香草醛合酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生香草醛的方法以及宿主生物，例如用于此種產(chǎn)生的微生物或 植物。
【背景技術(shù)】
[0002] 香草香精（Vanilla)是世界上最流行的香料化合物并用于眾多的商業(yè)產(chǎn)品，包括 許多食物。天然香草是附生攀爬蘭花類香莢蘭（VanillaplanifoliaAndrews)和塔希提香 莢蘭（Vanillatahitensis)的豆莢中獲得的，所述香莢蘭屬于包括在單子葉植物內(nèi)的蘭目 (orderOrchidales)中的香草屬（genusVanilla)。香草酸（3-甲氧基_4_羥基苯甲酸） 是從發(fā)酵的香草豆莢中獲得的香草提取物中主要的香料化合物。在高濃度下，香草醛是對(duì) 活細(xì)胞有毒的。在豆莢中，所述香草醛作為無(wú)毒的植物抗菌物（phytoanticipin)香草醛葡 糖苷而積累，當(dāng)組織損傷時(shí)，所述香草醛葡糖苷轉(zhuǎn)化為主動(dòng)防御化合物。在發(fā)酵和加工處理 香草豆莢以用作香料成分期間，將香草醛葡糖苷的主要部分水解以提供游離的香草醛。估 計(jì)香草醛的總世界市場(chǎng)為每年10500噸。從香草豆莢中產(chǎn)生天然的香草醛是一個(gè)費(fèi)力、緩 慢且成本昂貴的過(guò)程。產(chǎn)生1千克香草醛需要約500千克的香草豆莢，對(duì)應(yīng)于約40, 000朵 花的授粉。目前，全球的香草醛產(chǎn)量只有3%是來(lái)自香草豆莢。絕大多數(shù)香草醛是從不同的 化石碳?xì)浠衔锵穸∠惴又薪?jīng)合成產(chǎn)生的或通過(guò)木質(zhì)素的酸水解產(chǎn)生的。尚未實(shí)現(xiàn)利用編 碼香莢蘭花途徑中的基因之異源表達(dá)而在微生物中通過(guò)生物技術(shù)產(chǎn)生香草醛，因?yàn)檫€未確 定基因。事實(shí)上，已經(jīng)通過(guò)表達(dá)來(lái)自其他生物的基因在酵母、真菌、細(xì)菌和體外細(xì)胞培養(yǎng)物 中產(chǎn)生香草醛，所述基因編碼組合以從結(jié)構(gòu)上與香草醛相關(guān)的外源添加物質(zhì)來(lái)形成香草醛 的酶。
[0003] 基于其碳骨架將苯丙氨酸衍生的揮發(fā)物分類為化合物。在成熟 的香草豆莢中發(fā)現(xiàn)的兩種最豐富的化合物香草醛葡糖苷和對(duì)羥基苯甲醛葡糖苷兩者都是 C6_C^合物。
[0004] 在天然香草中兩種主要的芳香化合物是對(duì)-羥基苯甲醛和香草醛。因?yàn)閷?duì)羥基苯 甲醛包含一些香草醛的相同結(jié)構(gòu)要素，認(rèn)為其是作為香草醛的前體。已經(jīng)推測(cè)來(lái)自香草醛 的途徑構(gòu)成了所有衍生自苯丙氨酸的代謝物的代謝網(wǎng)格。US2003/0070188描述了可用于 在來(lái)自香莢蘭（Vanillaplanifolia)的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生對(duì)羥基苯甲醛的方法。在 US2003/0070188中描述了一種利用4-羥基-苯甲醛合酶（4-HBS)(將其描述為能夠催化 對(duì)香豆酸的鏈縮短）來(lái)產(chǎn)生對(duì)羥基苯甲醛的方法。該文件還描述了 4-HBS在匍匐翦股穎 (creepingbentgrass)中的表達(dá)，但是并沒(méi)有提供有關(guān)這種表達(dá)的結(jié)果的信息。其還描述 了在表達(dá)4-HBS的酵母中檢測(cè)不到4-羥基苯甲醛。
[0005]Podstolski等在2002年描述了在存在硫醇試劑但不需要輔因子的情況下，4-輕 基-苯甲醛合酶（4-HBS)將4-香豆酸非氧化地轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，需要用于產(chǎn)生香草醛的方法，特別是用于在植物或微生物中產(chǎn)生香草醛的 方法。
[0007] 本發(fā)明提供了酶（本文中定名為香草醛合酶），所述酶能夠?qū)⑽核峄虬⑽核嵫?生物轉(zhuǎn)變成香草醛。可將這種酶用于在許多不同的宿主生物中以及在體外產(chǎn)生香草醛。
[0008] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供從阿魏酸產(chǎn)生香草醛的方法，其中所述方法包括 使用表達(dá)香草醛合酶的宿主生物，并且其中可將所述阿魏酸添加至所述宿主生物或者所述 宿主生物能夠產(chǎn)生阿魏酸。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生香草醛的方法，所述方法包括：
[0010] a)提供微生物，其中所述微生物
[0011] i.能夠產(chǎn)生阿魏酸；并且
[0012] ii.包含編碼SEQIDN0 :1的香草醛合酶（VpVAN)或與其共享至少80%序列同一 性的其功能同源物的異源核酸；以及
[0013] b)在支持所述微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物；
[0014] c)從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基中分離香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0015] 本發(fā)明還提供了產(chǎn)生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法， 所述方法包括：
[0016] a)提供微生物，其中所述微生物
[0017] i.能夠產(chǎn)生阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；并且
[0018] ii.包含編碼香草醛合酶的異源核酸，其中所述香草醛合酶是能夠催化阿魏酸的 側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及
