擴大t細胞的方法
【專利說明】擴大T細胞的方法
[0001] 本申請要求美國臨時申請序號61/569, 577的優(yōu)先權(quán)，其被引入本文作為參考。
[0002] 本發(fā)明涉及擴大T細胞--如自體T細胞、其衍生的細胞群--的新方法、包括所 述細胞群的藥物組合物和該細胞和組合物用于治療--特別是治療或預(yù)防病毒感染和/或 癌癥，例如，免疫抑制或免疫活性人患者--的應(yīng)用。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 雖然病毒被廣泛公認是感染性疾病的病因，某些病毒也與人癌癥有關(guān)。人免疫系 統(tǒng)是控制病毒感染以及顯示與致癌性病毒相關(guān)的惡性腫瘤的中心。在構(gòu)成人免疫系統(tǒng)的細 胞、抗體和免疫調(diào)節(jié)分子的復(fù)雜排列中，胸腺起源的淋巴細胞（T細胞）對于控制病毒感染 和癌癥具有中心作用。因此，一種預(yù)防或治療病毒感染和癌癥的方法已被采用，從這些患者 采集T細胞，并將其在體外刺激和/或擴大，然后將其輸回患者體內(nèi)。
[0005] 體內(nèi)T細胞激活和抗原特異性擴大通常被認為源自兩個信號過程，其中第一信號 通過T細胞受體/CD3復(fù)合物與遞呈肽抗原的主要組織相容性復(fù)合物I類或II類分子（MHC I類或MHCII類）的連接而產(chǎn)生。MHCI類或MHCII類和肽復(fù)合物在細胞（抗原遞呈細 胞或APC)表面上表達。肽抗原源自進行內(nèi)生過程的細胞中的分子，并且可以是（1)體內(nèi)天 然存在的"自身"抗原；（2)源自癌癥相關(guān)突變的腫瘤抗原；或⑶與感染或癌癥相關(guān)的病 毒抗原；等等。T細胞受體識別抗原被認為是第一信號，而第二信號產(chǎn)生自T細胞上另外的 表面分子與APC上另外的分子的連接所造成的共同刺激。可能需要T細胞和APC之間的這 些共同刺激分子的上調(diào)和連接來引起或促進T細胞激活，因為單獨的第一信號可能不足以 將此實現(xiàn)。這兩種信號激活可導(dǎo)致T細胞擴大，使得更大量的抗原特異性T細胞可被利用， 以控制引起免疫應(yīng)答的病原或癌癥。對這兩種信號激活的權(quán)威理解基于相同的APC，其為響 應(yīng)T細胞提供第一信號和第二信號，使得共同刺激與抗原識別直接相關(guān)。T細胞的體外激活 和擴大一直是漫長的、復(fù)雜的和資源密集型的過程。一般的方法可例如耗時8-12周，并且 通常利用活"靶"病毒和/或病毒載體來實現(xiàn)抗原遞呈細胞（APC)的抗原遞呈。通常，T細 胞激活/擴大需要靜態(tài)條件，而非攪拌或物理攪動培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0006] 培養(yǎng)識別EB病毒（EpsteinBarrVarus，EBV)的LMP1和LMP2抗原的抗原特異性 T細胞的一個現(xiàn)有技術(shù)方法可概括如下：
[0007] 預(yù)備步驟
[0008] ?為了以可控方式實現(xiàn)兩信號T細胞激活和擴大方法，通過取自患者的B細胞 的轉(zhuǎn)染生成抗原遞呈細胞是可用的。這被稱為建立自體類淋巴母細胞細胞系，并且通過 用EBV(EBV-LCL)感染細胞進行。其耗時約6-8周以建立該細胞系，因此其是作為依賴于 EBV-LCL以進行抗原遞呈的培養(yǎng)方法的一部分必須開始的初始階段之一。其如下制備：在 環(huán)胞素A存在派生副產(chǎn)物（outgrowth)和LCL消除。
[0009] 0在利用EBV-LCL的擴大步驟前，培養(yǎng)系統(tǒng)包括，通過已轉(zhuǎn)導(dǎo)有病毒載體 Ad5f35-LMP1-LMP2 (編碼EBV蛋白LMP1和LMP2)的自體樹突細胞，初始激活和擴大LMP-1 和LMP-2特異性T細胞（第0至8天）。
[0010]〇第9至12天，收集溶細胞性T淋巴細胞（CTL)，并將其再懸浮于新制培養(yǎng)基中， 并用轉(zhuǎn)導(dǎo)有Ad5f35-LMP1-LMP2的EBV-LCL再刺激。
[0011] 〇第13至16天，向溶細胞性T淋巴細胞供給新制培養(yǎng)基和重組人IL-2。
[0012] 〇然后是利用CTL:LCL每周再刺激，和每周兩次添加IL-2,持續(xù)4至8周時間。
[0013] 〇用于該方法的樹突細胞也必須通過如下制備：從患者樣品獲取PBMC，并 用IL-4和GM-CSF將其激活，以提供粘附PBMC。然后使這些細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有病毒載體 Ad5f35-LMP1-LMP2(即，編碼EBV蛋白LMP1 和LMP2)。最后，通過添加IL-1P、IL-6、PGE-1 和TNF-a使得樹突細胞成熟。
