pH控制的酵母繁殖的制作方法
【專利說(shuō)明】pH控制的酵母繁殖 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及酵母的繁殖方法。特別地，本發(fā)明涉及這樣的繁殖方法，其中酵母基于 木質(zhì)纖維素水解物繁殖。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]目前存在這樣的方法，其提出使用木質(zhì)纖維素材料作為燃料生產(chǎn)和基礎(chǔ)化學(xué)品生 產(chǎn)的來(lái)源。它們旨在商業(yè)上可行地從木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)這些產(chǎn)品。
[0004] 在所述方法中，木質(zhì)纖維素材料可例如被預(yù)處理，然后被水解，隨后由此得到的包 含己糖和/或戊糖的水解物可被酵母轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物。這些方法可在大規(guī)模集成生物過(guò)程 設(shè)施（IBF)中發(fā)生。酵母發(fā)酵通常在IBF的發(fā)酵部分中在厭氧條件下進(jìn)行。
[0005] 為了能夠?yàn)榘l(fā)酵供應(yīng)足夠的酵母，使酵母在IBF中繁殖或者在別處繁殖并轉(zhuǎn)移到 IBF中。通常在有氧條件下進(jìn)行繁殖。
[0006] 從德國(guó)專利300662,已知有氧繁殖酵母的方法，其中繁殖開(kāi)始于被強(qiáng)烈稀釋的培 養(yǎng)液中，然后緩慢加入未稀釋的培養(yǎng)液。緩慢加入培養(yǎng)液的過(guò)程部分在本文中被稱為方法 的補(bǔ)料分批階段。包括補(bǔ)料分批階段的整個(gè)方法在本文中被稱為補(bǔ)料分批方法。已知的補(bǔ) 料分批方法的優(yōu)勢(shì)為：避免了形成過(guò)多乙醇，并可使用比稀釋分批方法中更高的培養(yǎng)液濃 度。
[0007]從 Kollaras, A.等人，Ethanol Producer Magazine, 2012 年 8 月，52-54 頁(yè)，存在 已知的基于含木糖的II餾物的酵母（S. cerevisiae)的有氧繁殖，其被描述為："在類(lèi)似于 生長(zhǎng)面包酵母的繁殖器的浸沒(méi)式（submerged)有氧繁殖器中，S.cerevisiae MBG 3248將 乙酸、乳酸、乙醇、甘油、殘留的六碳糖和木糖轉(zhuǎn)化為酵母生物質(zhì)，且表觀產(chǎn)率為〇.35g酵母 /g總可用碳"。這種已知方法的缺點(diǎn)為：由于富含木糖的釜餾物被用于形成生物質(zhì)，所以產(chǎn) 生過(guò)量酵母（129, 000噸飼料酵母）。在飼料酵母中被轉(zhuǎn)化的木糖可被更好地用于在IBF中 生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物。所有目前已知的基于酸性木質(zhì)纖維素水解物的繁殖方法的缺點(diǎn)為：酵母生 長(zhǎng)被乙酸和/或糖降解產(chǎn)物抑制。盡管如此，這種水解物可存在并可從IBF獲得，且比常規(guī) 的繁殖碳源便宜，因此其將成為期望的碳源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供這樣的繁殖方法，其中木質(zhì)纖維素水解物可被用作碳源。另 一個(gè)目的是提供這樣的繁殖方法，其可以以穩(wěn)定方式被操作。另一個(gè)目的是提供這樣的繁 殖方法，其可以在多重循環(huán)中被執(zhí)行，其中部分繁殖混合物被用于下一輪繁殖。另一個(gè)目的 是提供這樣的繁殖方法，其避免過(guò)量生產(chǎn)酵母。根據(jù)本發(fā)明達(dá)到這些目的中的一個(gè)或多個(gè)。 [0009] 根據(jù)本發(fā)明，提供有氧繁殖酵母的方法，其中酵母在反應(yīng)器中生長(zhǎng)，所述方法包括 下述步驟：
