施方式的EBV特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物中的 干擾素Y分泌細(xì)胞的比較。來(lái)自6至9個(gè)健康VZV-血清陽(yáng)性供體的T細(xì)胞的頻率，該供 體在第0天用混合肽脈沖的PBMC或DC和在第9,16和23天用混合肽脈沖的自體激活T細(xì) 胞（T-APCS)+K-562-cs細(xì)胞激活后響應(yīng)于VZV肽的刺激而分泌Y干擾素。每個(gè)符號(hào)表示 一個(gè)供體。本發(fā)明的實(shí)施方式一在第一擴(kuò)大期間利用肽脈沖的PBMC或DC和在隨后擴(kuò)大 中利用T-APC組合aK562--對(duì)于所有使用的不同VZV抗原而言均導(dǎo)致靶CTL顯著擴(kuò)大。
[0105] 發(fā)明詳述
[0106]自體T細(xì)胞是來(lái)自患者的細(xì)胞，即，患者本生（natural)的細(xì)胞，與來(lái)自供體的細(xì) 胞相反。某些與病毒感染相關(guān)的腫瘤已在患者體內(nèi)建立生長(zhǎng)的途徑，不論病毒特異性T細(xì) 胞是否存在。這涉及抑制T細(xì)胞的分子的表達(dá)和病毒基因表達(dá)的調(diào)控。因此，這些患者的 T細(xì)胞可能降低對(duì)癌細(xì)胞的作用，其可以無(wú)反應(yīng)性形式描述。
[0107] 在自體T細(xì)胞治療中，從患者移除T細(xì)胞樣品，用于尚體激活和擴(kuò)大。在制備抗原 特異性T細(xì)胞群后，將其注入患者體內(nèi)，在此T細(xì)胞細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，并將通過(guò)直接（細(xì) 胞毒性）和間接（免疫調(diào)節(jié)）機(jī)制消除遞呈其靶抗原的細(xì)胞。
[0108] "T細(xì)胞"是本領(lǐng)域常用的術(shù)語(yǔ)，意圖包括胸腺細(xì)胞、未成熟T淋巴細(xì)胞、成熟T淋 巴細(xì)胞、休眠T淋巴細(xì)胞或激活T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以是T輔助（Th)細(xì)胞，例如，T輔助 l(Thl)或T輔助2(Th2)細(xì)胞。T細(xì)胞可以是⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、⑶4+⑶8+T細(xì)胞、 ⑶4-⑶8-T細(xì)胞或任何其他T細(xì)胞亞組。
[0109] 本文所用的抗原特異性T細(xì)胞意圖指代這樣的的T細(xì)胞：識(shí)別具體抗原并對(duì)其響 應(yīng)，例如，通過(guò)對(duì)其響應(yīng)而增殖和/或生成細(xì)胞因子。
[0110] 在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，方法不使用促進(jìn)特異性的重組靶抗原。本文的重組抗 原指代通過(guò)重組技術(shù)制備的抗原的整體或大片段。相反，所用肽是抗原小片段，并且通常是 合成的。
[0111] 本發(fā)明涉及細(xì)胞離體處理和由其獲得的T細(xì)胞產(chǎn)物。通常本發(fā)明不包括從患者獲 得樣品的步驟。
[0112] 從患者獲得樣品的步驟是采集血液樣品的常規(guī)技術(shù)（其可經(jīng)處理和任選地作為 物單采血液成分術(shù)（apheresis)產(chǎn)物提供）。此方法對(duì)患者呈現(xiàn)極小風(fēng)險(xiǎn)，并且無(wú)需由醫(yī)師 實(shí)施，而可由適當(dāng)培訓(xùn)的支持人員實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)自患者的樣品為約200ml血 液或更少，例如，150ml或更少，如100-150ml的范圍內(nèi)。通常，需要至少約60ml血液。
[0113] 一般，用于T細(xì)胞擴(kuò)大、DC生成和T-APC生成的PBMC得自血液或單采血液成分術(shù) 產(chǎn)物--通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Ficoll密度梯度分離。
[0114] Ficoll密度梯度分離采用合成的蔗糖聚合物--其濃度在方案過(guò)程中不同，以 在沉淀期間發(fā)揮不同細(xì)胞的分離。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)劑可來(lái)自，例如，GE Healthcare,如Ficoll Paque?PLUS〇
[0115] 在一個(gè)實(shí)施方式中，負(fù)責(zé)采集血液樣品或運(yùn)送血液樣品的中心在運(yùn)輸前通過(guò) Ficoll密度梯度分離處理樣品。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施方式中，血液樣品或處理后的血液樣品在環(huán)境溫度下運(yùn)輸，例如，在 4°C以上并且約30°C以下。
[0117] 在一個(gè)實(shí)施方式中，血液樣品或處理后的血液樣品被充入容器，如袋，其包括兩 室，其中一室包含添加劑，如防腐劑和/或抗凝劑，并且血液或處理后的血液被充入第二 室，然后打破第一和第二室之間的密封，并將兩室的內(nèi)含物混合。
[0118] 本文所用的培養(yǎng)細(xì)胞意圖指代體外激活和擴(kuò)大和/或分化細(xì)胞。
[0119] 技術(shù)人員已知，T細(xì)胞的擴(kuò)大通常在適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)基中進(jìn)行。通常，步驟 a)的方法可在不改變培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行。通常，步驟b)的方法可在不改變培養(yǎng)基的情況 下進(jìn)行。但是，如果血糖儀指示，例如，即如果系統(tǒng)中的葡萄糖降至l〇〇mg/dl以下，則應(yīng)改 變培養(yǎng)基。因此，本公開(kāi)的方法是有效之處在于其最小化擴(kuò)大T細(xì)胞所需的干預(yù)量。
