K0272)。所述 核酸擴(kuò)增試劑溶液可以干燥形式(例如"Ready-to-Go?"(RTG)規(guī)格)存在。聚合酶鏈反 應(yīng)試劑的干燥或凍干配方的優(yōu)點(diǎn)是:它們可通過(guò)加入水容易地溶解,由此節(jié)約操作員時(shí)間 和方便操作員使用。為使操作員誤差最小化,可將所述干燥試劑混合物預(yù)分配入反應(yīng)容器 (例如多孔板的孔)中。這類RTG混合物的實(shí)例包括從GEHealthcare可得的"Illustra Ready-to-GoRT-PCR珠"(產(chǎn)品代碼:27-9266-01IllustraReady-To-GoRT-PCR珠)。
[0027] 在進(jìn)一步的方面中,STR分布圖試劑選自PowerPlex18D、PowerPlex21、 PowerPlexFusion、IdentifierDirect、GlobalfilerExpress和Y-FilerDirect。
[0028] 在進(jìn)一步的方面中,所述核酸選自DNA、RNA和寡核苷酸。在本文中術(shù)語(yǔ)"核酸"與 術(shù)語(yǔ)"核苷酸"同義使用并包括DNA(例如質(zhì)粒DNA和基因組DNA)、RNA(例如mRNA、tRNA、 sRNA和RNAi)和蛋白核酸(PNA)。
[0029] 在一個(gè)方面中,離液鹽是胍鹽。
[0030] 在另一方面中,所述胍鹽選自硫氰酸胍、氯化胍和鹽酸胍。
[0031] 在一個(gè)方面中,離液鹽是鈉鹽(例如碘化鈉)。
[0032] 在另一方面中,在步驟i)之后用水性溶液洗滌固體支持物。
[0033] 在一個(gè)方面中,固體支持物選自基于玻璃或二氧化硅的固相介質(zhì)、基于塑料 的固相介質(zhì)、基于纖維素的固相介質(zhì)、玻璃纖維、玻璃微纖維、硅膠、二氧化硅(silica oxide)、硝酸纖維素、羧甲基纖維素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯 (polytetraflurorethylene)、聚偏二氟乙?。╬olyvinylidinefluoride)、羊毛和多孔陶 bti〇
[0034] 在另一方面中,固體支持物是基于纖維素的基質(zhì)。
[0035] 在進(jìn)一步的方面中,所述基于纖維素的基質(zhì)呈預(yù)沖壓圓片(prepuncheddisc)的 形式。
[0036] 在另一方面中,所述基于纖維素的基質(zhì)呈FTA?洗提卡(Elutecard)的形式。
[0037] 在另一方面中,所述基于纖維素的基質(zhì)呈指示FTA?Elute(iFTAe)卡的形式,其 中染料指示生物樣品的存在。
[0038] 在一個(gè)方面中,其中使用PCR成像系統(tǒng)定量擴(kuò)增的核酸。
[0039] 在一個(gè)方面中,所述細(xì)胞樣品選自真核的或原核的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、植物和組織 培養(yǎng)細(xì)胞。
[0040] 在另一方面中,所述細(xì)胞樣品選自血液、血清、精液、腦脊液、滑液、淋巴液、唾液、 口腔的、頸部的細(xì)胞、陰道的細(xì)胞、尿、糞便、毛發(fā)、皮膚和肌肉。細(xì)胞樣品可源自哺乳動(dòng)物、 鳥、魚或植物或其細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選細(xì)胞樣品來(lái)源上是哺乳動(dòng)物的、最優(yōu)選在來(lái)源上是人。 該含核酸的樣品可源自任何來(lái)源。這包括,例如,人和動(dòng)物的生理學(xué)/病理學(xué)的體液(例如 分泌物、排泄物、滲出物)或細(xì)胞懸浮液;植物的生理學(xué)/病理學(xué)的液體或細(xì)胞懸浮液;細(xì) 菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、朊病毒等的液體制品、提取物或懸浮液;人或動(dòng)物體組織(例如,骨、 肝、腎等)的液體提取物或勻漿;來(lái)自DNA或RNA合成的介質(zhì)、化學(xué)上或生物上合成的DNA 或RNA的混合物;和任何其它來(lái)源,其中DNA或RNA是或可以是在液體介質(zhì)中。