[0010] a)用碳源和初始酵母菌群填充所述反應(yīng)器，
[0011] b)任選地使所述反應(yīng)器中的所述初始酵母菌群以分批模式生長(zhǎng)，
[0012] c)測(cè)量所述反應(yīng)器中的pH，
[0013] d)繁殖，同時(shí)以一定速率以補(bǔ)料分批模式向所述反應(yīng)器中加入木質(zhì)纖維素水解物 以將所述反應(yīng)器中的pH設(shè)定為預(yù)定值，和
[0014] e)充分繁殖后，從所述反應(yīng)器中分離酵母。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，獲得了可使用木質(zhì)纖維素水解物作為碳源的繁殖方法，其可以以穩(wěn) 定方式、在多重循環(huán)中被操作并避免過(guò)量生產(chǎn)酵母。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的繁殖的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是：使酵母在基于水解物的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)中的 繁殖期間以這樣的方式適應(yīng)，使得與未根據(jù)本發(fā)明基于水解物繁殖的酵母相比，其在木質(zhì) 纖維素水解物的乙醇發(fā)酵方面的性能增強(qiáng)。
[0017] 本發(fā)明還提供：
[0018] -根據(jù)上述繁殖方法生產(chǎn)的酵母，和
[0019] -生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其使用根據(jù)上述繁殖方法的酵母，特別地其中所述發(fā)酵產(chǎn) 物是乙醇。 附圖簡(jiǎn)介
[0020] 圖1 :酵母繁殖期間根據(jù)時(shí)間（h)的糖消耗和乙醇產(chǎn)量。實(shí)心正方形是糖濃度的 測(cè)量值（g/1)。空心圓形是乙醇濃度（g/L)。參見(jiàn)圖例。
[0021] 圖2 :根據(jù)時(shí)間（h)的生物質(zhì)形成和抑制劑濃度。三角形表示抑制劑濃度（g/1); 用實(shí)線代表乙酸濃度?？招膱A形加實(shí)線表示由0D700計(jì)算出的生物質(zhì)（酵母）濃度（作為 干物質(zhì)）（g/1)。甘油濃度被表示為空心圓形加中斷線。參見(jiàn)圖例。
[0022] 圖3 :根據(jù)時(shí)間（h)的繁殖器參數(shù)。氧濃度（p02(% ))_? _，pH-，溫度（°C )_。 參見(jiàn)圖例。
[0023] 圖4 :酵母生長(zhǎng)。根據(jù)時(shí)間（h)展示（以質(zhì)量（X)計(jì)）。曲線的直線部分表示指數(shù) 生長(zhǎng)。參見(jiàn)圖例。
[0024] 發(fā)明詳沐
[0025] 貫穿本說(shuō)明書(shū)和隨同的權(quán)利要求，詞語(yǔ)"包含"、"包括"及其變體應(yīng)被包含地解釋。 換言之，當(dāng)語(yǔ)境允許時(shí)，這些詞語(yǔ)旨在表達(dá)可能包含未明確列舉的其它元素或整體。
[0026] 本文中的反應(yīng)器、繁殖器或發(fā)酵器可被用于指其中可發(fā)生繁殖的反應(yīng)器。本文中 的繁殖是有氧發(fā)酵，其目的是增加酵母菌群。本文中的乙醇發(fā)酵涉及目的是產(chǎn)生乙醇的發(fā) 酵且通常在厭氧條件下進(jìn)行。本文中乙醇發(fā)酵發(fā)生于其中的反應(yīng)器是乙醇發(fā)酵器或乙醇反 應(yīng)器。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，有氧繁殖酵母（其中酵母生長(zhǎng)于反應(yīng)器中）包括下述步驟：
[0028] a)用碳源和初始酵母菌群填充所述反應(yīng)器，
[0029] b)任選地使所述反應(yīng)器中的所述初始酵母菌群以分批模式生長(zhǎng)，
