HHV-8、CMV、HTLV-1、SV40和/或梅克爾細(xì)胞 (merckelcell)病毒的抗原。
[0157] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽來自病毒組合，例如，本文描述的任意兩種或更多種，如EBV 和 VZV，EBV 和 VV，VZV 和 VV，或 EBV、VZV 和 VV。
[0158] 代替在感染有相關(guān)病毒如EBV的細(xì)胞存在的情況下或在編碼病毒蛋白質(zhì)的腺病 毒載體存在的情況下培養(yǎng)自體T細(xì)胞，細(xì)胞在用肽或肽混合物脈沖的抗原遞呈細(xì)胞存在的 情況下進(jìn)行培養(yǎng)。這減少了最終產(chǎn)物被病原污染的風(fēng)險(xiǎn)，這是非常重要的，因?yàn)闊o法使將要 注入患者的T細(xì)胞產(chǎn)物滅菌。
[0159] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆蓋抗原LMP1 (潛伏膜蛋白1， Uniprot編號(hào)P03230)的序列的部分或全部。
[0160] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆蓋抗原LMP2(潛伏膜蛋白2， Uniprot編號(hào)Q1HVJ2)的序列的部分或全部。
[0161] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆蓋抗原EBNA 1、2、3、4、5或6或 其組合，特別是EBNA 1，的序列的部分或全部。
[0162] EB核抗原1 (EBNA1)是與EB病毒相關(guān)的多功能二聚病毒蛋白質(zhì)。其是在所有EBV 相關(guān)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的唯一 EBV病毒蛋白，因此是重要的靶向抗原。其在建立和保持細(xì)胞 感染EBV時(shí)采取的變化狀態(tài)中是非常重要的。EBNA1具有甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列，其將 蛋白質(zhì)分成氨基和羧基端結(jié)構(gòu)域。該序列還似乎穩(wěn)定蛋白質(zhì)，防止蛋白酶體分解，以及削弱 抗原處理和MHC I類限制性抗原遞呈。因此，這抑制針對(duì)病毒感染細(xì)胞的⑶8限制性細(xì)胞 毒性T細(xì)胞應(yīng)答。EBNA1轉(zhuǎn)錄區(qū)域起始于潛伏階段I和II期間的Qp啟動(dòng)子。其是第一潛 伏階段期間表達(dá)的唯一病毒蛋白質(zhì)。EBNA1混合肽激活HLA II類限制性細(xì)胞毒性CD4T細(xì) 胞。
[0163] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆蓋抗原BARFl(BamHIA向右閱 讀框1，Uniprot編號(hào)Q777A5)的序列的部分或全部。
[0164] BARF1是221個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其由位于EBV基因組的BamHI-A片段中的BARF 1基因編碼。BARF1在不同EBV相關(guān)類上皮惡性腫瘤中表達(dá)，例如，在NK/T淋巴瘤中和 Burkitt淋巴瘤中。
[0165] 其他可能的EBV抗原包括LP和BHRF1。
[0166] 牛痘病毒的主要病毒體/包膜蛋白被描述于PNAS January 7, 203vol lOOno.1， 第217-222頁（Drexler等）。這些包括A10L(主要核心蛋白p4a)、H3L(肝素結(jié)合蛋白）、 C7L(宿主范圍蛋白2)、D8L(細(xì)胞表面結(jié)合蛋白）、B22R(未知功能）和G5R(未知功能）。
[0167] 水痘帶狀皰疹病毒免疫原包括gE、0RF10、IE61、IE62和IE63。
[0168] 來自上文列舉的具體靶抗原中每一種的肽可被獨(dú)立地用于方法的步驟a)和/或 步驟b)。
[0169] 通常，在步驟a)和步驟b)中為提供T激活第一信號(hào)使用或表達(dá)的表位/抗原/ 肽的一些或全部在兩個(gè)步驟中的通用的。
[0170] 肽可覆蓋靶抗原的部分或全部，例如可重疊，以增加以免疫學(xué)相關(guān)方式遞呈表位 氨基酸的機(jī)會(huì)?？蛇x地或另外地，已知表位的肽可被包括在內(nèi)，并且如需，被過度呈現(xiàn)，也就 是說，可以是更大百分比的遞呈肽。
[0171] HIV 中的抗原包括 gag、pol、env、nef、gpl80、gpl20及類似物。
[0172] 本文所用的"覆蓋抗原序列的部分或全部"意圖指代如下事實(shí)：肽和全長(zhǎng)抗原的相 關(guān)部分之間存在同一性或顯著相似性，例如，肽與抗原的連續(xù)區(qū)域基本上相同。
