(jīng)被克隆和表征（EC 3. 1. 1. 17 ；Shinagawa,EBiosci.Biotechnol.Biochem. 2009,73,241-244)〇
[0067] 步驟IB-古羅糖醛酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成古羅糖醛酸。古羅糖醛酸內(nèi)酯的化學水解可通過 水溶液中的自發(fā)反應來進行。在大量內(nèi)酯酶中鑒別能夠催化此水解的酶（EC3. 1. 1.XX，且 更明確地說為 3. 1. 1. 17、3. 1. 1. 25)。
[0068] 步驟2-葡萄糖酸轉(zhuǎn)化成3-脫氫葡萄糖酸（DHG):在葡萄糖酸脫水為脫氫葡萄糖 酸（DHG)過程中可使用幾種酶，諸如葡萄糖酸脫水酶。實例包括屬于葡萄糖酸脫水酶家族 的那些酶（EC4. 2. 1. 39)。已顯示這類脫水酶的特定實例使葡萄糖酸脫水（Kim，S.Lee， S.B.Biotechnol.BioprocessEng. (2008)，13,436)。來自此家族的酶和其克隆的特定實例 顯示在實施例1中。
[0069] 步驟3 :3_脫氫葡萄糖酸（DHG)轉(zhuǎn)化成4,6-二羥基2, 5-二酮基己酸（2, 5-DDH)。 已描述用于進行此轉(zhuǎn)化的酶，2-脫氫-3-脫氧-D-葡萄糖酸5-脫氫酶（或DHG脫氫酶）（EC 1. 1. 1. 127)。
[0070] 步驟4 :4,6-二羥基2, 5-二酮基己酸（2, 5-DDH)轉(zhuǎn)化成4-脫氧-L-蘇-己酮糖 糖醛酸〇)THU)。在此步驟中可使用EC5. 3. 1. 12家族的酶，并且步驟15顯示五個這類酶被 克隆并顯示出對于5-KGA的脫水具有活性。這些酶也將顯示針對2, 5-DDH和DTHU的活性。 [0071] 步驟5 :DTHU轉(zhuǎn)化成5-脫氫-4-脫氧葡萄糖二酸（DDG)。DDG可由DTHU的化學氧 化或酶氧化產(chǎn)生，例如在醇存在下用能夠氧化醛的溫和化學催化劑產(chǎn)生?？墒褂萌┭趸?來催化此氧化。氧化細菌，諸如醋酸桿菌屬（Acetobacter)和葡糖桿菌屬（Gluconobacter) (Hollmann等人GreenChem.2011，13,226)在篩選中將是有用的。以下家族的酶可進行此 反應：醛氧化酶EC1. 2. 3. 1、醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶（EC1. 2. 7. 5)以及EC1. 2. 1. -XX. 家族的所有酶。糖醛酸脫氫酶（EC1. 1. 1. 203)家族的酶（例如參見步驟7)也將具有此活 性。可使用具有醇和醛氧化活性的其它酶，包括糖醇氧化酶家族中的酶（參見步驟19和 6)。其它廣泛的底物氧化酶包括可溶性和膜結合PQQ-依賴性醇/醛氧化酶。更具體地說， 可溶性周質(zhì)PQQ氧化酶和它們的屬于I型（EC1. 1. 9. 1)和II型（EC1. 1. 2. 8)家族的同 系物以及屬于EC1.1.5.X家族的膜結合PQQ氧化酶是適用的。在其它實施方案中，可使用 作用于DTHU的醛脫氫酶/氧化酶。
[0072] 步驟6和6A:葡萄糖酸轉(zhuǎn)化成古羅糖醛酸（6)以及3-脫氫-葡萄糖酸（DHG)轉(zhuǎn) 化成4-脫氧-5-赤-己酮糖糖醛酸（DEHU) (6A)。步驟5中描述的酶可用于此類轉(zhuǎn)化。其 它有用的酶包括EC1. 1. 1.XX家族中的NAD(P)-依賴性脫氫酶，且更具體地說為葡糖醛酸 脫氫酶（EC1. 1. 1. 19)、葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶（EC1. 1. 1.20)。此外，大量具有廣泛亞態(tài)范 圍（包括糖）的〇2_依賴性醇氧化酶將是有用的（EC1. 1. 3.XX)，包括山梨糖醇/甘露糖醇 氧化酶（EC1. 1. 3. 40)、己糖氧化酶（EC1. 1. 3. 5)、醇氧化酶（EC1. 1. 3. 13)和香草醛氧化 酶（EC1. 1. 3. 38)。PQQ-依賴性酶和氧化細菌中存在的酶也可用于這些轉(zhuǎn)化。
[0073] 步驟7和7B:古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖二酸（7)以及L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化成艾 杜糖二酸（7B)。這些步驟可用糖醛酸脫氫酶（EC1. 1. 1. 203)或氧化酶家族的酶來完成，如 本文中所描述。