[0030] C)測(cè)量所述反應(yīng)器中的pH，
[0031] d)繁殖，同時(shí)以一定速率以補(bǔ)料分批模式向所述反應(yīng)器中加入木質(zhì)纖維素水解物 以將pH保持為預(yù)定值，和
[0032] e)充分繁殖后，從所述反應(yīng)器中分離酵母。
[0033] 在這種方法中，步驟a)、b)和e)可以常規(guī)方式進(jìn)行，但這些步驟中的一些參數(shù)可 不同于特定的已知常規(guī)方法中的參數(shù)，如下文中更詳細(xì)所述。在步驟a)中，可使用任何合 適的碳源。在一種實(shí)施方式中，在步驟a)中，碳源是稀釋的木質(zhì)纖維素水解物，更具體地， 在水中稀釋至2倍或更多倍的木質(zhì)纖維素水解物。
[0034]在步驟c)中，可利用任何常規(guī)的pH測(cè)量?jī)x器測(cè)量繁殖反應(yīng)器（本文中也被稱為 繁殖器）中的PH，例如工業(yè)上使用的pH探針或工業(yè)上使用的pH控制器。pH值被用來(lái)引發(fā) 木質(zhì)纖維素水解物的供給的啟動(dòng)，即繁殖的補(bǔ)料分批階段的啟動(dòng)。在步驟c)中，來(lái)自pH探 針或控制器的信號(hào)可被用于打開(kāi)與木質(zhì)纖維素水解物的供給線相連的計(jì)量閥。
[0035] 在步驟d)補(bǔ)料分批階段中，以將pH設(shè)定為在預(yù)定值下的反應(yīng)器中的pH的方式， 使用pH探針信號(hào)或pH控制器信號(hào)來(lái)提供通過(guò)計(jì)量閥進(jìn)入反應(yīng)器的木質(zhì)纖維素水解物的受 控制的供給速率。預(yù)定值可以是單一 pH值或者可隨時(shí)間變化（如果pH曲線被設(shè)定）。在 一種實(shí)施方式中，pH預(yù)定值基本上恒定。在這種實(shí)施方式中，補(bǔ)料分批階段繁殖器中的pH 為pH從4到10或pH從4到7。在一種實(shí)施方式中，以使繁殖器中的混合物的pH保持高于 被注入所述繁殖器中的木質(zhì)纖維素水解物的pH的速率供給木質(zhì)纖維素水解物。
[0036] 木質(zhì)纖維素水解物可以是酸性的。在一種實(shí)施方式中，木質(zhì)纖維素水解物包含有 機(jī)酸。可存在于木質(zhì)纖維素水解物中的有機(jī)酸的實(shí)例是乙酸和甲酸。在一種實(shí)施方式中， 有機(jī)酸是乙酸。酸性木質(zhì)纖維素水解物是來(lái)自其中使用酸的預(yù)處理的常見(jiàn)產(chǎn)物，其導(dǎo)致形 成乙酸。
[0037] 因此，在步驟d)中，在補(bǔ)料分批繁殖期間，以pH受控制的速率向繁殖器中的酵母 供給碳源和任選地其它成分（如磷酸、氨和礦物質(zhì)）。該速率被設(shè)計(jì)成向酵母供給剛好足夠 的糖和營(yíng)養(yǎng)物以最大化增殖且同時(shí)剛好足夠低以阻止乙醇的生產(chǎn)，并且來(lái)自進(jìn)料的所有或 大部分乙酸和/或其它酸性抑制劑被消耗。
[0038] 在一種實(shí)施方式中，酵母消耗木質(zhì)纖維素水解物中的木糖，優(yōu)選地基本上所有木 糖。
[0039] 在一種實(shí)施方式中，方法中不需要向反應(yīng)器中的混合物中加入堿。在一種實(shí)施方 式中，繁殖期間的乙酸濃度（g/L)為0.5g/L或更低，優(yōu)選地0.2g/L或更低。
[0040] 在一種實(shí)施方式中，進(jìn)行繁殖直至實(shí)現(xiàn)酵母菌群至少生長(zhǎng)5代。在一種實(shí)施方式 中，進(jìn)行繁殖直至相較于初始酵母菌群，酵母菌群生長(zhǎng)5-6代。在一種實(shí)施方式中，進(jìn)行繁 殖的分批階段直至酵母菌群生長(zhǎng)2代且進(jìn)行繁殖的補(bǔ)料分批階段直至酵母菌群生長(zhǎng)3代或 更多代。本文中生長(zhǎng)的代表示以重量（g)計(jì)的酵母生物質(zhì)的加倍。
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