[0173] 本文所用的被選擇遞呈的表位意圖指代如下事實(shí)：表位的線性序列是已知的并且 被包括在肽混合物中（即，選擇編碼已知表位的肽），或者，例如，其中抗原序列已被繪制表 位，然后肽被設(shè)計(jì)以重疊方式覆蓋序列的部分或全部，從而最大化遞呈一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)表 位的機(jī)會(huì)。當(dāng)然，如需，被應(yīng)用這兩種策略的混合，例如，可在較大程度上呈現(xiàn)肽混合物中的 已知表位。
[0174] 在一個(gè)實(shí)施方式中，混合物中的肽來自一種或多種相關(guān)病毒抗原，例如，一種、兩 種、三種、四種或更多種。
[0175] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物至少包括LMP1和LMP2的序列或至少由LMP1和LMP2 的序列組成。
[0176] 另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，EBNA1和/或BARF1被加入抗原混合物，以減少通過突 變或下調(diào)病毒抗原免疫而逃脫的機(jī)會(huì)。
[0177] 本文所用的肽意圖指代通過肽鍵連接的氨基酸短聚合物，其中肽包含至少2個(gè)， 通常不多于50個(gè)氨基酸。
[0178] 所用肽足夠長(zhǎng)以存在一個(gè)或多個(gè)線性表位，例如，平均7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
[0179] 在一個(gè)實(shí)施方式中，混合物中一些肽重疊（關(guān)于單抗原序列），也就是說，其來自 單個(gè)抗原并且排列，使得來自母體序列的片段部分和某些氨基酸序列存在于混合物的一個(gè) 以上肽片段中。肽重疊意味著氨基酸序列冗余。但是，此方法最大化以適當(dāng)?shù)姆绞竭f呈母 體抗原表位的機(jī)會(huì)，特別是當(dāng)母體抗原的表位繪制信息不可獲得時(shí)。
[0180] 在一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)肽中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基 酸重疊。
[0181] 在一個(gè)實(shí)施方式中，各蛋白質(zhì)庫中的肽為15個(gè)氨基酸長(zhǎng)并且重疊11個(gè)氨基酸，使 得來自蛋白質(zhì)的所有可能的HLA I類表位可被遞呈。肽可更長(zhǎng)，例如20個(gè)氨基酸，重疊15 個(gè)，或30個(gè)氨基酸，重疊25個(gè)。
[0182] 適當(dāng)肽序列的實(shí)例在隨附提交的序列表中包括。
[0183] 在一個(gè)實(shí)施方式中，肽混合物包括2-1000個(gè)肽或由2-1000個(gè)肽組成，更具體地 2-500,例如，2-400、2-300、2-200 或 2-100,如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200 個(gè)或更多肽。
[0184] 步驟a)的肽或步驟a)或b)中用于生成抗原特異性樹突細(xì)胞或用于制備方法步 驟b)的抗原遞呈細(xì)胞的肽被獨(dú)立地基于上述標(biāo)準(zhǔn)選擇。但是，其中所用肽或所用材料如樹 突細(xì)胞和/或抗原遞呈細(xì)胞的一些或全部用相同表位的一些或全部脈沖的方法是最有效 的。在這種情況下，然后步驟b)加強(qiáng)和增加步驟a)生成的應(yīng)答。
[0185]上述肽混合物還可用于生成抗原遞呈T細(xì)胞（T-APCs)，該抗原遞呈T細(xì)胞用于方 法步驟b)的一些實(shí)施方式。為制備抗原遞呈T細(xì)胞，如下文描述其由PBMC生成，并用相關(guān) 肽混合物脈沖，例如以1至l〇〇ng肽/15xl06T-APC添加各肽庫的肽。
[0186] 每個(gè)本文所用的庫可指代針對(duì)每種抗原制成的肽。
[0187] 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原遞呈細(xì)胞是自體的。
[0188] 激活的T細(xì)胞表達(dá)HLA I類和上調(diào)II類抗原以及⑶80和⑶86 (暫時(shí)）。
[0189] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在用肽脈沖以提供特異性T-APC后，輻射后者以確保在其用 于步驟b)時(shí)其不再進(jìn)一步擴(kuò)大。
[0190] 輻射可利用Y輻射源或X射線源進(jìn)行。