[0041] 在另外的方面中,將所述方法用作選自分子診斷學(xué)工具、人鑒別工具、法醫(yī)學(xué)工 具、STR概況分析工具和DNA概況分析的工具。
[0042] 在另一方面中,其中在步驟ii)之前將所述核酸儲(chǔ)存于固體支持物上。
[0043] 在一個(gè)方面中,讓核酸在固體支持物上存儲(chǔ)至少30分鐘。可將核酸固定在固體支 持物上較長(zhǎng)時(shí)間,例如,至少24小時(shí)、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一 年和至少 10年。按此方式可將核酸以干燥形式(其適合于后續(xù)分析)儲(chǔ)存。通常,樣品被 存儲(chǔ)于-200°C-40°C的溫度下。此外,可任選將儲(chǔ)存的樣品儲(chǔ)存于干燥的或烘干的條件下 或在惰性氣氛下。
[0044] 本發(fā)明的方法可在單管或高通量96-孔規(guī)格中與由Baron等人(2011,F(xiàn)orensics ScienceInternational:GeneticsSupplementSeries(法醫(yī)學(xué)科學(xué)國(guó)際:遺傳學(xué)補(bǔ)充系 列),93,e560-e561)描述的自動(dòng)化樣品加工組合使用。此方法會(huì)涉及最小數(shù)量的步驟并 且增加了樣品通量。操作員引起的誤差(例如交叉污染)的風(fēng)險(xiǎn)也被降低了,因?yàn)榇朔椒?同與目前使用的更勞力密集型試劑盒(例如QIAmpDNA血液微型試劑盒,Qiagen)相關(guān)的 方案相比需要較少操作。樣品混亂的風(fēng)險(xiǎn)也被降低了,因?yàn)楸痉椒ㄐ枰^少操作。重要的 是,該方法可容易地轉(zhuǎn)移至多孔規(guī)格用于高通量篩選。本發(fā)明可由此改良樣品加工用于實(shí) 施PCR反應(yīng)以幫助遺傳探詢(geneticinterrogation)。本發(fā)明可在96孔/高通量規(guī)格中 實(shí)施以方便樣品處理并由此消除樣品的批處理。
[0045] 在進(jìn)一步的方面中,反應(yīng)容器是在多孔板中的孔。多孔板以多種規(guī)格可得,所述規(guī) 格包括 6、12、24、96、384 孔(例如Corning384 孔多孔板,SigmaAldrich)。
[0046] 在一個(gè)方面中,將樣品通過(guò)從固體支持物沖壓出或切割出圓片而轉(zhuǎn)移至反應(yīng) 容器。從固體支持物沖壓出部分或圓片可通過(guò)使用沖壓機(jī),例如HarrisMicro沖壓機(jī) (WhatmanInc. ;SigmaAldrich)而實(shí)現(xiàn)。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面提供了用于擴(kuò)增核酸的方法,其包括以下步驟: i) 將包含裂解試劑的固體支持物與含核酸的細(xì)胞樣品接觸, ii) 將所述固體支持物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器, iii) 將在固體支持物上的所述核酸與核酸擴(kuò)增試劑溶液一起孵育, iv) 擴(kuò)增所述核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸, v) 定量擴(kuò)增的核酸, 其中步驟i)_v)在固體支持物的存在下實(shí)施。
[0048] 在一個(gè)方面中,其中在加入所述細(xì)胞樣品之前固體支持物已經(jīng)在反應(yīng)容器中。 [0049] 在另一方面中,其中擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)。