[0014]T細胞擴大步驟概述
[0015](也被稱為細胞毒性T淋巴細胞（CTL)的制備）
[0016] ?在制備后，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細胞與來自患者的新制PBMC-起培養(yǎng)約10天時間。
[0017] ?然后將得自此步驟的T細胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV-LCL-起培養(yǎng)約1周時間。
[0018] ?然后在IL-2存在的情況下將得自后者步驟的T細胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV-LCL-起再培 養(yǎng)10天，以提供自體T細胞抗原特異性產(chǎn)物。
[0019] ?反復(fù)此過程，直到已擴大足夠的T細胞。
[0020] JImmunotherVol33，Number3,2010年4月描述了更快速并且更有效的培養(yǎng)細 胞的方法，其經(jīng)23天時間，利用來自WilsonWolf的被稱為GRex?系統(tǒng)的系統(tǒng)。但是，這種 快速方法仍然對細胞應(yīng)用傳統(tǒng)病毒刺激。
[0021] 現(xiàn)有技術(shù)策略具有多個問題：
[0022] (i)活病毒如EBV和病毒載體的應(yīng)用有可能引起抗載體免疫顯性應(yīng)答，其可干擾 靶病毒特異性CTL's的有效生成；
[0023] (ii)活病毒的應(yīng)用由于安全顧慮是進展至3期試驗的障礙；
[0024] (iii)B細胞制備EBV-LCL的要求，既然利妥昔單抗（Rituxan)(其減少B細胞）已 成為大多數(shù)淋巴瘤患者的標(biāo)準(zhǔn)治療，意味著該技術(shù)無法用于多數(shù)患者；
[0025] (iv)生產(chǎn)期（最少6周以建立EBV-LCL和另外5至7周以用于CTL擴大）非常不 便，不現(xiàn)實并且經(jīng)濟困難；
[0026] (v)細胞調(diào)控的復(fù)雜性提供很多產(chǎn)物錯誤和污染機會，因此，良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP) 的準(zhǔn)則難以符合，和
[0027] (vi)用于刺激T細胞擴大的自體抗原遞呈細胞可表達靶抗原之外的抗原，其可降 低治療性T細胞產(chǎn)物所需的抗原特異性T細胞的純度。
[0028] 然而，技術(shù)人員一直不愿從偏離已建立的方法，因為每個步驟都被認為是生成具 有治療性特征的產(chǎn)物，特別是生成適于在體內(nèi)識別被活病毒感染的細胞和癌癥表達病毒抗 原的T細胞群所必需的。
[0029] 本公開提供快速和有效生產(chǎn)對靶抗原具有特異性的抗原特異性T細胞的方法。
[0030] 發(fā)明概述
[0031] 本公開提供體外擴大（擴張）抗原特異性T細胞如自體抗原特異性T細胞的方法， 包括如下步驟：
[0032]a)在存在下列的情況下，培養(yǎng)自體PBMC群：
[0033] i)已用與靶抗原（一種或多種）相關(guān)的肽/肽混合物脈沖的樹突細胞或與靶抗原 (一種或多種）相關(guān)的肽/肽混合物，和
[0034] ii)至少一種細胞因子，和
[0035] b)在存在下列的情況下，培養(yǎng)得自步驟a)的細胞群：
[0036] i)已用與靶抗原（一種或多種）相關(guān)的肽/肽混合物脈沖的樹突細胞，或已用與 靶抗原（一種或多種）相關(guān)的肽/肽混合物脈沖的自體抗原遞呈T細胞（T-APC's)細胞， 和人造共同刺激因子，和
[0037] ii)任選地，細胞因子，并且
[0038] 其特征在于，該方法在相關(guān)T細胞群的擴大中，不應(yīng)用活病毒和/或病毒載體，或 編碼抗原的DNA或RNA。
[0039] 在一個實施方式中，提供體外擴大自體抗原特異性T細胞的方法，包括步驟：
[0040] a)在存在下列的情況下，培養(yǎng)自體PBMC群：
[0041] i)已用與靶抗原（一種或多種）相關(guān)的肽混合物脈沖的樹突細胞，和
[0042] ii)至少一種細胞因子，和
[0043] b)在存在下列的情況下，培養(yǎng)得自步驟a)的細胞群：
[0044] i)已用與靶抗原（一種或多種）相關(guān)的肽混合物脈沖的自體抗原遞呈T細胞 (T-APC's)細胞和人造共同刺激因子，
[0045] ii)細胞因子，和
[0046] 其特征在于，該方法在相關(guān)T細胞群的擴大中不應(yīng)用活病毒和/或病毒載體或編 碼抗原的DNA或RNA。