[0191] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在第9至14天，用400ml包含IL-15的培養(yǎng)基中的GRex 500 中的5 X 107輻射后的T-APC和5 X 107aK562刺激約5 X 107的步驟a)的響應(yīng)T細(xì)胞上至14 天。
[0192] US 2003/0147869公開了其中描述的aK562細(xì)胞可被改造，使其成為抗原遞呈細(xì) 胞。這些細(xì)胞在理論上可大量表達(dá)。有人可認(rèn)為這些可以用作步驟b)的T-APC的替代。然 而，這些aK562抗原遞呈細(xì)胞不表達(dá)HLA，并且即使其表達(dá)HLA，HLA表型也不匹配效應(yīng)T細(xì) 胞限制圖譜，并且其會(huì)激活異源抗原特異性T細(xì)胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在不存在HLA表達(dá)細(xì)胞 的情況下，相關(guān)靶T細(xì)胞群的激活很弱。雖然理論上這些aK562細(xì)胞可被改造以表達(dá)HLA， 但將需要使其匹配每種情況的患者，因此使該方法不必要地復(fù)雜和昂貴。
[0193] 存在7, 196 HLA等位基因。每個(gè)個(gè)體的這些等位基因可分成6HLA I類和6HLAII 類等位基因（在2染色體上）。其可被混合和以任何方式匹配，因此，將HLA等位基因的適當(dāng) 組合引入aK562細(xì)胞--從而（1)再激活全部可能的T細(xì)胞和（b)不誘導(dǎo)異源反應(yīng)性-- 在此時(shí)將會(huì)是可能的。
[0194] 根據(jù)本發(fā)明的T-APC平均遞呈至少一個(gè)來自靶抗原的表位，并且例如可遞呈2、3、 4、5、6或更多個(gè)表位。
[0195] 在一個(gè)實(shí)施方式中，T-APC遞呈來自一種以上靶抗原的表位，例如，2、3、4或更多 種靶抗原。
[0196] 在一個(gè)實(shí)施方式中，得自步驟a)的細(xì)胞（或CTL)與T-APC的比在4:1至1:2范 圍內(nèi)，例如，1:1。高比例的T-APC使擴(kuò)大效力最大化。通常難以生成如此高比例的樹突細(xì) 胞，這意味著用樹突細(xì)胞擴(kuò)大相關(guān)T細(xì)胞群耗費(fèi)的時(shí)間可長(zhǎng)于用抗原遞呈細(xì)胞擴(kuò)大所耗費(fèi) 的時(shí)間。在一些實(shí)例中--其中樹突細(xì)胞的數(shù)量很低，可根本不發(fā)生擴(kuò)大。因此，在步驟b) 中利用抗原遞呈細(xì)胞的方法可具有優(yōu)勢(shì)，原因在于擴(kuò)大耗費(fèi)的時(shí)間較短，因此提供更有效 過程。
[0197] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，T-APC用于本方法的步驟b)。
[0198] 在本方法中T-APC的應(yīng)用代替現(xiàn)有技術(shù)方法中LCL的應(yīng)用。LCL細(xì)胞系通過感染 活EBV病毒被永生化。在本方法中避免使用LCL具有巨大優(yōu)勢(shì)。
[0199] 通過感染腺病毒載體或脈沖肽改造以遞呈其他病毒抗原的LCL可提供有效第二 刺激，但對(duì)于弱抗原而言，來自載體的腺病毒和EBV蛋白和LCL分別產(chǎn)生強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)，使得最終 CTL產(chǎn)物的主要組分通常對(duì)在LCL中表達(dá)但不在2型潛伏腫瘤（淋巴瘤和NPC)中表達(dá)的腺 病毒或顯性EBV抗原具有特異性。
[0200] 步驟b)中簡(jiǎn)單肽的應(yīng)用看起來不是存活的，因?yàn)榘l(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)是，向來自步驟a) 的CTL遞呈肽混合物僅"擾亂"細(xì)胞，并導(dǎo)致其在其表面上遞呈肽。然后這導(dǎo)致CTL相互成 為靶，并且其開始自己破壞自己。這造成顯然不需要和與實(shí)施方法的目的相悖的細(xì)胞減少。
[0201] 在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟b)進(jìn)行一次以上，例如，2、3、4、5或更多次，直到獲得足 夠數(shù)量的相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞群。
[0202] 足夠數(shù)量可例如是足以持續(xù)體內(nèi)擴(kuò)大和刺激患者對(duì)靶病毒感染和/或靶相關(guān)癌 癥免疫應(yīng)答的細(xì)胞至，如1至90 X 103,1至90 X 104,1至90 X 1