[0050] 在另一方面中,所述裂解試劑選自表面活性劑、去垢劑和離液鹽。
[0051] 在另一方面中,裂解試劑選自十二烷基硫酸鈉、硫氰酸胍、氯化胍、鹽酸胍和碘化 鈉。
[0052] 在進(jìn)一步的方面中,將所述固體支持物用十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸 (EDTA)和尿酸浸漬。
[0053] 在一個(gè)方面中,所述固體支持物呈FTA?預(yù)沖壓圓片的形式。
[0054] 在另一方面中,所述基于纖維素的基質(zhì)呈指示FTA? (iFTA)卡的形式,其中染料 指示生物樣品的存在。
[0055] 在另一方面中,固體支持物選自基于玻璃或二氧化硅的固相介質(zhì)、基于塑料的固 相介質(zhì)或基于纖維素的固相介質(zhì)、玻璃纖維、玻璃微纖維、硅膠、二氧化硅、硝酸纖維素、羧 甲基纖維素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙稀、聚四氟乙稀、聚偏二氟乙稀、羊毛或 多孔瓷器。
[0056] 在另一方面中,在步驟i)之后用水性溶液洗滌固體支持物。
[0057] 在一個(gè)方面中,其中使用PCR成像系統(tǒng)定量擴(kuò)增的核酸。
[0058] 在一個(gè)方面中,其中細(xì)胞樣品選自真核的或原核的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、植物和組織 培養(yǎng)細(xì)胞。
[0059]在另一方面中,所述細(xì)胞樣品選自血液、血清、精液、腦脊液、滑液、淋巴液、唾液、 口腔的、頸部的和陰道的細(xì)胞、尿、糞便、毛發(fā)、皮膚和肌肉。細(xì)胞樣品可源自哺乳動(dòng)物、鳥、 魚或植物或其細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選細(xì)胞樣品來(lái)源上是哺乳動(dòng)物的,最優(yōu)選在來(lái)源上是人。含 核酸的樣品可源自任何來(lái)源。這包括,例如,人和動(dòng)物的生理學(xué)/病理學(xué)的體液(例如分泌 物、排泄物、滲出物)或細(xì)胞懸浮液;植物的生理學(xué)/病理學(xué)的液體或細(xì)胞懸浮液;細(xì)菌、真 菌、質(zhì)粒、病毒、朊病毒等的液體制品、提取物或懸浮液;人或動(dòng)物體組織(例如,骨、肝、腎 等)的液體提取物或勻漿;來(lái)自DNA或RNA合成的介質(zhì)、化學(xué)上或生物上合成的DNA或RNA 的混合物;和任何其它來(lái)源,其中DNA或RNA是或可以是在液體介質(zhì)中。
[0060] 在進(jìn)一步的方面中,將該方法用作選自分子診斷學(xué)工具、人鑒別工具、法醫(yī)學(xué)工 具、STR概況分析工具和DNA概況分析的工具。
[0061] 在另一方面中,其中在步驟ii)之前將核酸儲(chǔ)存在固體支持物上。
[0062] 在一個(gè)方面中,讓核酸在固體支持物上儲(chǔ)存至少30分鐘。可將核酸固定在固體支 持物上較長(zhǎng)時(shí)間,例如,至少24小時(shí)、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一 年和至少 10年。按此方式可將該核酸以干燥形式(其適合于后續(xù)分析)儲(chǔ)存。通常,將樣 品儲(chǔ)存于_200°C-40°C的溫度下。此外,可任選將儲(chǔ)存的樣品儲(chǔ)存于干燥的或烘干的條件 下或在惰性氣氛下。
[0063] 本發(fā)明的方法可在單管或高通量96-孔規(guī)格中與由Baron等人,(2011, ForensicsScienceInternational:GeneticsSupplementSeries(法醫(yī)學(xué)科學(xué)國(guó)際:遺 傳補(bǔ)充系列),93,e560-e561)描述的自