動化樣品加工組合使用。此方法會涉及最少數(shù)量 的步驟并增加樣品通量。操作員引起的誤差（例如交叉污染）的風(fēng)險也被降低，因為此方 法同與目前使用的更勞力密集型試劑盒（例如QIAmpDNA血液微型試劑盒，Qiagen)相關(guān) 的方案相比需要較少操作。樣品混亂的風(fēng)險也被降低，因為該方法需要較少操作。重要的 是，該方法可容易地轉(zhuǎn)移至多孔規(guī)格用于高通量篩選。本發(fā)明由此可改良樣品加工用于實 施PCR反應(yīng)以幫助遺傳探詢。本發(fā)明可在96孔/高通量規(guī)格中實施以方便樣品處理和由 此消除樣品的批處理。
[0064] 在進(jìn)一步的方面中，反應(yīng)容器是多孔板中的孔。多孔板以多種規(guī)格可得，所述規(guī)格 包括 6、12、24、96、384 孔（例如Corning384 孔多孔板，SigmaAldrich)。
[0065] 在一個方面中，將所述樣品通過從固體支持物沖壓出或切割出圓片而轉(zhuǎn)移至反 應(yīng)容器。從固體支持物沖壓出部分或圓片可通過使用沖壓機(jī)，例如HarrisMicro沖壓機(jī)(WhatmanInc. ;SigmaAldrich)實現(xiàn)。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供用于按本文之前的描述擴(kuò)增核酸的試劑盒和其使 用說明書。
[0067] 附圖簡述 圖1展現(xiàn)了未洗滌的HeLa細(xì)胞點樣的iFTAe的PCR擴(kuò)增的STR分布圖（重復(fù)第1號）。
[0068] 圖2展現(xiàn)了未洗滌的HeLa細(xì)胞點樣的iFTAe的PCR擴(kuò)增的STR分布圖（重復(fù)第 2號）。
[0069] 圖3展現(xiàn)了未洗滌的HeLa細(xì)胞點樣的iFTAe的PCR擴(kuò)增的STR分布圖（重復(fù)第 3號）。
[0070] 圖4展現(xiàn)了對照DNA樣品的PCR擴(kuò)增的STR分布圖。
[0071] 圖5展示了直接擴(kuò)增的洗滌的血液點樣的iFTAe的qPCR擴(kuò)增的DNA收率。
[0072] 圖6展示了直接或在洗提后擴(kuò)增的未洗滌的HeLa細(xì)胞點樣的iFTAe的qPCR擴(kuò)增 的DNA收率。
[0073] 發(fā)明詳述 伸用的化學(xué)品和材料 下面給出了化學(xué)品及其來源的列表： 指示FTA?洗提微卡（elutemicro) (WB120218 和WB120411); 指不FTA?洗提盒（elutecassette) (WB120230); 正常人血液（TissueSolutionsLtd); 基因組DNA(Promega產(chǎn)品代碼G152A); Harris 單芯沖壓片（Uni-core punch)，l.2mm (Sigma，目錄號 Z7〇886〇_25ea,批號 3110)； TaqManUniversalPCRmasterMix,無AmpEraseUNG(AppliedBiosystems部分號 4324018)； TaqManRNaseP檢測試劑（AppliedBiosystems部分號 4316831)-含有RNaseP引物； PowerPlex lSD (Promega 代碼 DCl8〇2)-含引物； 無菌水（Sigma產(chǎn)品代碼W4502); Huma宮頸上皮細(xì)胞（HeLa) (ATCC代碼CCL-2)和Hi-Di甲酰胺（ABI代碼 4311320) 實驗結(jié)果 Hela細(xì)朐點樣的FTA洗提卡的STR分布圖 將處于2. 5X106個細(xì)胞/ml濃度的培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞點樣至指示FTA洗提（iFTAe)卡 上。將1. 2mm沖壓片從細(xì)胞點樣FTA洗提卡上取出并與直接STR試劑盒PowerPlex18D反 應(yīng)混合物組合達(dá)到最終體積25W。在擴(kuò)增之前將所述25W樣品混合物加入96孔PCR板的 各孔。使用10秒樣品注射在3130x1毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis)上分析樣 品。
[0074] PCR反應(yīng)按如下建立： 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入合適的孔。將板密封并在l〇〇〇rpm下離心1分鐘。PCR在Geneamp/ ABI 9700 Thermo Cycler上在以下熱循環(huán)條件下實施： 96°C2分鐘，接著28個循環(huán)：94°C10秒，60°C1分鐘，接著60°C20分鐘，接著4 °C。 在擴(kuò)增之后，PCR產(chǎn)物的顯影使用毛細(xì)管電泳實施。該結(jié)果以圖表的形式展示在圖1-4中
【主權(quán)項】
1. 一種用于擴(kuò)增核酸的方法，其包含以下步驟： i) 將包含離液鹽的固體支持物與含核酸的細(xì)胞樣品接觸， ii) 將所述固體支持物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器， iii) 將在固體支持物上的所述核酸與核酸擴(kuò)增試劑溶液一起孵育， iv) 擴(kuò)增核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸， V)定量擴(kuò)增的核酸和任選地， vi)使用短串聯(lián)重復(fù)（STR)概況分析以產(chǎn)生STR分布圖， 其中步驟i)-vi)在固體支持物的存在下實施。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在加入所述細(xì)胞樣品之前所述固體支持物在反應(yīng)容器中。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)。
4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述擴(kuò)增方法包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、等溫擴(kuò)增或 定量聚合酶鏈反應(yīng)。
5. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述核酸擴(kuò)增試劑溶液包含聚合酶、脫氧核糖核苷 酸三磷酸（dNTP)、反應(yīng)緩沖液和至少一種引物，其中所述引物任選用染料標(biāo)記。
6. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述離液鹽是胍鹽。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述胍鹽選自硫氰酸胍、氯化胍和鹽酸胍。
8. 權(quán)利要求1-5的方法，其中所述離液鹽是鈉鹽例如碘化鈉。
9. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中在步驟i)之后用水性溶液洗滌所述固體支持物。
10. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述固體支持物選自基于玻璃或二氧化硅的固相 介質(zhì)、基于塑料的固相介質(zhì)、基于纖維素的固相介質(zhì)、玻璃纖維、玻璃微纖維、硅膠、二氧化 硅、硝酸纖維素、羧甲基纖維素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚 偏二氟乙稀、羊毛和多孔陶瓷。
11. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述固體支持物是基于纖維素的基質(zhì)。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述基于纖維素的基質(zhì)呈預(yù)沖壓圓片的形式。
13. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述基于纖維素的基質(zhì)呈FTA?洗提卡的形式。
14. 用于擴(kuò)增核酸的方法，其包括以下步驟： i) 將包含裂解試劑的固體支持物與含核酸的細(xì)胞樣品接觸， ii) 將所述固體支持物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器， iii) 將在固體支持物上的所述核酸與核酸擴(kuò)增試劑溶液一起孵育， iv) 擴(kuò)增核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸， V)定量擴(kuò)增的核酸， 其中步驟i)_v)在固體支持物的存在下實施。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中在加入所述細(xì)胞樣品之前所述固體支持物在反應(yīng)容器 中。
16. 權(quán)利要求14或15的方法，其中所述擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)。
17. 權(quán)利要求14-16的方法，其中所述裂解試劑選自表面活性劑、去垢劑和離液鹽。
18. 權(quán)利要求14-17的方法，其中所述裂解試劑選自十二烷基硫酸鈉、硫氰酸胍、鹽酸 胍、氯化胍和碘化鈉。
19. 權(quán)利要求14-18的方法，其中將所述固體支持物用十二烷基硫酸鈉（SDS)、乙二胺 四乙酸（EDTA)和尿酸浸漬。
20. 權(quán)利要求14-19的方法，其中所述固體支持物呈FTA?預(yù)沖壓圓片的形式。
21. 權(quán)利要求14-20的方法，其中所述固體支持物選自基于玻璃或二氧化硅的固相介 質(zhì)、基于塑料的固相介質(zhì)、基于纖維素的固相介質(zhì)、玻璃纖維、玻璃微纖維、硅膠、二氧化硅、 硝酸纖維素、羧甲基纖維素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二 氟乙烯、羊毛和多孔陶瓷。
22. 權(quán)利要求14-21的方法，其中在步驟i)之后用水性溶液洗滌所述固體支持物。
23. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中使用PCR成像系統(tǒng)定量所述擴(kuò)增的核酸。
24. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述細(xì)胞樣品選自真核的細(xì)胞、原核的細(xì)胞、病 毒、細(xì)菌、植物和組織培養(yǎng)細(xì)胞。
25. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述細(xì)胞樣品選自血液、血清、精液、腦脊液、滑 液、淋巴液、唾液、口腔的、頸部的細(xì)胞、陰道的細(xì)胞、尿、糞便、毛發(fā)、皮膚和肌肉。
26. 任何在前權(quán)利要求的方法，用作選自分子診斷學(xué)工具、人鑒別工具和法醫(yī)學(xué)工具 的工具。
27. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中在步驟ii)之前將所述核酸儲存在固體支持物 上。
28. 任何在前權(quán)利要求的方法，其中所述核酸在固體支持物上儲存至少30分鐘。
29. 按照任何在前權(quán)利要求的方法擴(kuò)增核酸的試劑盒和其使用說明書。
【專利摘要】本發(fā)明涉及方法和試劑盒，其可用于擴(kuò)增核酸，優(yōu)點是減少用戶時間和可能的污染。為了便于加工和擴(kuò)增核酸樣品，將樣品結(jié)合至固體支持物并在無需純化的情況下在核酸擴(kuò)增反應(yīng)例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中直接使用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-10
【公開號】CN104769111
【申請?zhí)枴緾N201380058557
【發(fā)明人】P.J.塔特內(nèi)爾, K.L.拉梅頓, A.S.皮爾塞, E.阿斯曼
【申請人】通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2013年11月6日
【公告號】EP2917344A1, WO2014072354A1