[0120] T細(xì)胞擴(kuò)大可通過(guò)計(jì)數(shù)存活⑶3+細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)。
[0121] 可通過(guò)細(xì)胞染色來(lái)測(cè)試存活細(xì)胞，用例如下列染色：臺(tái)盼藍(lán)（和光學(xué)顯微鏡）或 7_氨基-放線菌素D，在670nm下放出的活體染料（或ViaProbe，7AAD的商品備用溶液）和 流式細(xì)胞術(shù)--應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)。當(dāng)染色劑滲透到細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞被認(rèn)為 是非存活的。不攝取染料的細(xì)胞被認(rèn)為是存活的。示例性方法可利用每約100 UL細(xì)胞懸 浮液約5 y L的7AAD和約5 y L的Annexin-V (磷脂結(jié)合蛋白，其結(jié)合凋亡期間暴露的外部 磷脂磷脂酰絲氨酸）?？稍跊](méi)有光的情況下環(huán)境溫度下將這種混合物溫育約15分鐘。然后 可利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。參見(jiàn)例如，MG Wing, AMP Montgomery, S.Songsivilai and JV Watson. An Improved Method for the Detection of Cell Surface Antigens in Samples of Low Viability using Flow Cytometry. J Immunol Methods 126:21-271990。
[0122] T細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)基通常包括相關(guān)擴(kuò)大步驟（即，步驟a)或步驟b))使用的血清、培 養(yǎng)基和任何細(xì)胞因子。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所用血清是例如15%血清或更少如10%血清，具體地使用人 血清。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基是高級(jí)RPMI或RPMI 1640,可來(lái)自Life Technologies。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所用細(xì)胞因子在下文討論。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)基包括10 %人AB血清，200mM L-谷氨酰胺， 45%￡&1'16'8他111'8氨基酸伍祖4或(：11〇1^培養(yǎng)基）和45%高級(jí)1^]\〇或1^]\〇-1640。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所用培養(yǎng)基無(wú)需應(yīng)用血清。
[0128] 本文所用的細(xì)胞擴(kuò)大指代基于細(xì)胞分裂增加細(xì)胞群中靶細(xì)胞的數(shù)量。
[0129] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟a)中，用肽/肽混合物直接處理PBMC。非常驚訝的是， 自體PBMC可在肽存在的情況下以類似于自體樹(shù)突細(xì)胞存在時(shí)的方式激活T細(xì)胞，具體地因 為來(lái)自文獻(xiàn)的信息是樹(shù)突細(xì)胞是最佳的抗原遞呈細(xì)胞。Chen ML，Wang冊(cè)，Lee PK，LinCM. ImmunolLett. 2001Jan 1 ;75 (2):91-6。
[0130] 在另一實(shí)施方式中，在本方法的步驟a)中，使用從患者PBMC制備的樹(shù)突細(xì)胞。
[0131] 血液樣品不是普遍要經(jīng)歷最初的細(xì)胞物理選擇，例如，從單采血液成分術(shù)群選擇 亞細(xì)胞群（或T細(xì)胞）。
[0132] 在一個(gè)實(shí)施方式中，1至2X107PBMC在30ml培養(yǎng)基中的GRex40中細(xì)胞因子存在 的情況下用〇. 5至1 X 106肽-脈沖的DC刺激。9至14天培養(yǎng)后，細(xì)胞的收集，例如，在50 至80 X 107抗原特異性響應(yīng)T細(xì)胞的范圍內(nèi)。但是，這可在無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞的患者體內(nèi)較 低。
[0133] 如果指示葡萄糖降至100mg/dl以下（在血糖儀上），則培養(yǎng)基（45%高級(jí)RPMI、 45% EHAA、10% FCs和200mM L-谷氨酰胺）將被改變。
[0134] 樹(shù)突細(xì)胞通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)指代如下事實(shí)： 樹(shù)突細(xì)胞在向T細(xì)胞遞送兩信號(hào)激活過(guò)程中是最佳的，即，除在細(xì)胞表面上遞呈抗原外，樹(shù) 突細(xì)胞還提供強(qiáng)共同刺激信號(hào)。兩種信號(hào)，通過(guò)抗原遞呈刺激和共同刺激，均是實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞 激活所需的。
[0135] 用于本發(fā)明方法的樹(shù)突細(xì)胞可通過(guò)用肽混合物脈沖（或負(fù)載）由患者PBMC樣品 生成，其詳細(xì)內(nèi)容在下文討論。
[0136] 本文所用的脈沖或負(fù)載意圖僅指代在適當(dāng)培養(yǎng)基中使相關(guān)T細(xì)胞如PBMC或樹(shù)突 細(xì)胞暴露于肽混合物。