[0074] 步驟7A:4_脫氧-5-赤-己酮糖糖醛酸（DEHU)轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-赤-2-己酮糖 二酸ODH)。步驟5中描述的同樣的酶將用于進行此轉(zhuǎn)化。
[0075] 步驟8和8A:D_葡萄糖二酸轉(zhuǎn)化成5-脫氫-4-脫氧葡萄糖二酸（DDG)(步驟8) 以及艾杜糖二酸轉(zhuǎn)化成DDG(步驟8A)。葡萄糖二酸脫水酶（EC4. 2. 1. 40)家族的酶可用 于進行這些步驟。此家族的酶已被克隆并且已顯示可有效地將葡萄糖二酸轉(zhuǎn)化成DDG。兩 種D-葡萄糖二酸脫水酶（EC4. 2. 1. 40)如以下經(jīng)克隆的葡萄糖二酸脫水酶的表格中所示 被克隆。使用氨基脲測定，兩種酶對均顯示對葡萄糖二酸至DDG活性的脫水具有極高活性， 如步驟2中所描述。
[0076] 經(jīng)克隆的葡萄糖二酸脫水酶
【主權項】
1. 一種從起始底物生產(chǎn)酶途徑或化學途徑產(chǎn)物的方法，所述途徑包括選自由以下組成 的組的一個或多個轉(zhuǎn)化步驟： 古羅糖醛酸酶轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖二酸（步驟7); 5_酮葡萄糖酸（5-KGA)酶轉(zhuǎn)化成L-艾杜糖醛酸（步驟15); L-艾杜糖醛酸酶轉(zhuǎn)化成艾杜糖二酸步驟7b);以及 5-酮基葡糖酸酶轉(zhuǎn)化成4, 6-二羥基2, 5-二酮基己酸（2, 5-DDH)(步驟16); 1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成古羅糖酸內(nèi)酯（步驟19)。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)化步驟是古羅糖醛酸酶轉(zhuǎn)化成 D-葡萄糖二酸（步驟7)。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)化步驟是5-酮葡萄糖酸 (5-KGA)酶轉(zhuǎn)化成L-艾杜糖醛酸（步驟15)。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)化步驟是L-艾杜糖醛酸酶轉(zhuǎn)化 成艾杜糖二酸步驟7b)。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)化步驟是5-酮葡萄糖酸酶轉(zhuǎn)化 成4, 6-二羥基2, 5-二酮基己酸（2, 5-DDH)(步驟16)。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)化步驟是1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯酶 轉(zhuǎn)化成古羅糖酸內(nèi)酯（步驟19)。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述酶途徑的產(chǎn)物是5-脫氫-4-脫氧葡萄糖二酸 (DDG) 〇
8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述底物是葡萄糖并且所述產(chǎn)物是5-脫氫-4-脫 氧葡萄糖二酸（DDG)，所述方法包括以下步驟： D-葡萄糖酶轉(zhuǎn)化成1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯（步驟1); 1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成古羅糖酸內(nèi)酯（步驟19); 古羅糖酸內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成古羅糖醛酸（步驟1B); 古羅糖醛酸酶轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖二酸（步驟7); D-葡萄糖二酸酶轉(zhuǎn)化成5-脫氫-4-脫氧葡萄糖二酸（DDG)(步驟8)。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述底物是葡萄糖并且所述產(chǎn)物是DDG，所述方法 包括以下步驟： D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯（步驟1); 1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸（步驟la); 葡萄糖酸轉(zhuǎn)化成5-酮葡萄糖酸（5-KGA)(步驟14); 5_酮葡萄糖酸（5-KGA)轉(zhuǎn)化成L-艾杜糖醛酸（步驟15