[0019] b)在支持所述微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物；
[0020] c)從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基中分離香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供微生物，其中所述微生物
[0022] i?能夠產(chǎn)生阿魏酸；并且
[0023] ii.包含編碼香草醛合酶的異源核酸，其中所述香草醛合酶是能夠催化阿魏酸的 側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的VpVAN或與其共享至少70%、例如至少 80%的序列同一性的其功能同源物。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生香草醛的方法，所述方法包括以下步驟：
[0025] a)提供微生物，其中所述微生物包含編碼SEQIDN0 :1的香草醛合酶（VpVAN)或 與其共享至少80%序列同一性的其功能同源物的異源核酸；以及
[0026] b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)所述微生物；以及
[0027] c)從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基中分離香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡 糖苷的方法，所述方法包括以下步驟：
[0029] a)提供微生物，其中所述微生物包含編碼香草醛合酶的異源核酸，其中所述香草 醛合酶是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及
[0030] b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)所述微生物；以及
[0031] c)從所述微生物和/或從所述培養(yǎng)基中分離香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或 香草醛葡糖苷。
[0032] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供用于產(chǎn)生香草醛的方法，所述方法包括：
[0033]a)提供阿魏酸和/或阿魏酸衍生物，
[0034]b)使所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物與香草醛合酶相接觸，其中所述香草醛合酶 是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的（VpVAN)或與其共 享至少80%序列同一性的其功能同源物，
[0035] 從而產(chǎn)生香草醛。
[0036] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生香草醛的方法，所述方法包括：
[0037]a)提供包含編碼SEQIDN0 :1的VpVAN或與其共享至少80%序列同一性的其功 能同源物的異源核酸的植物；以及
[0038] b)培養(yǎng)所述植物；以及
[0039] c)從所述植物中分離香草醛。
[0040] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡 糖苷的方法，所述方法包括：
[0041] a)提供包含編碼香草醛合酶的異源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能夠催化 阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶；以及
[0042] b)培養(yǎng)所述植物；以及
[0043]c)從所述植物中分離香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
[0044] 本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供產(chǎn)生動(dòng)物飼料的方法，所述方法包括：
[0045]a)提供包含編碼香草醛合酶的異源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能夠催化 阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的VpVAN或與其共享至少80%序 列同一性的其功能同源物；以及
[0046] b)培養(yǎng)所述植物；以及
[0047] c)將所述植物加工成動(dòng)物飼料。
[0048] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生食物產(chǎn)品的方法，所述方法包括：
[0049]a)提供包含可食用部分的植物，其中所述植物包含編碼香草醛合酶的異源核酸， 其中所述香草醛合酶是能夠催化阿魏酸的側(cè)鏈斷裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1 的VpVAN或與其共享至少80%序列同一性的其功能同源物；以及
[0050] b)培養(yǎng)所述植物；以及
[0051] c)收獲所述可食用部分；
[0052] 從而得到具有香草醛口味的食物產(chǎn)品。
【附圖說(shuō)明】
[0053] 圖1示出了來(lái)自體外供應(yīng)的VpVAN的LC-MS色譜圖。該圖示出所述酶能夠催化阿 魏酸斷裂兩個(gè)碳成為香草醛。該反應(yīng)不需要CoASH、ATP和NAD+作為輔因子。具有在30°C 下在2. 5mMDTT中用5mM阿魏酸供應(yīng)1小時(shí)的VpVAN之蛋白質(zhì)溶液的離子色譜圖。此外， 在ATP、NAD+的存在下，VAN能夠催化阿魏酸CoA斷裂兩個(gè)碳成為香草醛。具有在30°C下在 2. 5mMDIT、0.ImMATP和0.ImMNAD+中用5mM阿魏酸CoA供應(yīng)1小時(shí)的VAN