[0137] 用于本方法的樹(shù)突細(xì)胞可如下制備：從患者樣品采集PBMC，并將其粘附于塑料。 通常，單核細(xì)胞群粘著并且所有其他細(xì)胞可被洗脫。然后將粘附群用IL-4和GM-CSF分化， 生成單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞。可通過(guò)添加IL-1P、IL-6、PGE-1和TNF-a(其上調(diào)樹(shù)突細(xì) 胞表面上重要的共同刺激分子）使這些細(xì)胞成熟，然后如本文描述用肽混合物轉(zhuǎn)導(dǎo)，以提 供所需的樹(shù)突細(xì)胞。
[0138] 以這種方式生成和成熟化DC的參考可在如下中找到：Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, et al.Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997 ;27:3135 - 3142。
[0139] 各肽庫(kù)/混合肽的肽可以1至lOOng肽/15X 106PBMC或ATC(參見(jiàn)下文討論）或 1至100ng肽每2X 106DC添加。
[0140] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用IL-4和GM-CSF刺激PBMC 3至5天，然后用GM-CSF、IL-4、 TNF-a、IL-lb、PGE-1或PGE-2和IL-6成熟1或2天，然后用所述肽脈沖。
[0141] 因此在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟a)的樹(shù)突細(xì)胞是自體的。
[0142] 在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生的樹(shù)突細(xì)胞應(yīng)答是平衡的⑶4和⑶8應(yīng)答。
[0143] 本文所用的平衡的CD4和CD8應(yīng)答意圖指代如下事實(shí)：CD4細(xì)胞或CD8在擴(kuò)大方法 中不耗盡。但是本文所用的平衡群仍可傾斜，在于CD4細(xì)胞可多于CD8細(xì)胞，或反之亦然。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟a)中PBMC與樹(shù)突細(xì)胞的比率在10:1至50:1范圍內(nèi)，例 如、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、如約 20:1。
[0145] 樹(shù)突細(xì)胞提供有效T細(xì)胞激活，并且當(dāng)培養(yǎng)中的抗原特異性T細(xì)胞頻率低（100T 細(xì)胞中小于1可對(duì)目標(biāo)抗原具有特異性）時(shí)，例如，在步驟a)中應(yīng)用樹(shù)突細(xì)胞是有效的。但 是，隨著抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)大的數(shù)量和頻率以及特異性T細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞的比增加，樹(shù)突 細(xì)胞的激活效率降低，除非樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)量可增加?？乖禺愋訲細(xì)胞將向激活后的樹(shù)突 細(xì)胞頻繁遞送細(xì)胞毒性應(yīng)答。樹(shù)突細(xì)胞的殺死則將減少可用于繼續(xù)激活和擴(kuò)大靶抗原特異 性T細(xì)胞的激活信號(hào)。
[0146] 雖然樹(shù)突細(xì)胞非常有效地刺激T細(xì)胞擴(kuò)大成對(duì)靶抗原具有特異性的群，但其難以 生成大量樹(shù)突細(xì)胞。因此雖然在實(shí)踐中步驟b)可應(yīng)用樹(shù)突細(xì)胞，但在步驟b)中應(yīng)用不同 抗原遞呈細(xì)胞和人造共同刺激或因子具有優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)例中，當(dāng)樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)于 T細(xì)胞過(guò)小時(shí)，觀察不到T細(xì)胞激活。這將在下文得到更詳細(xì)討論。
[0147] 有利地，認(rèn)為樹(shù)突細(xì)胞能夠激活記憶T細(xì)胞和原初T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明細(xì)胞群中 記憶T細(xì)胞的存在可能是非常重要的。
[0148] 本文所用的小群意圖指代如下事實(shí)：小群中細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量顯著低于預(yù)期群中的 細(xì)胞數(shù)量，例如，總?cè)旱?0%或更少。
[0149] 下文描述的肽混合物可用于選自樹(shù)突細(xì)胞脈沖、抗原遞呈細(xì)胞脈沖的一個(gè)或多個(gè) 目的，或可與PBMC -起直接用于步驟a)。
[0150] 肽混合物來(lái)自相關(guān)病毒抗原，例如，EBV病毒抗原。EB病毒，常被稱為EBV，是皰疹 病毒家族的成員，并且慢性感染超過(guò)95 %的世界人口。
[0151] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自乳頭瘤病毒的抗原。
[0152] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自丙肝病毒的抗原。
[0153] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自牛痘病毒（VV)的抗原。
[0154] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自水痘帶狀皰疹病毒（VZV)的抗原。
[0155] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自人免疫缺陷病毒的抗原。
[0156] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來(lái)自乙肝、