[0047] 在本公開的方法中，步驟a)的PBMC或樹突細胞和步驟b)的抗原遞呈細胞通常用 肽脈沖（也被稱為負載），該肽被選擇以顯示來自靶抗原的表位。這些肽在下文中得到更詳 細的討論。
[0048] 我們通過如下克服了現(xiàn)有技術(shù)的問題：
[0049] ?消除生成EBV-LCL's的需要，因此避免活病毒用于抗原遞呈（這允許來自此前 B細胞已耗盡--例如利妥昔單抗治療導(dǎo)致--的患者的抗原特異性T細胞生成）
[0050] ?消除利用病毒載體-或DNA-或RNA-編碼的抗原實現(xiàn)抗原表達和在抗原遞呈細 胞中的遞呈的需要
[0051] ?提供消除DC對于抗原遞呈應(yīng)用的選擇
[0052] ?提供T細胞激活方法，其中通過自體細胞群提供刺激信號和通過重組細胞系或 人造共同刺激復(fù)合物提供共同刺激信號
[0053] ?提供有效且穩(wěn)健的2步培養(yǎng)方法，在三周或更少時間內(nèi)生成共計例如>10e7的具 有適當(dāng)抗原特異性的⑶3T淋巴細胞。
[0054] ?集中對臨床相關(guān)病毒抗原具有特異性的T細胞的刺激，如另外被在2型潛伏腫瘤 (淋巴瘤和NPC)中不表達的抗原控制的EBV抗原。
[0055] 本發(fā)明對于生產(chǎn)自體T細胞產(chǎn)物具有顯著優(yōu)勢，并且有可能致使治療可用于更廣 泛的患者群。其還最小化生產(chǎn)治療性產(chǎn)物所需的時間、干預(yù)和資源量，并且還有利地最小化 污染的可能。
[0056] 此外，獲得的治療性產(chǎn)物的特異性和性質(zhì)至少等同于通過現(xiàn)有技術(shù)方法生產(chǎn)的產(chǎn) 物，并且在多個方面可具有改善的性質(zhì)。
[0057] 某些患者如癌癥患者的自體細胞不同于得自健康個體的細胞，因為患者細胞被發(fā) 現(xiàn)是無反應(yīng)性的，即，不能遞送針對與感染或癌癥相關(guān)的抗原的免疫應(yīng)答。免疫抑制通常被 認為是全身性的，而無反應(yīng)性通常在抗原特異性基礎(chǔ)被描述，其中T細胞的具體克隆不再 能夠遞送針對靶抗原的免疫應(yīng)答。癌癥微環(huán)境例如可產(chǎn)生無反應(yīng)性，使得識別癌癥抗原的 T細胞不再具有功能性。
[0058] 免疫無反應(yīng)性或抑制的證據(jù)是，例如，不能清除病毒感染和/或病毒相關(guān)癌癥 細胞的存在。在健康個體中，這些細胞被免疫系統(tǒng)清除（Teague，R.M.，B.D.Sather，J. A.Sacks,M.Z.Huang,M.L.Dossett,J.Morimoto,X.Tan,S.E.Sutton,M.P.Cooke,C.Ohlen 和P.D.Greenberg. 2006.Interleukin_15rescuestolerantCD8+Tcellsforusein adoptiveimmunotherapyofestablishedtumors.Nat.Med. 12:335-341,和Chemnitz,J. M. ,D.Eggle,J.Driesen,S.Classen,J.L.Riley,S.bey-Pascher,M.Beyer,A.Popov,T. Zander和J.L.Schultze. 2007.RNAfingerprintsprovidedirectevidenceforthe inhibitoryroleofTGFbetaandPD-lonCD4+TcellsinHodgkinlymphoma.Blood 110:3226-3233)。
[0059] 此外，在患有鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma,NPC)的患者體內(nèi)，利用抗原特 異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL)進行自體T細胞免疫治療的結(jié)果一直是相對無效的。在一 個試驗中，11個患者中僅1個具有完全應(yīng)答，這可由不能再激活這些患者的LMP特異性T細 胞來解釋。事實上，發(fā)明人假設(shè)NPC使具有病毒腫瘤抗原特異性的T細胞無反應(yīng)性。
[0060] 因此，在一些患者中，現(xiàn)有技術(shù)方法不能足夠地再激活適當(dāng)?shù)目乖禺愋訲細胞。
[0061] 注入的T細胞的效力不僅取決于其識別靶腫瘤抗原的能力，還取決于識別那些抗 原中的多個表位以防止腫瘤由于表位損失、病毒株變異和T細胞引起的突變而逃脫。因此， 需要研發(fā)可再現(xiàn)地再激活和擴大識別抗原的廣譜表位--如在NPC和EBV陽性淋巴瘤中表 達的LMP1-、L