用于非洗提樣品的一步法核酸擴增的方法
【專利說明】用于非洗提樣品的一步法核酸擴增的方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴增的領域，特別是使用聚合酶鏈反應以擴增核酸。本發(fā)明提供 方法和試劑盒，其可用于按如下擴增核酸：將FTA?Elute固體支持物與PCR試劑組合用于 核酸樣品的一步法擴增。本發(fā)明在核酸的長期儲存和便于加工中具有應用并且尤其在基因 分型、診斷學和法醫(yī)學中是有用的。
[0002] 背景 聚合酶鏈反應（PCR)是在分子生物學中用于擴增核酸的常用工具。US4683202 (Mullis,CetusCorporation)描述了用于擴增包含于核酸或其混合物中的任何所需的特 定核酸序列的方法。
[0003] 在濾紙或化學改性的基質上的核酸的長期儲存、轉移和存檔是用于在將DNA或 RNA以用于遺傳分析（例如PCR)的形式提取和分離之前保藏遺傳材料的周知的技術。因 此，EP1563091 (Smith等人，Whatman)涉及用于儲存來自樣品（例如細胞或細胞裂解物） 的核酸的方法。將核酸分離并在室內(nèi)溫度和濕度下，在種類廣泛的濾器和其它類型的固體 支持物或固相介質上長時間儲存。此外，該文件描述了用于在管、柱或多孔板中的寬泛范圍 的固體支持基質上儲存含核酸的樣品的方法。
[0004]W0/9003959(Burgoyne)描述了用于儲存DNA(包括血液DNA)的基于纖維素的固 體支持物，其包括具有化合物或組合物的固體基質，所述化合物或組合物保護摻入基質中 或吸收到基質上的DNA免于降解。此文件也公開了用于使用固體介質儲存DNA和用于DNA 的回收或DNA的原位使用的方法。
[0005]US5496562(Burgoyne)描述了用于DNA儲存的基于纖維素的固體介質和方法。公 開了用于將DNA存儲和轉移至固體介質上的方法和涉及（a)從固體介質中回收DNA或（b) 原位在固體介質上使用DNA(例如，通過PCR的DNA序列擴增）的方法。不幸的是，所描述 的方法僅將表面活性劑或去垢劑摻入至固體介質的表面上并因此受累于缺點：它們需要分 離步驟用于在實施PCR之前除去去垢劑。
[0006]W0993900 (Gentra)也描述了用于加工和擴增DNA的方法。該方法包括將含DNA 的樣品與固體支持物接觸的步驟，其中裂解試劑被結合至固體支持物。隨后將所述DNA用 DNA純化試劑處理并純化。該申請在固體支持物上不包含多價螯合劑并且需要分離步驟用 于在擴增之前除去裂解試劑和純化DNA。
[0007] W09639813 (Burgoyne)描述了用于儲存遺傳材料的樣品和隨后的分析的固體介 質；所述固體介質包含蛋白變性劑和螯合劑。所述方法是關于螯合劑的，所述螯合劑為任何 能夠絡合多價離子（其包括II族和III族多價金屬離子和過度金屬離子）的化合物。該發(fā)明 并沒有具體提及環(huán)糊精作為螯合劑，它也并沒提出可按一步法實施PCR分析。
[0008]US5705345 (Lundin等人）描述核酸制備的方法，其中將含細胞樣品裂解以釋放 核酸并且用環(huán)糊精處理該樣品以中和提取劑。此系統(tǒng)的優(yōu)點是：傳統(tǒng)去垢劑的去除需要分 離步驟，但在加入環(huán)糊精中和去垢劑的情況下會除去了所需的分離步驟并減少了污染的機 會。
[0009] GB2346370(CambridgeMolecularTechnologiesLtd)描述了將包含細胞（其含 核酸）的樣品應用至濾器上，所述細胞被濾器保留而污染并沒被保留。將所述細胞在濾器 上裂解并與核酸一起保留。后續(xù)步驟滲除細胞裂解物同時保留核酸。
[0010] W09618731 (Deggerdal)描述了分離核酸的方法，其中將所述樣品結合至固體支 持物上并且將樣品與去垢劑接觸并實施后續(xù)步驟以分離核酸。
[0011] W00053807 (Smith,Whatman)描述了用于儲存和裂解含遺傳材料（其可被洗提和 分析）的樣品的介質。所述介質用裂解試劑涂層。此外，所述介質可用弱堿、螯合劑、表面 活性劑和任選尿酸涂層。
[0012] W09938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述帶有結合的裂解試劑的固體支 持物。所述裂解試劑可包含去垢劑、螯合劑、水和任選RNA消化酶。所述固體支持物并不含 環(huán)糊精并且需要另外的步驟用于純化用于擴增分析的核酸。
[0013] 當前用于DNA擴增的方法包括DNA純化步驟，其常常包括幾個步驟，這增加了污染 的機會。這是煩人的過程而且現(xiàn)有技術方法具有在花費、復雜性以及特別是用戶時間方面 的多個明顯缺點。例如，基于柱的核酸純化是用以純化核酸的典型的固相提取方法。此方 法依賴于通過對二氧化硅或其它支持物的吸附（其取決于緩沖液的pH和鹽含量）的核酸 結合。合適的緩沖液的實例包括Tris-EDTA(TE)緩沖液或磷酸鹽緩沖液（由于反應性胺 而在DNA微陣列實驗中使用）。在這類旋轉柱（spincolumn)上的核酸的純化包括許多復 雜和煩人的步驟。在旋轉柱上的核酸純化通常包含三個耗時和復雜的步驟/階段： 將含核酸的樣品加入柱，并且核酸由于結合緩沖液的較低的pH(相對于柱上的硅烷 醇基團）和鹽濃度而結合，所述結合緩沖液可含緩沖液、變性劑（例如鹽酸胍）、Triton X-100、異丙醇和pH指不劑； 用5mMKP04pH8. 0或類似物，80%EtOH洗滌該柱；和 用緩沖液或水洗提該柱。
[0014] 備選的方法涉及在離液鹽的存在下的核酸結合，使得DNA結合至二氧化硅或玻璃 顆粒或玻璃珠。此性質被用于在堿性條件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠純化核酸。典型的 離液鹽包括硫氰酸胍fS或鹽酸胍鶴并且最近玻璃珠已經(jīng)用含玻璃的微柱取代。
[0015] 在法醫(yī)學應用中針對PCR擴增失敗的最好的防備在于將可靠的樣品處理和加工 技術與經(jīng)證明有效純化DNA的提取系統(tǒng)組合。
[0016] SantosC.R?等人，（BrazilianJournalofMicrobiology, 2012，43， 389-392)描述了跳過在核酸的PCR擴增之前的洗提步驟和將沖壓片（puncher)直接加入 PCR混合物的方法。該PCR擴增被實施用于檢測HPV-DNA并且與在擴增之前洗提核酸的標 準的FTA洗提卡（FTAelutecard)方案相比更有效。然而此方法僅使用定性PCR測量HPV 的存在。
[0017] NozawaN?等人，（JournalofClinicalMicrobiology, 2007，45， 1305-1307)描述了將實時PCR用于檢測巨細胞病毒（CMV)的方法。所述方法涉及帶有純化 的CMV的濾紙的使用和將其直接加入PCR混合物。所述論文指出只有具有光電倍增管掃描 系統(tǒng)的儀器可用于使用濾片的實時PCR測定。所述論文提出濾紙會不利地影響使用電荷耦 合器件相機的儀器并由此教導避免在諸如ABI7700機器等實時PCR機器中使用濾紙。
[0018] QiagenSample&AssayTechnologiesNewsletter(2010 年 3 月，15)描述了 在RNA制劑中低A26Q/A23Q比率對下游PCR處理的作用。該報道指出在RNA樣品中在230nm處增加的吸光度相當經(jīng)常是因硫氰酸胍（FTA洗提卡的組分并用于RNA純化方法）的污染 所致。該實驗證明當硫氰酸胍存在時RNA樣品的A26(l/A23(l比率較低，但是在RNA樣品中多至 lOOmM的硫氰酸胍濃度不影響實時PCR的可靠性。
[0019] 通常包含于所述標準FTA洗提卡方案中的純化步驟可以是麻煩的并且純化可導 致DNA的損失。因此有對用于對核酸擴增、定量和/或概況分析的改良和簡化的方法的需 要，所述方法除去了對純化步驟的需要。本發(fā)明致力于此問題并提供方法和試劑盒，其可用 于來自固體支持物，特別是纖維素衍生的支持物的核酸的單一步驟擴增。
[0020] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于便于擴增DNA樣品的方法和試劑盒，其可被用于按如下擴增核酸：將 固體支持物與核酸接觸并在所述固體支持物存在下擴增核酸。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了用于擴增核酸的方法，其包含以下步驟： i) 將包含離液鹽的固體支持物與含核酸的細胞樣品接觸， ii) 將所述固體支持物轉移至反應容器， iii) 將在固體支持物上的所述核酸與核酸擴增試劑溶液一起孵育， iv) 擴增所述核酸以產(chǎn)生擴增的核酸， v) 定量擴增的核酸和任選地， vi) 使用短串聯(lián)重復（STR)概況分析以產(chǎn)生STR分布圖， 其中步驟i)_vi)在固體支持物的存在下實施。
[0022] 在固體支持物的存在下擴增核酸的優(yōu)點在于減少核酸擴增所需的步驟數(shù)量，從而 節(jié)約操作員時間和方便操作員使用。
[0023] 在本發(fā)明的一個方面中，其中所述固體支持物在加入所述細胞樣品之前已經(jīng)在反 應容器中。
[0024] 在另一方面中，擴增方法是聚合酶鏈反應。
[0025] 在另一方面中，擴增方法包括逆轉錄聚合酶鏈反應、等溫擴增或定量聚合酶鏈反 應。
[0026] 在進一步的方面中，所述核酸擴增試劑溶液包含聚合酶、脫氧核糖核苷酸三磷酸 (dNTP)、反應緩沖液和至少一種引物，其中所述引物任選用染料標記。這類染料可包括來 自GEHealthcare的熒光染料FAM? 或CyDyeDIGEFluor? (產(chǎn)品代碼RP